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문제 정의
- 위와 같은 재분화 조건을 바탕으로 형질전환을 수행하였다.구기자 유식물체의 자엽 (0.5 X0.5 cm)과 하배축 (0.5~1 cm)절편체를 무균상에서 절단하여 침으로 자극한 후 진탕배양된 bet 유전자가 함유된 Agrobacterium 균주와 공조배양하기 전 의 전배양기간과 배지조건이 구기자의 형질전환율에 어떠한 영향을 미치는지를 조사하기 위하여 실험한 결과는 다음과같다 (Table 5). MS기본배지나 2, 4-D 1 mg/L가 함유된 배지에 전배양한 경우에는 전배양 기간에 상관없이 전혀 캘러스 나 줄기가 분화되지 않고 모두 갈변하거나 백화되며 고사한 반면, 재분화배지 조건에 전배양을 한 경우에는 형질전환체의 경우 약 10일 후에 캘러스가 유도되기 시작하면서 약 4~5주 후에는 shoot가 단독 또는 쌍으로 작게 형성되었다 (Figure 2).
- 따라서 본 연구에서는 캘러스 유도 배지를 통한 배양 기간 을 생략하고 구기자나무의 절편체를 재분화배지에 치상하여 절편체로부터 직접 신초를 유도하는 방법을 이용하여 식물체 재생을 단축시키고자 하며, 이러한 재분화체계를 바탕으로 구 기자나무에 염류 관련 유전자 (bet A, bet B) 도입을 위한 효 과적 인 형질전환체 계를 연구하고자 수행하였던 바, 그 결과를 이에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 0% agarose gel에서 전기영동하여 크기를 확인하였다. PCR 산물은 전기영동된 젤을 nylonmembrane에 blot 시키 고, MegaprimeT DNA labeling system으로 labeling 된 bet A, bet B probe를 사용하여 hybridization을 수행하였다.
- DNA는 Edward 등 (1991)의 방법으로 추출하였으며, PCR 반응조건은 94℃에서 2분간 pre-denaturation한 후, 96℃에서 30초간 변성, 60℃에서 30초간 annealing, 72 ℃ 에서 15분간 post-extension 시키는 조건으로 하였다. PCR 증폭에 사용한 primer는 bet A 유 전자을 사용하였고, betB 유전자 (335 bp)의 증폭을 위해서는 5'-GGCAATATCTGACCGAGCATCC-3' 와 5 -GTTAGTTT GCGGATCGAAAACG-3'을 사용하였다. 합성된 DNA 밴 드는 1.
- 형질전환체의 bet A, bet B 유전자의 발현여부를 확인하기 위해서는 형질전환된 구기자나무의 잎을 액체질소를 첨가하면서 마쇄한 후, Total RNA isolation kit (Advanced bio- technologies)를 이용하여 총 RNA를 추출하고 spectro- photometer# 이용하여 정량하였다. PreMixTM-RT/PCR kit (Bioneer)를 이용하여 first-strand cDNA를 합성한 후 전술 한 bet A, bet B primer를 사용하여 상용의 방법으로 RT- PCR 반응을 수행하였다.
- 구기자나무의 효과적인 재분화조건을 바탕으로 염류내성유전자인인 Bet A와 Bet B 유전자의 도입을 시도하였다. 구기자 나무의 절편체를 재료로 kinetin 1 mg/L, IBA 0.05 mg/L가 첨가된 MS배지에 2일간 전배양한 후 과 공 조배양 및 선발배지에서의 배양으로 kanamycin에 내성을 갖는 잠정적 인 형 질전환체를 유도하였다. 형질전환체는 PCR 기 법 및 Southern blot 분석으로 Bet A와 Bet B 유전자 전이를 확인하였고, 도입된 유전자의 발현은 RT-PCR 방법을 사용하여 확인하였다.
- 구기자나무의 효과적인 재분화조건을 바탕으로 염류내성유전자인인 Bet A와 Bet B 유전자의 도입을 시도하였다. 구기자 나무의 절편체를 재료로 kinetin 1 mg/L, IBA 0.
- , 16시간 광주기의 배양실에서 신초를 유도하여 재분 화에 최적인 생장조절제와 그 농도 조합을 선별하였다. 그 후 유도된 신초의 발근을 위하여 1/2 MS배지에 IAA와 NAA를 각각 0, 0.1, 0.5 및 1 mg/L로 첨가하여 신초의 발근양상을 조 사하였다.
