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문제 정의
- 백작약 추출물의 항산화 효과를 측정하기 위해 먼저 free radical 소거능을 DPPH assay를 통해서 확인하였다. 대표적 항산화제인 BHT와 백작약 추출물의 DPPH 소거능을 비교하여 항산화 효과를 검증하고자 하였다. 그 결과 백작약 추출물의 모든 농도에서 높은 radical 소거 활성을 관찰 할 수 있었다.
- . 따라서 본 연구에서는 부인과 처방에 다용되는 백작약의 에탄올 추출물에 대한 항산화 효과에 대해서 알아보고 부인과 및 산과 분야에 대한 임상적용 가능성의 이론적 근거를 찾고자 하였다. 그 결과 백작약은 기존의 인공합성 항산화제보다 안전하고 뛰어난 효능을 가지는 항산화제로서 이용될 가치가 있으며, 단독 혹은 다른 약물과 함께 각종 한방부인과학 영역의 질환에 활용할 수 있을 것으로 사료되었다.
- 본 연구에서는 천연물인 백작약의 에탄올추출물을 생체 조직의 기원세포가 될 수 있는 fibroblast cell에 직접 투여하여 항산화 활성을 규명하고 이후 난임을 중심으로 한 부인과 및 산과 분야 임상 적용 가능성의 이론적 근거를 확보하고자 하였다. 이에 mouse embryonic fibroblast cells(MEF cells)를 이용하여 일련의 연구를 진행하였으며, 그 결과를 이 논문을 통해 보고하고자 한다.
- 본 연구에서는 천연물인 백작약의 에탄올추출물을 생체 조직의 기원세포가 될 수 있는 fibroblast cell에 직접 투여하여 항산화 활성을 규명하고 이후 난임을 중심으로 한 부인과 및 산과 분야 임상 적용 가능성의 이론적 근거를 확보하고자 하였다. 이에 mouse embryonic fibroblast cells(MEF cells)를 이용하여 일련의 연구를 진행하였으며, 그 결과를 이 논문을 통해 보고하고자 한다.
제안 방법
- Annexin Ⅴ-FITC/PI(propidium iodide) apoptosis detection kit을 이용하여 apoptotic cell에서 phosphatidylserine의 외(surface exposure)을 검출함으로써 세포 자멸사를 정량화하였다. 대조군 및 실험군 세포를 100 mm 배양접시에 분주한 다음 24시간 동안 배양하고, 유착 세포와 부유 세포를 결합시켜 제조사의 지침에 따라 처리하고 FITC/PI 염색 후 유식세포 측정기를 사용하여 측정하였다.
- Cell cycle에 백작약 추출물과 산화적 스트레스가 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여 cell cycle analysis를 수행하였다. 백작약 추출물만 처리하였을 때, cell cycle에 큰 영향을 미치지 않았지만, H2O2 처리 시에는 G0/G1기의 cell cycle pattern에 큰 변화가 관찰되었다.
- DAKO® Fluorescent mounting medium을 각 칸마다 한 방울씩 떨어뜨리고 cover glass로 덮은 후 형광현미경으로 세포핵을 관찰하였다.
- H2O2 농도(200, 400, 600, 800 μM)에 따른 MEF cells 활성도를 측정하여 농도 의존적으로 세포활성도가 감소하는 것을 확인한 후, H2O2의 4가지 농도(200, 400, 600, 800 μM)에 의해 산화적 스트레스를 받은 세포에 백작약 추출물을 처리 하였을 경우 세포 활성도에 미치는 영향을 확인하기 위해 H2O2 4가지 농도와 백작약 추출물 5 mg/mL을 동시처리 하였다.
- H2O2 및 백작약 추출물 처리가 MEF cells의 각 세포 주기에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위해 cell cycle analysis 를 수행하였다. 백작약 추출물 처리군은 대조군과 비슷한 세포주기를 보였고, 이를 통해 백작약 추출물이 MEF cells의 세포주기에 영향을 미치지 않는 것을 알 수 있다.
- Annexin Ⅴ-FITC/PI(propidium iodide) apoptosis detection kit을 이용하여 apoptotic cell에서 phosphatidylserine의 외(surface exposure)을 검출함으로써 세포 자멸사를 정량화하였다. 대조군 및 실험군 세포를 100 mm 배양접시에 분주한 다음 24시간 동안 배양하고, 유착 세포와 부유 세포를 결합시켜 제조사의 지침에 따라 처리하고 FITC/PI 염색 후 유식세포 측정기를 사용하여 측정하였다.
