선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 본 연구는 가축 중 송아지 에 대한 probiotics 미생물을 이 용하기 위한 연구로서 사료 첨가용 생균제를 개발하기 위해 내담즙성과 내산성을 갖고 병원성 세균을 저해하는 유산균 을 분리 동정하는데 있다.
제안 방법
- 내담즙성을 분석하기 위해 분리한 유산균 균주" cells/mL)을 MRS broth와 MRS broth+0.3% bile salt(Sigma, USA) 에 접종하여 3 7 ℃ 에서 8시간 배양한 다음 Spectrophotome- ter(Ultrospec 2000, Pharmacia Biotech, Sweden)을 이용하여625nm에서 흡광도를 측정한 후 다음 식에 의해 내담즙성 을 나타내기 위한 생존율(%)을 계산하였다(Mustapha et al.,1997).
- MRS 평판배지에서 각각 분리된 유산균을 증층한 후 항 생제 paper disc를 사용하여 각 균주의 항생제 감수성을측정 하였다. Paper disc(BBL™ Sensi-Disc™, BD Bio sciences, USA)에 들어있는 항생제 사용량은 gentamycin 10ug, colistin 10 μg, neomycin 30 μg, ampicillin 10 μg, streptomycin 10 μg, amoxicillin 20 μg, ciprofloxacin 5 μg.
- 강원도 일대 농가에서 사육하는 한우와 홀스타인의 분변 으로부터 유산균을 분리 하였다. 유산균 배 양 배지로는 MRSbroth와 agar(Difco, USA) 를 사용하였고 배 양조건은 37℃ 에 서 48시간 호기적으로 배양하였다.
- 국내 축산 농가에서 항생제를 사료에 사용하고 있으므로 각 분리된 균주에 대해 항생제 감수성에 대한 조사를 실시하였다(Table 2). 분리된 10균주 모두 colistin과 ciprofloxacin0]] 대해 저항성을 보인 반면 ampicillin, amoxicllin 및 erythro- mycin에 대해서는 10균주 모두 감수성을 보여주었다.
- 8%로 가장 높은 생존율을 나타내었다. 내담즙성에서 선발된 균주를 0.05M sodium phosphate(pH 2.5)인 인공위산(37℃로 2시간 진탕배 양 후)에 대한 생존율을 대한 조사하였다(Fig. 2). 그 결과를 보면 LSI5 균주가 82.
- 내산성을 분석하기 위해 내담즙성 검사에서 선발된 분리균주(# cell/mL)을 인공위산인 HC1 로 조정된 0.05M sodium phosphate(pH 2.5)에 접종한 후 37#에서 2시간 진탕 배양한 다음 MRS 평판 배지에 도말한 후 한 후 48시간 배양한 후 다음 식에 의해 내산성을 나타내기 위한 생존율(%)을 계산하였다(Lee et al., 2002).
- 선발된 유산균은 Lactobacilli API 50 CHL kit(BioMerieux)를 사용하여 동정하였다. 분리균주를 MRS 평판배지에서 3 70에서 24시간 증식시킨 후 집락을 생리염수에 분산시킨 균 액 kit에 접종시킨 다음 37℃에서 48시간 배양 후 그 결과를Apilab Plus v.3.3.3 (BioMerieux)에 입력하여 동정하였다.
-
유산균 분리
분변을 0.1% peptone 수로 희석하여 MRS broth+0.5% bile salt에서 37 ℃ 에서 24시간 배양한 후 0.02% NaNa가 함유된 MRS에서 자란 균주를 다시 MRS broth (pH 4.5)에 접종하여 37℃에서 24시간 배양한 후 0.02% NaN3가 함유된 MRS에서배양하여 내담즙성과 내산성을 갖은 균주를 분리한 다음LAPT agar(l% yeast extract, 1.5% peptone, 1% tryptone, 0.5% lactose, 0.1% Tween 80, 1.5% agar)에 도말한 후 37℃에서 48시간 배양한 다음 분리된 유산 간균을 동정에 사용하였다.
- 선발된 10균주를 탄소원의 이용성 차이로 동정하는 생화 학적 방법인 API 50CHL kit로 동정하였다. 그 결과 10균주 모두 Lactobacillus spp.