- 기내 발근에 효과적인 auxin 종류를 구명하고자 구기자나 무 경우의 기존에 보고되어 있는 (Kim et al. 1993; Park et al. 1995) 발근 배지의 hormone 조성을 근거로하여 0, 0.1, 0.5, 1 mg/L로 NAA와 IAA의 농도를 달리하여 배양하였다2(Table 2). NAA와 IAA 1 mg/L 농도로 처리한 처리구에서 약 90% 이상의 발근율을 나타낸 반면 저농도의 처리구에서 는 상대적으로 낮은 발근율을 나타내었다.
- 이것은 형질전환체 게놈 안으로 bet 유전자가 안정적으로 도입되었음을 나타내는 결과이다. 또한, 형질전환 된 구기자나무에서 bet 유전자의 발현을 확인하기 위해 RT- PCR을 수행하였다. 형질전환체에서는 to A (457 bp) 유전자 나 bet B (355 bp) 유전자를 확인할 수 있었으나 정상식물체 서는 아무런 band도 나타나지 않았다 (Figure 3C).
- 신초 유도 배지에 kanamycin을 0, 10, 30, 50, 100mg/L로 여과처리 하였고, 자엽과 하배축 절편을 1 ~2cm로 하여 20반 복으로 치상하였다. 배양 4주 후 kanamycin 농도에 따른 엽 절편의 생존, 신초형성 유무를 조사하여 형질전환체 선발을 위한 최적농도를 결정하였다.
- 5, 2%로 처리하여 15개의 절편을 치상하였다. 배양 4주 후 절편체의 재분화율을 조사하였다.
- 신초 유도 배지에 kanamycin을 0, 10, 30, 50, 100mg/L로 여과처리 하였고, 자엽과 하배축 절편을 1 ~2cm로 하여 20반 복으로 치상하였다. 배양 4주 후 kanamycin 농도에 따른 엽 절편의 생존, 신초형성 유무를 조사하여 형질전환체 선발을 위한 최적농도를 결정하였다.
- 약 7~10일 동안 자란 유식물체의 자엽과 하배축 절편체를여러가지 농도의 kinetin, zeatin, BA, IAA, NAA, IB A, 2, 4- D, CPA가 첨가된 MS기본배지에 치상한 후 25±1℃, 40 #, 16시간 광주기의 배양실에서 신초를 유도하여 재분 화에 최적인 생장조절제와 그 농도 조합을 선별하였다. 그 후 유도된 신초의 발근을 위하여 1/2 MS배지에 IAA와 NAA를 각각 0, 0.
- 정상적인 구기자나무 절편체의 kanamycin에 대한 선발 농도를 조사한 결과 하배축은 10 mg/L까지는 캘러스가 정상적 으로 형성되면서 신초가 형성되었으나, 30 mg/L부터는 전혀 캘러스 형성이 없었고 자엽의 경우에는 하배축에 비해 kanamycin에 더 감수성이 강해 10 mg/L부터 전혀 분화가 일어나지 않았다. 이 결과로 볼 때 형질전환체 선발을 위하여 kanamycin처리 최소 농도는 절편체에 관계없이 30 mg/L농 도면 충분하다고 생각되어 kanamycin 30mg/L농도를 선발 농도로 정하였다 (Table 3).
- 잠정적인 형질전환체의 bet AM#B 유전자의 도입 여부를 확인하기 위해 PCR을 수행하였다. DNA는 Edward 등 (1991)의 방법으로 추출하였으며, PCR 반응조건은 94℃에서 2분간 pre-denaturation한 후, 96℃에서 30초간 변성, 60℃에서 30초간 annealing, 72 ℃ 에서 15분간 post-extension 시키는 조건으로 하였다.
- 재분화된 유식물체 내로의 bet, 유전자 삽입 여부를 확인하기 위해 genomic DNA를 추출하여 PCR을 수행하였다. 그 결과, 형질전환체에서는 bet A (457 bp) 유전자나 bet B (355bp) 유전자를 확인할 수 있었으나 정상 식물체서는 아무 런 band도 나타나지 않았다.
- 정상적 인 구기자나무엽 절편에 미치는 염류스트레스 (NaCI) 의 최소억제농도를 조사하기 위해서 신초 유도 배지에 NaCI 을 0, 1, 1.5, 2%로 처리하여 15개의 절편을 치상하였다. 배양 4주 후 절편체의 재분화율을 조사하였다.