- 백작약 추출물의 안전성을 확인하기 위해 MEF cells에 백작약 추출물을 1, 2, 3, 4, 5 mg/mL로 제조하여 처리한 후, MTT assay를 이용하여 세포 활성도를 측정하였다. 그 결과 낮은 농도에서는 세포 생존율이 감소하였지만 농도가 높아질수록 농도 의존적으로 세포 생존율이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
- 백작약 추출물의 항산화 효과를 측정하기 위해 먼저 free radical 소거능을 DPPH assay를 통해서 확인하였다. 대표적 항산화제인 BHT와 백작약 추출물의 DPPH 소거능을 비교하여 항산화 효과를 검증하고자 하였다.
- 백작약이 MEF cells의 생존율, 세포 내핵의 변화, 세포 주기의 변화, apoptosis의 발생률에 미치는 영향을 규명하는 일련의 실험을 통해 다음과 같은 결과를 얻었다.
- 이에 본 연구에서는 사전 실험을 통해 주요 부인과 활용 처방의 구성약물들의 항산화활성과 관련된 선별 조사를 마친 다음 그 유효성이 뛰어난 백작약을 선정하여 MEF cells를 사용하여 추출물의 항산화효과를 검증하였다.
- 1 mM EDTA, 50 μg/mL RNase A 그리고 50 μg/mL propidium iodide)를 첨가하여 반응시켰다. 형광은 FAC scan laser 유속세포측정기를 사용하여 측정하고, Becton Dickinson software(Lysis Ⅱ, Cellfit)를 사용하여 분석하였다.
대상 데이터
- [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyltetrazolium bromide] (MTT), 4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), dimethylsulfoxide(DMSO) 및 모든 화학 약품은 Sigma(USA)에서 구입하였다.
- 본 실험에 사용한 백작약(Paeonia japonica)은 옴니허브(서울, 한국)를 통하여 구입하여 정선하여 사용하였다. [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyltetrazolium bromide] (MTT), 4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), dimethylsulfoxide(DMSO) 및 모든 화학 약품은 Sigma(USA)에서 구입하였다.
- 실험에 사용된 세포주는 쥐 배아 섬유아세포(Mouse embryonic fibroblast cells ; MEF cells)로 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection, USA)에서 분양 받았다. MEF cells는 10% FBS와 1×penicillin/streptomycin이 함유된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)(PAA, Austria)에서 배양하였다.
데이터처리
- 실험 결과는 Mean±SEM 값으로 나타내었으며, 본 실험에서 얻은 결과를 one-way ANOVA Tukey's test(GraphPad Prism)로 분석하여 p값을 구하였다.
이론/모형
- H2O2와 백작약 추출물의 처리가 MEF 세포의 형태에 어떠한 영향을 미치는지 관찰하기 위하여 DAPI 염색법을 수행하였다. 백작약 추출물 처리군에서는 대조군과 유사한 형태를 보인 반면, H2O2 처리군에서는 대조군에 비해 DNA 손상과 세포질 응축이 일어난 것을 확인할 수 있다.
- 세포 활성도는 MTT 분석법으로 측정하였다. 배양한 MEF cells를 4.
성능/효과
- 1. 백작약의 free radical 소거능을 DPPH assay를 통해 관찰한 결과 모든 농도에서 높은 radical 소거능을 갖는 것을 확인할 수 있었다.
- 2. MTT assay를 통한 산화적 손상 방어 능력 확인 실험을 통해 농도가 증가함에 따라 항산화 능력이 증가함을 관찰할 수 있었다. 특히 H2O2의 처리 농도와 상관없이 모든 농도에서 높은 세포 보호 효과를 보였다.
- 3. DAPI staining을 통해 백작약이 산화적 손상으로부터 MEF cells 내핵을 보호하는 효과가 있음을 관찰하였다.
- 3. DPPH assay를 통한 백작약의 항산화효과 측정 DPPH 소거 활성능의 분석을 통하여 대조군으로 사용한 BHT와 백작약을 다양한 농도로 처리하여 비교한 결과, 백작약은 모든 농도에서 높은 라디칼 소거 활성을 보였다(Fig. 4).
- 4. 세포주기분석에서 백작약은 산화적 손상을 받은 MEF cells의 G0/G1기의 cell cycle pattern을 정상수준으로 회복시키는 것을 확인하였다.
- 5. Annexin Ⅴ-FITC/PI assay에서 백작약이 산화적 손상을 받은 MEF cells에 대한 apoptosis 발생률을 감소시키는 것을 관찰할 수 있었다.
