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문제 정의
- 식물의 기관 분화에는 오옥신과 사이토카이닌의 조합 비율 뿐 만이 아니라 식물체의 극성과 절편 부위에 따라서도 분화능의 차이가 보여진다. 본 연구는 구기자나무의 형질전환에 여러 생 명공학적 방법을 응용하기 위한 기초 자료로서 활용하고자 In VItro에서 구기자의 유식물체로부터 얻어진 잎과 줄기를 절편체 로 하여 이로부터 완전한 식물체를 재생시킬 수 있는 실험체제 의 확립과 절편 부위 그리고 극성에 따른 분화조건을 규명하고 토양으로서 성공적인 순화체계를 확립하고자 실시하였다 .
가설 설정
- A; Soil transfererred plantlets after 2 weeks. B; An acclimitized Lycium chinense in the green house. C; Hower formation of Lyciwn Chinese from regenerated plant.
제안 방법
- lmg/L BA의 배지에 편평하게 치상하였다. 각각의 조직은 10개체씩으로 3회 반복실험을 행하였으며 배양 조건은 위와 동일하게 수행하였다.
- 7로 조정하였고 petri-dish(10X 2cm)에 20mL씩 각각 분주하였다. 발아 후 7일째인 유식물채를 자엽과 배축으로 구 분하고 자엽은 5 X 5mm의 크기로 배축은 5mm의 길이로 절단하여 petriTish당 절편을 각각 5개씩 10개의 petri-dish에 치상하여 6주간 배양하였으며 3회에 걸쳐 뱐복실험을 행하였다.
- 그리고 멸균된 종자를 멸 균수로 5회에 걸쳐 수세하여 sodium hypochlorite용액을 완전히 제거한 수 멸균된 filter-paper 위에 올려놓아 물기를 제거하였다. 발아배지는 1/2 MS(Murashige and Skoog 1962)에 20g/L의 gelrite를 첨가한 다음 petri-dish(10><2cm)에 20mL 씩 분주하였다 표면 살균된 종자는 위에 배지가 첨가된 pet- ri-dish당 10립씩 총 50립을 치상하였다. 종자는 22±1℃, 16/8 시간 광주기, 2500Lux의 광도의 배양실 조건에서 발아를 유도 하였다.
- 배지의 멸균은 1.5기압, 121 ℃에서 15분간 고압고온 멸균하였다 배양실의 조건으로서 온도는 22±rq 조도는 2500LUX, 일장주기는 16/8시간으로 하여 실험을 수행하였다.
- 생장조절제 종류에 따른 shoot 형성을 조사하기 위해 auxin류 로는 2.4-D(2.4-Dichlorophenoxyacetic Acid), IBAQndole-3- Buttyric Acid), NAA(1-Naphtalene Acetic Acid)와 cytokinin류 로 BA(6-Benzylaminopurine)와 Ki (Kinetin)를 사용하여 실험을 수행하였으며 이들을 단독 또는 혼용 처리하였다(Table 1). 위의 호르몬 처리한 배지는 1/2 MS 배지에 30 g/L9 sucrose를 첨가하고 교질재료인 gelrite는 3.
- 5g/L첨가하여 배지를 조성하였다. 위의 배지를 100 mL의 배양병에 30mL 분주하여 부정아 절편을 1개씩 치상하여 발근을 유도하였다. 배양조건은 위와 동일하게 수행하였다.
- 4-Dichlorophenoxyacetic Acid), IBAQndole-3- Buttyric Acid), NAA(1-Naphtalene Acetic Acid)와 cytokinin류 로 BA(6-Benzylaminopurine)와 Ki (Kinetin)를 사용하여 실험을 수행하였으며 이들을 단독 또는 혼용 처리하였다(Table 1). 위의 호르몬 처리한 배지는 1/2 MS 배지에 30 g/L9 sucrose를 첨가하고 교질재료인 gelrite는 3.5g/L를 첨가하여 배지를 조성하였다. 배지의 pH는 5.
- 절편 부위와 극성에 따른 분화 상태를 규명하기 위하여 먼저 발 아하여 7일째의 유식물채를 자엽(1), 배축(2), 뿌리(3)로 분리하여 각각을 절단하지 않은 것, 자엽(4)과 배축(5) 그리고 뿌리(6)를 상 하 두 부분으로 절단한 것, 배축(7)과 자엽(8)의 기부를 20% 제거 한 것, 바축(9)과 자엽(10)의 말단부를 20% 제거한 것, 자엽11)과 배축(12)의 기부와 말단부를 동시에 20% 제거한 것으로 구분(Fig. 1)하여 0.1mg/L IBA + O.lmg/L BA의 배지에 편평하게 치상하였다. 각각의 조직은 10개체씩으로 3회 반복실험을 행하였으며 배양 조건은 위와 동일하게 수행하였다.
- 종자로부터 발아하여 1주일 된 유식물채를 자엽과 바축으로 구 분한 다음 5 × 5mm로 절단하여 생장호르몬이 단독 또는 혼용 처 리된 배지에 치상하여 6주간 배양한 후 절편에 따른 부정아의 형성 률을 조사하였다. 생장호르몬을 첨가하지 않은 배지의 경우는 악간 붉은색을 띠면서 결국에는 고사하였으며(Fig.