- 청양 구기자시험장 포장에 재식된 청양1호와 청양재래품종 의 종자를 70% EtOH로 30초간 침적시킨 후 2% sodium hypochlorite 용액에 15분간 표면살균하여 멸균수로 3회 수 세하였다. 표면살균된 종자를 3% sucrose, 0.
- 청양 구기자시험장 포장에 재식된 청양1호와 청양재래품종 의 종자를 70% EtOH로 30초간 침적시킨 후 2% sodium hypochlorite 용액에 15분간 표면살균하여 멸균수로 3회 수 세하였다. 표면살균된 종자를 3% sucrose, 0.7% agar가 첨가 된 MS 배지 (Murashige and Skoog 1962)에 치상하였다. 종 자는 25±1 ℃, 40 gErnes'1, 16시간 광주기의 배양실에서 약 7~10일 동안 발아시켰다.
- 품종별 부위별 배양효과를 조사하고자 청양1호와 청양재래 품종의 종자를 1/3 MS 발아배지에 치상하여 약 7~10일된 식물체의 하배축과 자엽을 kinetin 1 mg/L, IBA 0.05 mg/L의혼용처리배지에 치상하여 6주 후에 관찰하였다. 품종별로는 청양1호가 청양재래보다 재분화율이 양호하였고, 배양 중 절 편체의 비대 생장과 신초 유도 후 신장 생장이 보다 빠르게 일어났다 (Figure 1).
- PCR 증폭에 사용한 primer는 bet A 유 전자을 사용하였고, betB 유전자 (335 bp)의 증폭을 위해서는 5'-GGCAATATCTGACCGAGCATCC-3' 와 5 -GTTAGTTT GCGGATCGAAAACG-3'을 사용하였다. 합성된 DNA 밴 드는 1.0% agarose gel에서 전기영동하여 크기를 확인하였다. PCR 산물은 전기영동된 젤을 nylonmembrane에 blot 시키 고, MegaprimeT DNA labeling system으로 labeling 된 bet A, bet B probe를 사용하여 hybridization을 수행하였다.
- 형질전환에 사용된 내염성 유전자 (bet A, bet B)fe 믾y- cine betaine A, B gene 이 함유된 Agrobacterium tumefa- ciens (LBA4404)를 임업연구원에서 분양받아 사용하였다. 형질전환방법은 구기자나무 유식물체의 자엽 (0.5 cn?)과 하 배축 (0.5—1 cm)을 침으로 자극한 후 preculture를 0, 12, 24, 36, 48, 72시간별로 또한 배지조건은 MS기본배지, MS+2, 4- D 1 mg/L, MS+kinetin 1 mg/L, IBA 0.05 mg/L로 나누어 배양하였다. 다음 A.
- 05 mg/L가 첨가된 MS배지에 2일간 전배양한 후 과 공 조배양 및 선발배지에서의 배양으로 kanamycin에 내성을 갖는 잠정적 인 형 질전환체를 유도하였다. 형질전환체는 PCR 기 법 및 Southern blot 분석으로 Bet A와 Bet B 유전자 전이를 확인하였고, 도입된 유전자의 발현은 RT-PCR 방법을 사용하여 확인하였다.
- 형질전환체의 bet A, bet B 유전자의 발현여부를 확인하기 위해서는 형질전환된 구기자나무의 잎을 액체질소를 첨가하면서 마쇄한 후, Total RNA isolation kit (Advanced bio- technologies)를 이용하여 총 RNA를 추출하고 spectro- photometer# 이용하여 정량하였다. PreMixTM-RT/PCR kit (Bioneer)를 이용하여 first-strand cDNA를 합성한 후 전술 한 bet A, bet B primer를 사용하여 상용의 방법으로 RT- PCR 반응을 수행하였다.
대상 데이터
- 형질전환에 사용된 내염성 유전자 (bet A, bet B)fe 믾y- cine betaine A, B gene 이 함유된 Agrobacterium tumefa- ciens (LBA4404)를 임업연구원에서 분양받아 사용하였다. 형질전환방법은 구기자나무 유식물체의 자엽 (0.
이론/모형
- 잠정적인 형질전환체의 bet AM#B 유전자의 도입 여부를 확인하기 위해 PCR을 수행하였다. DNA는 Edward 등 (1991)의 방법으로 추출하였으며, PCR 반응조건은 94℃에서 2분간 pre-denaturation한 후, 96℃에서 30초간 변성, 60℃에서 30초간 annealing, 72 ℃ 에서 15분간 post-extension 시키는 조건으로 하였다. PCR 증폭에 사용한 primer는 bet A 유 전자을 사용하였고, betB 유전자 (335 bp)의 증폭을 위해서는 5'-GGCAATATCTGACCGAGCATCC-3' 와 5 -GTTAGTTT GCGGATCGAAAACG-3'을 사용하였다.