- 선발된 유산균은 Lactobacilli API 50 CHL kit(BioMerieux)를 사용하여 동정하였다. 분리균주를 MRS 평판배지에서 3 70에서 24시간 증식시킨 후 집락을 생리염수에 분산시킨 균 액 kit에 접종시킨 다음 37℃에서 48시간 배양 후 그 결과를Apilab Plus v.
- 한우와 홀스타인 농가로부터 수집한 분변에서 무작위 선 발법으로 MRS 평판배지와 LAPT 한천배지 상에서 자라는 간균형태의 54균주를 1차로 선발하였다. Kim(1999)에 의하 면 Enterococcus faecium은 소의 사료효율과 생시 체중 개선 에 이 용되 며 Enterococcus faecalis는 소의 항생 물질 치 료에 다른 장내 균총의 안전성과 생시체중 개선 효과가 있는 것으로 보고하고 있으나, Hardie(1986)에 의하면 장구균인 Ent.
- 한우와 홀스타인의 분변으로부터 MRS 배지와 LAPT 배 지를 이용하여 무작위 선발법으로 54균주의 유산균을 1차로 분리하였다. 1차로 분리된 54균주에 대해 내담즙성이 우수한 10균주를 분리한 다음 내산성을 조사한 결과 인공위액 pH 2.
대상 데이터
- 유산균 배 양 배지로는 MRSbroth와 agar(Difco, USA) 를 사용하였고 배 양조건은 37℃ 에 서 48시간 호기적으로 배양하였다. Salmonella typhimurium KCTC 2514와 Staphylococcus aureus KCTC 1928은 TSA(Difco, USA) 배지를 사용하였고 배양조건은 37℃에서 24시 간 배양하였다. Clostridium perfringens ATCC 12917는 Rein- fbred Clostridial Agar(l% beef extract, 1% pancreatic digested of casein, 0.
이론/모형
- , 2002)를사용하여 측정하였다. 내담즙성과 내산성 검사에서 선발 된 유산균 배양액의 pH을 7.0으로 조정한 후 병원성 균인Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus 및 Clostri dium perfringens 균이 중층된 agar plate 상에 멸균된 Penicy- linder(용량 300 ID 6mm, OD 8mm, H lOmrn)를 일정간격으로 놓은 후 상등액을 200#를 분주하여 저해환의 크기 를 비교하는 agar diffusion method를 사용하였다.
- 항균력의 측정은 agar diffusion method(Lee et al., 2002)를사용하여 측정하였다. 내담즙성과 내산성 검사에서 선발 된 유산균 배양액의 pH을 7.
성능/효과
- /#에 대해 우수한 항균력 을 나타내었고, L12 균주은 그람 양성균인 Staph, aureus 및 CL /#에 대해서만 항균력을 나타내었다. 3개의 병원 성 균에 대해 가장 우수한 항균력을 나타낸 LL6와 LL7 균주는 97.9% Lactobacillus acidophilus로 동정되었고, 우수 한 항균력을 나타낸 LS3 균주는 99.9% Lactobacillus pkmWw??으로 동정되었다. 특히, LSI, LS2 및 LM1 균주은 각각 96.
- Lee 등 (2002)은 토종닭에서 분리한 유산간균인 6균주 모두 cipro- floxacin에 대해 저항성을 보인 결과와 본 실험에서 분리한 유산간균인 10균주 모두 ciprofloxacin이 저항성을 보인 점은 일치하였다. Neomycin에 대해서는 LB1, LL6 및 LL7 균주가 저항성을 나타내었으며, streptomycin에 대해서는 LSI, LS 15 및 LM1 균주에 대해서 감수성을 보였다. 특히 L12, LB1,LB2, LL6 및 LL7 균주는 gentamycin에 대해 저항성을 나타 내었다.
- typhimurium, Sta. aureus 및 Cl. perfringens 의 병원균에 대해 가장 큰 항균력을 보인 균주는 LL6와 LL7이었다API CHL kit로 동정한 결과 LSI, LS2 및 LM1 균주는 모두 L. fermentum, LL6와 LL7 균주는 L. acidophilus, LS3 균주는 L. plcmtarum으로 각각 동정되었고, 나머지 Lactobacillus spp. 로 동정되어 분리된 10 균주 모두 안전성 있는 유산간균임을 확인하였다, 10종류의항생제에 대한 내성을 조사한 결과 ampicillin, amoxicillin과 erythromycin에 대해서는 감수성이 있으나 colistin고} cipro- floxacin에 대해 모두 내성을 나타내었다.