- 형성된 shoot로부터 뿌리를 유도하여 완전한 식물체로 재생 시키기 위하여 1/3 MS배지에 sucrose# 20g/L첨가하고 gel- rite는 3.5g/L첨가하여 배지를 조성하였다. 위의 배지를 100 mL의 배양병에 30mL 분주하여 부정아 절편을 1개씩 치상하여 발근을 유도하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 식물재료는 98년도에 청양구기자 시험장에서 청양8호 구기자 종자를 채취하여 멸균된 증류수로 30분간 침 지시킨 다음 70% EtOH에 10초간 표면 살균 후 1% sodium hy- pochlorite용액에 15분간 멸균하였다. 그리고 멸균된 종자를 멸 균수로 5회에 걸쳐 수세하여 sodium hypochlorite용액을 완전히 제거한 수 멸균된 filter-paper 위에 올려놓아 물기를 제거하였다.
- 본 실험에서 배양은 주로 염의 농도를 1/2로 감량한 배지를 사용하였으며 보통 생장조절 물질은 초기, 증식, 신초신장, 발 근 등 배양단계별에 따라 종류와 농도를 달리하기 때문에 (Sadamatsu, 1987), 초기배양은 고농도의 cytokinin류와 저 농도의 auxin류를 주로 사용하고(Choi et al., 1992; Lane and Mcdogald, 1982), 신초신장 및 발근 유도시는 저농도의 cytokinin류와 auxin류가 주로 첨가(Sasahara et al. 1981) 되었는데, 특히 발근시에는 저농도의 auxin류, 혹은 생장조절 물질을 첨가하지 않은 배지를 사용하였다(Kuroi and Sawada, 1985). 이와 같은 생장조절물질의 적응 정도는 배양식물의 종 류에 따라 차이가 나타났으며, 재분화율, 증식정도, 생장능률, 즉 배양효율에서 많은 차이를 나타내었다.
성능/효과
- 0.1mg/L의 IBA를 처리한 배지와 BA를 단독처리한 배지에서 shoot의 형성이 보였으므로 이를 중심으로 생장호르몬의 조합에 의한 캘러스의 형성률과 shoot의 형성XTable 2) 그리고 shoot의 개 체수(Fig. 3)를 조사하였다 IBA와 BA 그리고 NM와 BA를 포함하는 배지는 모든 배지에서 캘러스의 형성이 양호 하였으며 비교적 부 드러운 녹색을 띠는 캘러스들이 형성되었다 2, 4-D를 포함하는 배 지는 단독배지와 마찬가지로 캘러스의 형성은 양호하였으나 부드럽 고 부스러지기 쉬운 모양으로 아loot의 형성이 거의 보이지 않았다. IBA와 BA를 포함하는 모든 배지에서 shoot의 형성률과 발생된 shoot의 개채수가 많았으나 O.
- 1mg/L 처리된 배지에서 아loot의 유도가 보였다. 2.4-D와 NAA가 lmg/L 첨가된 배지는 캘러스가 다량으로 유도되었으나,이 캘러스들은 매우 부드럽고 부스러지기 쉬운 모양.으로 shoot는 전혀 형성되지 않았다(Table 1).
- lmg/L BA를 포함하는 배지에서 shoot의 형성률(Table 2)이 가장 높았으며 형성된 개체 수®g. 3)도 가장 많았고 BA의 농도가 증가 될수록 그 형성률은 현 저하게 낮아졌다. O.
- 3)도 가장 많았고 BA의 농도가 증가 될수록 그 형성률은 현 저하게 낮아졌다. O.lmg/L NAA + O.lmg/L BA를 포함하는 배지 에서도 shoot의 형성률이 높았으나 IBA와 BA를 포함하는 배지에 비하여는 형성된 개체 수에 있어서 훨씬 낮은 결과를 보여주었다 또한 모든 경우에 있어서 배축보다는 자엽에서 shoot 형성빈도와 개체수가 많았다(Table 2, Fig. 3).
- 구기자나무로부터 캘러스의 형성과 shoot의 형성에 미치는 생 장조절제의 영향을 연구한 결과 캘러스의 형성은 2, 4TD를 포함하는 배지에서 효과적이었으나 shoot의 형성에는 억제효과를 보였다. Shoot의 형성은 0.1mg/L IAA + 0.1mg/L BA의 배지에서 형 성률과 절편당 형성 개체수가 가장 높은 분화율을 보였다. 절편체 의 부위에 극성에 다른 캘러스의 형성과 shoot의 재분화에 있어서는 자엽의 기부와 말단부를 20% 절제한 절편의 기부의 절단면에 서는 shoot의 형성이, 하부의 절단면에서는 캘러스의 형성이 높았 으며 시간이 경과함에 따라 하부에서도 shoot의 형성이 보였다.
