무당벌레(Harmonia axyridis) 추출물에 의한 BV-2 세포주의 Nitric Oxide 생성 저해 활성 Inhibition of Nitric Oxide Production by ladybug extracts(Harmonia axyridis) in LPS-activated BV-2 cells원문보기
퇴행성 뇌질환은 뇌에 존재하는 면역세포인 소교세포의 염증반응이 발병 요인 중의 하나로 알려져 있다. 이에 본 연구는 초고속자동화시스템(high throughput screening: HTS)을 이용하여 약용곤충추출물로부터 항산화와 항염증 기능이 있다고 알려진 무당벌레 추출물로부터 염증발생인자인 nitric oxide의 생성에 어떠한 영향을 주는지 다음과 같은 결과를 얻었다. 소교세포인 BV-2세포에 대한 무당벌레 추출물의 세포독성은 물과 메탄올, DMSO 추출물에서는 100 ng/ml 까지는 거의 없었으나 에탄올 추출물은 1 ng/ml에서도 세포독성이 있었다. 물과 메탄을 추출물(50 ng/ml)은 LPS로 활성화된 BV-2세포에서 $TNF-{\alpha}$와 $IL-1{\beta}$의 발생을 35-60% 가량 억제 하였다. LPS로 유도된 NO의 생성은 물과 메탄올 추출물을 처리했을 때 각각 55%, 76% 억제되었다. 또한, MeOH 추출물을 처리했을 경우 LPS에 의한 iNOS 발현 정도를 단백질 수준과 mRNA 수준에서 현저하게 억제시킴을 확인하였다.
퇴행성 뇌질환은 뇌에 존재하는 면역세포인 소교세포의 염증반응이 발병 요인 중의 하나로 알려져 있다. 이에 본 연구는 초고속자동화시스템(high throughput screening: HTS)을 이용하여 약용곤충추출물로부터 항산화와 항염증 기능이 있다고 알려진 무당벌레 추출물로부터 염증발생인자인 nitric oxide의 생성에 어떠한 영향을 주는지 다음과 같은 결과를 얻었다. 소교세포인 BV-2세포에 대한 무당벌레 추출물의 세포독성은 물과 메탄올, DMSO 추출물에서는 100 ng/ml 까지는 거의 없었으나 에탄올 추출물은 1 ng/ml에서도 세포독성이 있었다. 물과 메탄을 추출물(50 ng/ml)은 LPS로 활성화된 BV-2세포에서 $TNF-{\alpha}$와 $IL-1{\beta}$의 발생을 35-60% 가량 억제 하였다. LPS로 유도된 NO의 생성은 물과 메탄올 추출물을 처리했을 때 각각 55%, 76% 억제되었다. 또한, MeOH 추출물을 처리했을 경우 LPS에 의한 iNOS 발현 정도를 단백질 수준과 mRNA 수준에서 현저하게 억제시킴을 확인하였다.
Inflammation in the brain has known to be associated with the development of a various neurologiacal diseases. The hallmark of neuro-inflammation is the activation of microglia, brain macrophage. Pro-inflammatory compounds including nitric oxide(NO) are the main cause of neuro-degenerative disease s...
Inflammation in the brain has known to be associated with the development of a various neurologiacal diseases. The hallmark of neuro-inflammation is the activation of microglia, brain macrophage. Pro-inflammatory compounds including nitric oxide(NO) are the main cause of neuro-degenerative disease such as Alzheimer's disease. In the study, we examined whether Harmonia axyridis extracts inhibit the NO production by a direct method using Griess reagent, western blotting and by RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reactionin) the gene expression of inducible nitric oxide synthase(iNOS). Distilled water$(H_2O)$ and methanol(MeOH) extracts of H. axyridis inhibited the protein expression of TNF-a(Tumor Necrosis Factor) and IL-6(Interleukin) in LPS (Lipopolysaccharide) stimulated BV-2 cells at the concentration of 100 ng/ml. Incubation of BV-2 cells with the extracts of $H_2O$ of MeOH inhibited the LPS induced NO and iNOS protein. And this inhibition of iNOS protein is concordant with the inhibition of iNOS mRNA expression. These data suggested that H. axyridis extracts may play a crucial role in inhibiting the NO production.
Inflammation in the brain has known to be associated with the development of a various neurologiacal diseases. The hallmark of neuro-inflammation is the activation of microglia, brain macrophage. Pro-inflammatory compounds including nitric oxide(NO) are the main cause of neuro-degenerative disease such as Alzheimer's disease. In the study, we examined whether Harmonia axyridis extracts inhibit the NO production by a direct method using Griess reagent, western blotting and by RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reactionin) the gene expression of inducible nitric oxide synthase(iNOS). Distilled water$(H_2O)$ and methanol(MeOH) extracts of H. axyridis inhibited the protein expression of TNF-a(Tumor Necrosis Factor) and IL-6(Interleukin) in LPS (Lipopolysaccharide) stimulated BV-2 cells at the concentration of 100 ng/ml. Incubation of BV-2 cells with the extracts of $H_2O$ of MeOH inhibited the LPS induced NO and iNOS protein. And this inhibition of iNOS protein is concordant with the inhibition of iNOS mRNA expression. These data suggested that H. axyridis extracts may play a crucial role in inhibiting the NO production.