성능/효과
- 또한 Vir G (837 bp) primer에 의한 유전자 증폭을 볼 수 없었으므로 이 결과가 Agro- bacteriiim의 오염에 의해 나타난 결과가 아님을 확인할 수 있었다 (Figure 3A). 구기자나무의 het 유전자를 Probe로 사용하여 PCR 증폭 DNA 단편에 대한 Southern blot 분석을 실시한 결과 동일한 위치에서 band를 확인할 수 있었다(Figure 3B). 이것은 형질전환체 게놈 안으로 bet 유전자가 안정적으로 도입되었음을 나타내는 결과이다.
- 재분화된 유식물체 내로의 bet, 유전자 삽입 여부를 확인하기 위해 genomic DNA를 추출하여 PCR을 수행하였다. 그 결과, 형질전환체에서는 bet A (457 bp) 유전자나 bet B (355bp) 유전자를 확인할 수 있었으나 정상 식물체서는 아무 런 band도 나타나지 않았다. 또한 Vir G (837 bp) primer에 의한 유전자 증폭을 볼 수 없었으므로 이 결과가 Agro- bacteriiim의 오염에 의해 나타난 결과가 아님을 확인할 수 있었다 (Figure 3A).
- 따라서 같은 농도의 auxin이라도 상대적으로 활성이 높은 NAA처리에서 다량의 callus가 발생 되고 이것이 발근에 부정적으로 작용한 것으로 판단된다. 따라서 구기자나무의 발근은 발근율과 뿌리수를 감안하여 볼 때 1 mg/L의 IAA가 첨가된 MS배지에서 가장 양호하게 조 사되었다 (Figure 1C).
- 품종별로는 청양1호가 청양재래보다 재분화율이 양호하였고, 배양 중 절 편체의 비대 생장과 신초 유도 후 신장 생장이 보다 빠르게 일어났다 (Figure 1). 부위별로는 하배축이 자엽에 비하여 재 분화율이 현저하게 높게 조사되었으며 이로 인해서 하배축이 식물체 재생에 있어서 효과적인 재료임을 알 수 있었다1(Table 1). 위의 실험 결과에서 구기자나무의 품종별과 절편 체 부위에 따라 auxin과 cytokinin 에 대한 반응이 다르게 나 타났으므로 식물체 재분화에 있어 품종과 부위에 따라 생장 조절물질의 종류와 적정농도를 구명할 필요가 있을 것으로 생각되었다.
- 5%부터는 전혀 캘러스나 shoot가 분화되지 않으며 모두 고사하였다. 이 결과로 형질전 환체의 엽절편에서 부정아 유도를 위한 구기자의 염류 (NaCl)처리에 의한 선발농도는 NaCl 1.5%이면 충분하다고사료된다.
- 그러나 전배 양시간이 길어질수록 bet A, bet B 유 전자에 의한 형질전환체일 확률보다 절편체에서 이미 분화조 직이 만들어진 상태에서 kanamycin 이 첨가된 선발배지에 배 양하였기에 분화가 계속 이루어졌을 가능성이 있으므로 이에 대한 좀더 복잡한 분자수준의 유전분석확인이 요구된다. 이상의 결과는 구기자의 형질전환은 절편체가 호르몬을 adapta- tion하여 세포의 분화능이 어느 정도 촉진된 후에 균과 공조 배양을 해야만 효과적이며, 이는 절편체의 발육상태에 의해 기인된 것으로 생각된다.
- 형질전환체에서는 to A (457 bp) 유전자 나 bet B (355 bp) 유전자를 확인할 수 있었으나 정상식물체 서는 아무런 band도 나타나지 않았다 (Figure 3C). 이상의 결과로 구기자나무에 도입된 bet 유전자가 안정적으로 발현되고 있는 것을 확인할 수 있었다.
- 05mg/L를 기점으로 좀 더 농도를 세분하여 조사하였 는데 IBA 농도가 높아질수록 캘러스만 유기된 상태로 shoot 발생은 없었으며 kinetin의 농도가 높아질수록 잎과 줄기의 형성률이 적어지는 경향이 관찰되었다. 이상의 실험을 종합하여 볼 때 kinetin 1 mg/L, IBA 0.05 mg/L의 혼용처리배지에서 배양 10일경 가장 빨리 절단면과 상처낸 부위에서 캘러스가 유도되면서 shoot가 분화되었으며 배양 20일경에 분화된 shoot 는 배양 30일 후에는 본엽 5~7개로 생장되어 구기자의 줄기 재분화에 가장 양호한 식물호르몬 조성임을 알 수 있었다.