- H2O2 농도에 따른 MEF cells 활성도를 측정하여 농도 의존적으로 세포활성도가 감소하는 것을 확인한 후, 500 μM 농도로 H2O2를 처리하고 다양한 농도의 백작약 추출물을 처리한 결과, H2O2 500μM만 처리한 대조군의 세포 생존율은 30% 수준으로 떨어졌으며, 백작약 추출물과 H2O2를 동시에 처리하였을 때, 백작약 추출물의 농도가 증가할수록 농도 의존적으로 세포의 생존율이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
- 또한 sub-G1기의 cell 양이 많아진 것을 통해 apoptotic cell 수가증가 한 것을 볼 수 있다. H2O2와 백작약 추출물을 동시 처리한 군은 대조군과 비슷하게 cell cycle을 복구시킨 것을 확인 할 수 있으며 sub-G1기가 감소한 것을 통해 apoptotic cell 수가 H2O2 단독처리군보다 감소한 것을 알 수 있다. 이를 통해 백작약 추출물이 H2O2에 의한 산화적 스트레스를 세포주기 상에서 어느 정도 복구시키는 효과를 확인하였다(Fig.
- 4가지 농도와 백작약 추출물 5 mg/mL을 동시처리 하였다. 그 결과 H2O2만을 처리한 실험보다 H2O2와 백작약 추출물을 동시 처리한 실험에서의 세포 생존율이 눈에 띄게 높아진 것을 볼 수 있다. 특히, H2O2의 농도와 상관없이 세포 생존율을 약 80% 이상으로 보호하는 것을 통해 백작약 추출물의 뛰어난 항산화 효과를 확인 할 수 있다(Fig.
- 백작약 추출물의 안전성을 확인하기 위해 MEF cells에 백작약 추출물을 1, 2, 3, 4, 5 mg/mL로 제조하여 처리한 후, MTT assay를 이용하여 세포 활성도를 측정하였다. 그 결과 낮은 농도에서는 세포 생존율이 감소하였지만 농도가 높아질수록 농도 의존적으로 세포 생존율이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 백작약 추출물의 농도가 높아질수록 세포를 보호하는 효과가 있고, 그 중에서도 5 mg/mL의 농도에서 가장 높은 세포 생존율을 나타내었다(Fig.
- 대표적 항산화제인 BHT와 백작약 추출물의 DPPH 소거능을 비교하여 항산화 효과를 검증하고자 하였다. 그 결과 백작약 추출물의 모든 농도에서 높은 radical 소거 활성을 관찰 할 수 있었다.
- 백작약 추출물과 H2O2 복합 처리 시에는 cell cycle이 정상 수준으로 회복되는 것을 볼 수 있었다. 또한 백작약 추출물을 H2O2와 복합처리 해 줌으로써 산화적 스트레스로 인해 apoptosis가 일어난 cell을 감소시키는 결과를 확인하였다.
- 처리군에서는 apoptosis를 일으킨 세포가 많이 늘어난 것을 확인 할 수 있다. 백작약 추출물과 H2O2동시 처리하였을 때, H2O2 처리군보다 apoptosis가 확연하게 줄어든 것을 확인 할 수 있다.
- 백작약 추출물과 H2O2의 apoptosis를 알아보기 위해 FITC/PI double staining을 이용해 apoptosis aassay를 수행한 결과, 대조군과 비교하여 백작약 추출물의 apoptosis cell 수는 별 차이가 없었지만, H2O2 처리군에서는 apoptosis를 일으킨 세포가 많이 늘어난 것을 확인 할 수 있다. 백작약 추출물과 H2O2동시 처리하였을 때, H2O2 처리군보다 apoptosis가 확연하게 줄어든 것을 확인 할 수 있다.
- 백작약 추출물을 산화적 스트레스를 인위적으로 유발시키는 H2O2와 복합처리 시, 백작약 추출물의 농도가 증가할 수록 농도 의존적으로 산화적 스트레스로부터 MEF cells를 보호하였고, 특히 5 mg/mL의 농도에서는 세포 생존율이 약 130%에 다다르는 것을 볼 수 있다. 이에 H2O2 농도별 백작약 추출물의 antioxidant effect를 알아보기 위해 앞선 결과에서 cell viability가 가장 높게 나타난 5 mg/mL를 H2O2의 여러 농도별로 복합 처리하였더니, 그 결과 H2O2 농도와 상관없이 백작약 추출물이 H2O2에 의해 유발된 산화적 스트레스로부터의 손상을 일정 수준 이상으로 복구시켜주는 것을 확인 할 수 있었다.