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문제 정의
이와 관련하여 본 연구는 무당벌레 추출물이 소교세포에서 NO 분비를 억제할 수 있는가를 밝히고자 한다.
제안 방법
BV-2 세포에 100ng/ml의 LPS와 무당벌레 추출물을 동시 처리한 후 세포독성을 평가하였다. 그 결과 물, 메탄올 그리고 DMSO 추출물 100 ng/ml 이하의 농도에서는 독성을 갖지 않았으나 에탄올추출물에서는 lng/ml의 농도에서도 세포 독성을 보였다 (그림 1).
24시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후, BV-2 세포로부터 전체 RNA는RNAzolB (TEL-TEST, Friendwood, USA)를 사용하여 추출하고 분광광도계 (Beckman, Peapack, USA)로 RNA의 순도와 정제된 양을 구하였다. 분리한 1 ug의 RNA를 주형으로 1st strand cDNA synthesis Kit(Boehringer Mannheim Co.
배양이 끝난 후, BV-2 세포로부터 전체 RNA는RNAzolB (TEL-TEST, Friendwood, USA)를 사용하여 추출하고 분광광도계 (Beckman, Peapack, USA)로 RNA의 순도와 정제된 양을 구하였다. 분리한 1 ug의 RNA를 주형으로 1st strand cDNA synthesis Kit(Boehringer Mannheim Co., IN, USA)를 이용하여 oligo dT primed first strand DNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 주형으로 MgCl2의 농도가 1.
이후 배지를 제거하고, LPS 와 시료를 함유한 새로운 배지를 동시에 처리하여 전 배양과 동일 조건에서 18시간 동안 배양하였다. 세포 독성은 MTT(methylthiazol-2-yl-2.5-diphenyl tetrazolium bromide) 시약을 이용하여 측정하였고, TNF-α, IL-1β의 정량은 mouse ELISA kit(R&D Systems, USA)를 이용하였다.
그 결과 물, 메탄올 그리고 DMSO 추출물 100 ng/ml 이하의 농도에서는 독성을 갖지 않았으나 에탄올추출물에서는 lng/ml의 농도에서도 세포 독성을 보였다 (그림 1). 세포독성을 갖지 않는 물, MeOH 및 DMSO의 농도 범위에서 무당벌레추출물을 처리하여 염증성 cytokine 억제 효과를 확인하였다. 그 결과 물과 메탄올추출물이 TNF-α를 각각 38%, 53%, IL-1β는 각각 36%, 62% 억제하였다 (표 1).
세포독성을 갖지 않는 물, 메탄올 및 DMSO의 농도범위에서 무당벌레 추출물을 처리한 후 NO 생성량을 측정하였다. BV-2 세포에 LPS를 단독 처리했을 때에는 43.
, IN, USA)를 이용하여 oligo dT primed first strand DNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 주형으로 MgCl2의 농도가 1.5 mmol, dNTP 0.5 mmol, 2.5 U/μL의 Taq polymerase 와 PCR 완충액 에 각기 25 pmol 의 iNOS 와 house keeping gene인 β-actin primer를 혼합하여 PCR반응기(TaKaRa, Japan)에서 증폭하였다. β-actin의 primer는 5' -GTGGGCCGCCCTAGGCACCAG3', 5' -GGAGGAAGAGGATGCGGCAGT-3' (Jang et al.
대상 데이터
배양세포가 바닥 면적의 90% 가량 차도록 자라면 계대배양을 하고 대수성장기의 세포를 실험에 사용하였다.
본 실험에 사용한 곤충 추출물은 대전대 생명과학과와 경북대학교 식품공학과로부터 제공 받았다. 증류수, DMSO(dimethyl sulfoxide), 에탄올, 메탄올을 이용하여 24시간 추출과정을 거쳤으며, 물 추출물은 섭씨 60℃에서 열수 추줄한 것으로 HTS(high throughput screenig) system으로 항산화와 항염 효과가 있다고 확인되어 분양받은 무당벌레 추출물을 대상으로 하였다 (Park et al.
소교세포 (BV-2)는 경희대학교 한약리학교실로부터 분양받아 사용하였으며, 10% FBS, 1% penicillin/stre-ptomycin을 포함하고 있는 DMEM(Cambrex, USA)으로 37℃, 5% CO2 배양기에서 계대배양하여 실험에 사용하였다. 배양세포가 바닥 면적의 90% 가량 차도록 자라면 계대배양을 하고 대수성장기의 세포를 실험에 사용하였다.