- perfringens 에 대한 항균력을 조사한 결과(Table 1) Sal. thyphimurium대한 저해능력이 우수한 균주는 LL7과 LL6 균주로서 저해 환의 크기는 각각 11.0mm와 10.5mm로 나타났고, Staph. weus에 대한 항균력 능력은 LL6 균주가 11mm로 가장 우 수하며 그 다음으로는 5개 균주 L12, LB1, LB2, LS3 및 LL7이 모두 10mm의 저해환을 보인 것으로 나타났다.
- 5mm로 나타났고, Staph. weus에 대한 항균력 능력은 LL6 균주가 11mm로 가장 우 수하며 그 다음으로는 5개 균주 L12, LB1, LB2, LS3 및 LL7이 모두 10mm의 저해환을 보인 것으로 나타났다. 특히, 혐기성 균인 Cl.
- 선발된 10균주를 탄소원의 이용성 차이로 동정하는 생화 학적 방법인 API 50CHL kit로 동정하였다. 그 결과 10균주 모두 Lactobacillus spp. 에 속하는 유산균으로 동정 되 었고, 광 학현미경상에서 모두 간균으로 관찰되었다.
- 2). 그 결과를 보면 LSI5 균주가 82.6%로 가장 생존율이 높았고 그 다음으 로 LL6 균주는 80.7%의 생존율을 보여주었다. 따라서 내담 즙성과 내산성이 모두 우수한 균주는 LL6 균주임을 알 수 있 었다.
- plantatarum^^. 동정된 균이 2차로 16S rRNA sequence로 동정하는 경우에 99% L. pentows로 동정되어 염기 서열에 따른 계통학적 분류시 동 정 결과가 차이를 보이는 것으로 나타났다.
- 7%의 생존율을 보여주었다. 따라서 내담 즙성과 내산성이 모두 우수한 균주는 LL6 균주임을 알 수 있 었다.
- 3이하의 조건하의 위장관을 통과하고 십이지장에서 분비되는 담즙에 대해서도 내성을 가져야만 소장에 도달하여도 생 존할 수가 있다고 판단되었다. 따라서 담즙에 대한 내성을 조사하기 위해 1차로 선발된 54 균주에 대해 0.3% bile salt가 함유된 MRS broth에서 배양 후 생존율을 조사한 결과(Fig.1) 담즙에 내성이 있는 10균주는 0.3% bile salt에서는 77.6 %~99.8%의 생존율을 보였으며 특히, LL6와 LL7 균주의 경우 0.3% bile salt에서는 각각 99.2%와 99.8%로 가장 높은 생존율을 나타내었다. 내담즙성에서 선발된 균주를 0.
- #에 대해서만 항균력을 나 타낸 것을 볼 수 있었고 나머지 4균주는 Lactobacillus spp으 로 동정되었다. 따라서 분리한 모든 균주는 생균제로서 사용 이 가능한 안전성이 있는 유산균임을 확인하였다. Gilliland 와 Speck (1977)은 L.
- plcmtarum으로 각각 동정되었고, 나머지 Lactobacillus spp. 로 동정되어 분리된 10 균주 모두 안전성 있는 유산간균임을 확인하였다, 10종류의항생제에 대한 내성을 조사한 결과 ampicillin, amoxicillin과 erythromycin에 대해서는 감수성이 있으나 colistin고} cipro- floxacin에 대해 모두 내성을 나타내었다. LB1, LL6 및 LL7 균주는 gentamicin과 neomycin에 대해 내성을 보여 주었다.
- 국내 축산 농가에서 항생제를 사료에 사용하고 있으므로 각 분리된 균주에 대해 항생제 감수성에 대한 조사를 실시하였다(Table 2). 분리된 10균주 모두 colistin과 ciprofloxacin0]] 대해 저항성을 보인 반면 ampicillin, amoxicllin 및 erythro- mycin에 대해서는 10균주 모두 감수성을 보여주었다. Lee 등 (2002)은 토종닭에서 분리한 유산간균인 6균주 모두 cipro- floxacin에 대해 저항성을 보인 결과와 본 실험에서 분리한 유산간균인 10균주 모두 ciprofloxacin이 저항성을 보인 점은 일치하였다.