- 혼용처리 한 결과 kinetin과 IBA가 첨 가된 혼용처 리구에서 줄기 재분화율이 양호하게 관찰되었다 (Figure 1A,B). 이에 따라 구기자의 분화에 미치는 kinetin과 IBA의 효과를 좀 더 구체적으로 확인하기 위하여 kinetin 1 mg/L와 IBA0.05mg/L를 기점으로 좀 더 농도를 세분하여 조사하였 는데 IBA 농도가 높아질수록 캘러스만 유기된 상태로 shoot 발생은 없었으며 kinetin의 농도가 높아질수록 잎과 줄기의 형성률이 적어지는 경향이 관찰되었다. 이상의 실험을 종합하여 볼 때 kinetin 1 mg/L, IBA 0.
- 정상적인 구기자나무 절편체의 kanamycin에 대한 선발 농도를 조사한 결과 하배축은 10 mg/L까지는 캘러스가 정상적 으로 형성되면서 신초가 형성되었으나, 30 mg/L부터는 전혀 캘러스 형성이 없었고 자엽의 경우에는 하배축에 비해 kanamycin에 더 감수성이 강해 10 mg/L부터 전혀 분화가 일어나지 않았다. 이 결과로 볼 때 형질전환체 선발을 위하여 kanamycin처리 최소 농도는 절편체에 관계없이 30 mg/L농 도면 충분하다고 생각되어 kanamycin 30mg/L농도를 선발 농도로 정하였다 (Table 3).
- 약 7~10일 동안 발아시킨 유식물체에서 절취한 자엽과 하 배축을 여러가지 농도의 kinetin, zeatin, BAP와 같은 cytokinin 류와 IAA, NAA, IB A, 2, 4-D, CPA 와 같은 auxin류로 단독 . 혼용처리 한 결과 kinetin과 IBA가 첨 가된 혼용처 리구에서 줄기 재분화율이 양호하게 관찰되었다 (Figure 1A,B). 이에 따라 구기자의 분화에 미치는 kinetin과 IBA의 효과를 좀 더 구체적으로 확인하기 위하여 kinetin 1 mg/L와 IBA0.
후속연구
- 전배양은 48시간이 청양1호의 경우 20~30%로 매우 높은 잠정적 형질전환율을 보였고 더 이상 전배양시간이 길어져도 형질전환율은 같게 측정되었다5(Table 5). 그러나 전배 양시간이 길어질수록 bet A, bet B 유 전자에 의한 형질전환체일 확률보다 절편체에서 이미 분화조 직이 만들어진 상태에서 kanamycin 이 첨가된 선발배지에 배 양하였기에 분화가 계속 이루어졌을 가능성이 있으므로 이에 대한 좀더 복잡한 분자수준의 유전분석확인이 요구된다. 이상의 결과는 구기자의 형질전환은 절편체가 호르몬을 adapta- tion하여 세포의 분화능이 어느 정도 촉진된 후에 균과 공조 배양을 해야만 효과적이며, 이는 절편체의 발육상태에 의해 기인된 것으로 생각된다.
- 부위별로는 하배축이 자엽에 비하여 재 분화율이 현저하게 높게 조사되었으며 이로 인해서 하배축이 식물체 재생에 있어서 효과적인 재료임을 알 수 있었다1(Table 1). 위의 실험 결과에서 구기자나무의 품종별과 절편 체 부위에 따라 auxin과 cytokinin 에 대한 반응이 다르게 나 타났으므로 식물체 재분화에 있어 품종과 부위에 따라 생장 조절물질의 종류와 적정농도를 구명할 필요가 있을 것으로 생각되었다.
- 6~8주 후 재분화된 신초는 발근배지에 계대하여 유지하였 고, 증식된 식물체의 발근은 약 1주일 후 가능하였으며, 2주일 후에는 많은 뿌리가 형성되었다 (Figure 2). 차후 풋트묘 육성, 포장 이식 등을 통해 계속 관찰이 요구되며, 실제 이러한 염 류내 성 유전자 bet A, betB 유전자에 의한 형질전환식식 물체 의 염류내성정도 조사가 필요할 것으로 생각된다.
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