식품공학과로부터 제공 받았다. 증류수, DMSO(dimethyl sulfoxide), 에탄올, 메탄올을 이용하여 24시간 추출과정을 거쳤으며, 물 추출물은 섭씨 60℃에서 열수 추줄한 것으로 HTS(high throughput screenig) system으로 항산화와 항염 효과가 있다고 확인되어 분양받은 무당벌레 추출물을 대상으로 하였다 (Park et al., 2005).
데이터처리
무당벌레 추출물간의 NO발생 억제는 Student's t-tests (SAS Institute, 2004)로 비교하였다.
이론/모형
BV-2 세포에서 iNOS의 단백질 발현을 western blot 방법으로 조사하였다. 무당벌레 메 탄올추출물 30ng/ml 이상의 농도로 처리하였을 때 강한 발현 억 제 효과를 나타내었다(그림 3 (A)).
axyridis were incubated with or without solvent extracts plus LPS (100ng/ml) for 24 hrs at indicated doses. Cell viability was measured by MTT assay. Data are expressed as means±S.
성능/효과
현저하게 억제되는 것을 확인할 수 있었다. LPS에 의한 iNOS 발현 정도를 단백질 수준과 mRNA 수준에서관찰한 결과에서도 메탄올 추출물이 iNOS 발현을 현저하게 억제하는 것을 확인할 수 있었고 iNOS의 산물인 NO 생성량도 줄어드는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 NO의 생성 억제는 iNOS의 발현 저해에 의한 것임을 알 수 있었다.
처리한 후 세포독성을 평가하였다. 그 결과 물, 메탄올 그리고 DMSO 추출물 100 ng/ml 이하의 농도에서는 독성을 갖지 않았으나 에탄올추출물에서는 lng/ml의 농도에서도 세포 독성을 보였다 (그림 1). 세포독성을 갖지 않는 물, MeOH 및 DMSO의 농도 범위에서 무당벌레추출물을 처리하여 염증성 cytokine 억제 효과를 확인하였다.
세포독성을 갖지 않는 물, MeOH 및 DMSO의 농도 범위에서 무당벌레추출물을 처리하여 염증성 cytokine 억제 효과를 확인하였다. 그 결과 물과 메탄올추출물이 TNF-α를 각각 38%, 53%, IL-1β는 각각 36%, 62% 억제하였다 (표 1).
무당벌레 메 탄올추출물 30ng/ml 이상의 농도로 처리하였을 때 강한 발현 억 제 효과를 나타내었다(그림 3 (A)). 그리고 iNOS의 mRNA 발현에 미치는 억제효과를 RT-PCR 방법으로 분석한 결과 zNOS의 mRNA가 현저히 감소된 것을 확인할 수 있었다(그림 3 (B)).
1 μM로 현저히 줄어드는 것을 확인할 수있었다 (그림 2 (A)). 메탄올추출물을 농도별로 처리했을때, 농도 의존적으로 NO 생성량이 줄어드는 것을 확인할 수 있었다 (그림 2 (B)). 메탄올추출물에서의 NO 생성억제율에 대한 IC50(Inhibitory Concentration)은 32 ng/ml 이였다.
조사하였다. 무당벌레 메 탄올추출물 30ng/ml 이상의 농도로 처리하였을 때 강한 발현 억 제 효과를 나타내었다(그림 3 (A)). 그리고 iNOS의 mRNA 발현에 미치는 억제효과를 RT-PCR 방법으로 분석한 결과 zNOS의 mRNA가 현저히 감소된 것을 확인할 수 있었다(그림 3 (B)).
본 연구에서는 소교세포인 BV-2 세포에 LPS (100ng/ ml)로 자극시켜 무당벌레 추출물을 세포독성이 없는 농도에서 처리하여 TNF-α, IL-1β 생성을 관찰한 결과 물, 메탄올과 DMSO 추출물에서 TNF-α생성과 IL-6 생성이 LPS 단독 처리군에 비하여 억제 되었다 특히 메탄올 추출물에서 현저하게 억제되는 것을 확인할 수 있었다. LPS에 의한 iNOS 발현 정도를 단백질 수준과 mRNA 수준에서관찰한 결과에서도 메탄올 추출물이 iNOS 발현을 현저하게 억제하는 것을 확인할 수 있었고 iNOS의 산물인 NO 생성량도 줄어드는 것을 확인할 수 있었다.
후속연구
따라서 NO의 생성 억제는 iNOS의 발현 저해에 의한 것임을 알 수 있었다. 본 연구는 무당벌레의 유효 성분 추출을 통한 항염증물질의 연구와 염증 억제 성분의 분리 및 그 작용기전 연구에 중요한 기초 자료가 될 것이며 더 나아가 퇴행성뇌질환치료 연구에 도움이 되리라 사료된다.
참고문헌 (26)
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