- 그 결과 10균주 모두 Lactobacillus spp. 에 속하는 유산균으로 동정 되 었고, 광 학현미경상에서 모두 간균으로 관찰되었다.(Table 3) 이 증 동정 결과가 확실치 않은 LB1 과 LB2 균주는, ML typhimu- rium, Staph, aureus 및 Cl.
- weus에 대한 항균력 능력은 LL6 균주가 11mm로 가장 우 수하며 그 다음으로는 5개 균주 L12, LB1, LB2, LS3 및 LL7이 모두 10mm의 저해환을 보인 것으로 나타났다. 특히, 혐기성 균인 Cl. perfringens에 대한 항균력은 LL7 균주가 15mm 로 가장 우수하였으며 그다음으로 LB1, LS3 및 LL6 균주가 14mm의 저해환을 나타내었다. LS15 균주는 병원성 균에 대 해 모두 저해환을 나타내지 않았다.
후속연구
- 소의 분변에서 분리된 유산균 중 LL6인 L. acidophilus 균 주가 내산성, 내담즙성이 크고, 병원균에 대한 항균력이 우 수한 능력을 가진 유산균으로 송아지에서 probiotic 균주로 할용 될 수 있는 가능성이 큰 균주라고 생각된다 새끼 돼지 의 경우#, acidophilus 균주가 돼지의 설사를 막는 작용이 있는 것으로 Kohler와 Bohl(1964) 이 보고하였지만 Fuller (1989)에 의하면 장관 상피세포의 부착성은 같은 종간에도 차이가 있으므로 본 실험에서 분리된 L. aciophilus 균주에 대해 장관에서의 성장률 및 장관 상피세포의 부착성을 조사 하고 한우 송아지 설사에 대해 효과적으로 방어하는 성질을 갖는지에 대한 연구가 더 필요하다고 생각된다.
- , 2000), 1998년 전체 가축 및 수산용 생균제 첨 가물 시장규모는 약 185억 원이며, 1999년도는 약 250억원 으로 추산되고 있다(Kim, 1999). 앞으로 유기축산을 하는 경우 가축질병의 치료 목적으로 사용되는 항생제 사용규제 가 있으리라 예상되므로 항생제를 대체하여 소화기 병원성 세균을 저해할 수 있는 사료첨가용 생균제의 사용이 요구 된다.
- perfringens 균주에 대해 높은 항균력을 보인 것은 Gilliland 와 Speck(1977)의 결과와 일치하는 것으로 볼 수 있다. 유산균이 다른 균의 생육을 억제하는 이유는유산, bacteriocin, hydrogen peroxide 및 다른 유기산이 관여 하는 것(Kim, 1999)으로 생각되므로 특히, 본 실험에서 동정 된 L. acidophilus가 생산하는 bacteriocin에 대해서도 연구할 필요가 있다고 생각된다. Lee 등(2002)에 의하면 API 50 CHL kit로 1차 동정 한 결과 99% L.
- 또한 Salminen 등(1998)과 Saarela 등(2000)에 의하면 항생제 저항 plasmid을 갖는 균주는 사람과 동물의 probiotic 균주로 사용 하기에 적합하지 않는 것으로 보고하였으나 항생제 저항 probiotic 균주는 정상적 인 장내 균총이 여 러 가지 항균제 복 용으로 크게 감소하거나 균형이 깨져있는 환자에게는 유익 할 수 있다고 Salminen 등(1998)이 보고한 것은 매우 의미가 있다. 이런 사실에 비추어 볼 때 본 실험에서 분리된 균주를 사료 첨가용 생균제로 사용 시 각각의 항생제 적용 가능성 여부를 판단할 수 있으리라 생각된다.
- caei-Pediococcus, Leuconostoc)그룹으로 분류할 것을 제시하였다. 이에 비추어 볼 때 발효형식인 API 50 CHL kit로 동정된 LL6인 L. acidophilus 균은 A 그룹에 속하지만 16S rRNA sequence 방법에 의한 계통학적 분류에는 어느 그룹에 속하는지에 대한 연구도 필요하다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.