- 4D, E). 가장 극성이 강하게 보인 경우는 기 부와 말단부를 모두 20% 정도 절단한 경우로 기부는 93% 정도의 shoot 분화율을 말단부는 94%의 캘러스 형성률을 보였다 (Table 3). Debergh와 Wael(1977)은 Ficus, lyrata의 옆편을 여러 부위로 구분하여 절취, 치상 하였던 옆연 조직에서 Shoot 형 성이 가장 양호하다고 하였으며, 이 원인을 Kuku et a/.
- 구기자나무로부터 캘러스의 형성과 shoot의 형성에 미치는 생 장조절제의 영향을 연구한 결과 캘러스의 형성은 2, 4TD를 포함하는 배지에서 효과적이었으나 shoot의 형성에는 억제효과를 보였다. Shoot의 형성은 0.
- 발근배지에서 4주간 배양하여 얻은 재분화체를 습도가 60%, 온도가 25±1℃로 일정하게 유지되는 온실의 비 멸균토양에 이 식하여 4주후에 생존률을 관찰한 결과 90% 이상의 높은 생존률 을 나타내었으며 개화가 이루어졌다(Fig. 6). 구기자나무 재분화 식물체의 포장 생육특성에 대하여는 이미 Kim et al.
- (2001)의 실험 보고에서도 2, 4-D를 첨 가하는 경우 구기자에서 shoot의 발생이 저조함을 보였다 일반적으로 shoot의 형성은 고농도의 cytokinin과 저농도의 auxin을 혼 용하였을 때 좋은 결과가 보이는 것으로 알려져 있다. 본 연구에 서도 BA 단독배지 보다는 IBA와 BA의 혼합배지에서 높은 분화율 을 보였지만, cytokinin과 auxin 모두 저농도로 혼용하였을 경우 더 좋은 shoot 의 분화율을 보였다. 본 연구의 결과로는 오옥신류 로는 IBA가 사이토카이닌류로는 BA가 저농도로 첨가된 배지에서 shoot의 형성이 양호하였으며 식물체로의 분화도 정상적이었다.
- 본 연구에 서도 BA 단독배지 보다는 IBA와 BA의 혼합배지에서 높은 분화율 을 보였지만, cytokinin과 auxin 모두 저농도로 혼용하였을 경우 더 좋은 shoot 의 분화율을 보였다. 본 연구의 결과로는 오옥신류 로는 IBA가 사이토카이닌류로는 BA가 저농도로 첨가된 배지에서 shoot의 형성이 양호하였으며 식물체로의 분화도 정상적이었다.
- 1981) 되었는데, 특히 발근시에는 저농도의 auxin류, 혹은 생장조절 물질을 첨가하지 않은 배지를 사용하였다(Kuroi and Sawada, 1985). 이와 같은 생장조절물질의 적응 정도는 배양식물의 종 류에 따라 차이가 나타났으며, 재분화율, 증식정도, 생장능률, 즉 배양효율에서 많은 차이를 나타내었다. 특히 구기자의 경우 배양단계별 무기염의 농도는 차이를 두지 않았으나 발근시에는 1/3의 MS배지를 사용하였다.
- 1, Table 3) 캘러스의 형성과 shoot의 형 성에 있어서 차이점들이 있었으며 극성을 보였다. 자엽과 배축 뿌리 모두 절단하지 않은 경우와 자엽과 배축 뿌리를 두 부분으 로 자른 조직들(Fig. 1undefined-undefined1, 2, 3, 4, 5, 6)그리고 말단부 20%를 제거한 자엽(Fig. 1undefined-undefined9)도 모두 상처부위에서만 캘러스의 형성과 shoot의 재분화를 보였다(Fig. 4A B, C). 배축의 경우(Fig.
- 1mg/L BA의 배지에서 형 성률과 절편당 형성 개체수가 가장 높은 분화율을 보였다. 절편체 의 부위에 극성에 다른 캘러스의 형성과 shoot의 재분화에 있어서는 자엽의 기부와 말단부를 20% 절제한 절편의 기부의 절단면에 서는 shoot의 형성이, 하부의 절단면에서는 캘러스의 형성이 높았 으며 시간이 경과함에 따라 하부에서도 shoot의 형성이 보였다.
- 절편체가 지니는 극성의 효과를 알아보기 위하여 12가지의 절 단처리를 한 결과(Fig. 1, Table 3) 캘러스의 형성과 shoot의 형 성에 있어서 차이점들이 있었으며 극성을 보였다. 자엽과 배축 뿌리 모두 절단하지 않은 경우와 자엽과 배축 뿌리를 두 부분으 로 자른 조직들(Fig.
후속연구
- 특히 구기자의 경우 배양단계별 무기염의 농도는 차이를 두지 않았으나 발근시에는 1/3의 MS배지를 사용하였다. 본 연구의 결과 재분화에 있 어서는 생장조절물질의 조성에 따라 shoot와 캘러스의 분화율 에 있어서 많은 차이를 보였으므로 앞으로 배지의 종류와 무기 염류의 농도에 따른 분화율에 대한 검토가 더욱 필요하다고 보여 진다.
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