- 백작약 추출물의 정상세포에 대한 독성을 알아보기 위해 다양한 농도의 백작약 추출물(1, 2, 3, 4, 5 mg/mL)을 MEF cells에 처리한 결과, 저농도에서는 세포 생존율이 감소하였지만 농도가 증가할수록 농도 의존적으로 세포 생존율이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 특히 5 mg/mL에서는 대조군보다 오히려 세포 생존율이 증가함을 보여주어 세포를 보호하는 효과가 있음을 알 수 있었다.
- 이러한 연구 결과를 참조할 때 생식내분비계통에 활용하는 한약 중에서 항산화활성을 가진 약물을 찾아낸다면 난소 노화 과정에 작용하는 ROS로 유발되는 손상을 막아 생식세포의 노화를 억제함으로써 난임의 예방과 치료에 유효한 치료를 발견할 수 있을 것으로 생각하였다.
- H2O2와 백작약 추출물을 동시 처리한 군은 대조군과 비슷하게 cell cycle을 복구시킨 것을 확인 할 수 있으며 sub-G1기가 감소한 것을 통해 apoptotic cell 수가 H2O2 단독처리군보다 감소한 것을 알 수 있다. 이를 통해 백작약 추출물이 H2O2에 의한 산화적 스트레스를 세포주기 상에서 어느 정도 복구시키는 효과를 확인하였다(Fig. 5).
- 와 복합처리 시, 백작약 추출물의 농도가 증가할 수록 농도 의존적으로 산화적 스트레스로부터 MEF cells를 보호하였고, 특히 5 mg/mL의 농도에서는 세포 생존율이 약 130%에 다다르는 것을 볼 수 있다. 이에 H2O2 농도별 백작약 추출물의 antioxidant effect를 알아보기 위해 앞선 결과에서 cell viability가 가장 높게 나타난 5 mg/mL를 H2O2의 여러 농도별로 복합 처리하였더니, 그 결과 H2O2 농도와 상관없이 백작약 추출물이 H2O2에 의해 유발된 산화적 스트레스로부터의 손상을 일정 수준 이상으로 복구시켜주는 것을 확인 할 수 있었다.
- 그 결과 낮은 농도에서는 세포 생존율이 감소하였지만 농도가 높아질수록 농도 의존적으로 세포 생존율이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 백작약 추출물의 농도가 높아질수록 세포를 보호하는 효과가 있고, 그 중에서도 5 mg/mL의 농도에서 가장 높은 세포 생존율을 나타내었다(Fig. 1).
- 백작약 추출물의 정상세포에 대한 독성을 알아보기 위해 다양한 농도의 백작약 추출물(1, 2, 3, 4, 5 mg/mL)을 MEF cells에 처리한 결과, 저농도에서는 세포 생존율이 감소하였지만 농도가 증가할수록 농도 의존적으로 세포 생존율이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 특히 5 mg/mL에서는 대조군보다 오히려 세포 생존율이 증가함을 보여주어 세포를 보호하는 효과가 있음을 알 수 있었다.
- 를 동시에 처리하였을 때, 백작약 추출물의 농도가 증가할수록 농도 의존적으로 세포의 생존율이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 특히 5 mg/mL의 농도에서 세포 생존율이 약 130%에 이르는 것을 통해 백작약 추출물의 높은 항산화력을 확인할 수 있었다(Fig. 2).
- MTT assay를 통한 산화적 손상 방어 능력 확인 실험을 통해 농도가 증가함에 따라 항산화 능력이 증가함을 관찰할 수 있었다. 특히 H2O2의 처리 농도와 상관없이 모든 농도에서 높은 세포 보호 효과를 보였다.
- 그 결과 H2O2만을 처리한 실험보다 H2O2와 백작약 추출물을 동시 처리한 실험에서의 세포 생존율이 눈에 띄게 높아진 것을 볼 수 있다. 특히, H2O2의 농도와 상관없이 세포 생존율을 약 80% 이상으로 보호하는 것을 통해 백작약 추출물의 뛰어난 항산화 효과를 확인 할 수 있다(Fig. 3).
후속연구
- 따라서 본 연구에서는 부인과 처방에 다용되는 백작약의 에탄올 추출물에 대한 항산화 효과에 대해서 알아보고 부인과 및 산과 분야에 대한 임상적용 가능성의 이론적 근거를 찾고자 하였다. 그 결과 백작약은 기존의 인공합성 항산화제보다 안전하고 뛰어난 효능을 가지는 항산화제로서 이용될 가치가 있으며, 단독 혹은 다른 약물과 함께 각종 한방부인과학 영역의 질환에 활용할 수 있을 것으로 사료되었다.
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