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문제 정의
- 또한, 매 실추출물의 항균물질은 넓은 범위의 온도(40〜120°C) 및 pH(3〜11)에서 안정성을 나타냈다. 따라서 매실추출물의 항균물질은 항균활성이 높고, 항균 spectrum이 광범위 할 뿐아니라, 넓은 범위의 온도 및 pH에 안정하여 이상적인 천연 항균제로서의 개발가능성을 제시하였다. 아울러, 매 실추출물의 항균작용을 조사한 결과, 매실추출물에는 두 종류 이상의 항균물질이 존재하며 이 물질들의 상승작용으로 항균활성을 나타냄을 확인하였다.
- 매실도 예외는 아니어서 적어도 수십 가지 이상의 여러 성분들이 복합적으로 이루어져 있으리라고 예상은 되지만, 미량 존재하는 여러 가지 성분들의 분리나 효능은 알려진 바 없다. 따라서, 본 연구에서는 매실추출 물의 항균특성을 구명하는 기초적인 연구를 수행하여 다음과 같은 결과를 얻었기에 보고하고자 한다.
제안 방법
- β-galactosidase를 생성하는가를 알기 위해 glucose 최소 고체배지 표면에 X-gal (5-bromo-4-chloro- 3-indolyl-B-D-galatoside)을 골고루 도포한 후, 대상 균주 한 백금이를 접종하였다. 24시간이 경과한 후 colony의 색깔을 확인함으로써 Q-galactoside의 존재 여부를 조사하였다. 측정하고자 하는 효소 ^galactosidase는 균체내에 존재하므로 PME가 세포막에 영향을 주지 않는다면, 증류수를 가하여 준 negative 대조군에서처 럼 ^galactosidase의 활성을 나타내지 않으며, 이와는 반대로 세포막에 영향을 주어 세포막이 손상을 받아 Q-galactisidase가 세포 밖으로 유출이 되면, toluene을 가하여 준 positive 대조군에서처 럼 효소 활성이 검출될 것이다.
- PME가 세포막에 미치는 영향을 살펴보기 위하여 먼저 membrane perturbation 시켰을 때, 세포내에 존재하는 P -galactosidase가 세포 외부로 분비되는가의 여부를 조사하였다: 먼저, 시험균주인 Collectorichum fragariae?} {3-galac- tosidase를 생성하는가를 확인하기 위하여, IPTG (Isoproyl- P- D-TDiogalactopyranoside)와 X-gal을 가하여 준 배지에서 배양하여 이를 확인하였다(Rg 10). PME가 세포막 perturbation에 영향을 미치는가를 조사하기 위해 세포를 배양한 후, ONPG(0-Nitrophenyl -D-galactopyranoside)와 세포혼합액 에 증류수, toluene, PME 총 추출물, 소수성 및 친수성분획을 가하여 주었다. β-galactosidase를 생성하는가를 알기 위해 glucose 최소 고체배지 표면에 X-gal (5-bromo-4-chloro- 3-indolyl-B-D-galatoside)을 골고루 도포한 후, 대상 균주 한 백금이를 접종하였다.
- PME가 세포막에 미치는 영향을 살펴보기 위하여 먼저 membrane perturbation 시켰을 때, 세포내에 존재하는 P -galactosidase가 세포 외부로 분비되는가의 여부를 조사하였다: 먼저, 시험균주인 Collectorichum fragariae?} {3-galac- tosidase를 생성하는가를 확인하기 위하여, IPTG (Isoproyl- P- D-TDiogalactopyranoside)와 X-gal을 가하여 준 배지에서 배양하여 이를 확인하였다(Rg 10). PME가 세포막 perturbation에 영향을 미치는가를 조사하기 위해 세포를 배양한 후, ONPG(0-Nitrophenyl -D-galactopyranoside)와 세포혼합액 에 증류수, toluene, PME 총 추출물, 소수성 및 친수성분획을 가하여 주었다.
- PME의 친수성분획 은 PME를 10 mM phosphate buffer (pH 7.6) 5배량으로 3회 반복 추출하여 물에 잘 녹는 물질만을 모은 후, 동결건조하고, 1%의 용액이 되게 한 후 사용하였고, 소수성 분획은 PME를 chloroform : MeOH(2 : 1, v/v)의 용액으로 상기한 방법으로 상온에서 추출하고, 그 추출액을 합하여 evaporator로 감압 농축한 후, 동결건조하고, 사용할 때에는 DMSO (dimethyl sulfoxide) 용액으로 잘 현탁하여 사용하였다.
- choleraesuis 및 Bac. cereus의 생육 저해환을 측정 비교하였다. 또한 pH 안정성은 염산이나 수산화나트륨으로 PME의 pH를 3에서 11까지 조정하고 20 μL씩을 채취하여, 배지위에 일정간격으로 위치한 paper disk에 접종한 후, 37°C에서 24시간 배양한다음, 열안정성 과 동일한 방법으로 생육 저해환을 측정.
- PME가 세포막에 미치는 영향을 살펴보기 위하여 먼저 membrane perturbation 시켰을 때, 세포내에 존재하는 P -galactosidase가 세포 외부로 분비되는가의 여부를 조사하였다: 먼저, 시험균주인 Collectorichum fragariae?} {3-galac- tosidase를 생성하는가를 확인하기 위하여, IPTG (Isoproyl- P- D-TDiogalactopyranoside)와 X-gal을 가하여 준 배지에서 배양하여 이를 확인하였다(Rg 10). PME가 세포막 perturbation에 영향을 미치는가를 조사하기 위해 세포를 배양한 후, ONPG(0-Nitrophenyl -D-galactopyranoside)와 세포혼합액 에 증류수, toluene, PME 총 추출물, 소수성 및 친수성분획을 가하여 주었다.
- PME가 세포막 perturbation에 영향을 미치는가를 조사하기 위해 세포를 배양한 후, ONPG(0-Nitrophenyl -D-galactopyranoside)와 세포혼합액 에 증류수, toluene, PME 총 추출물, 소수성 및 친수성분획을 가하여 주었다. β-galactosidase를 생성하는가를 알기 위해 glucose 최소 고체배지 표면에 X-gal (5-bromo-4-chloro- 3-indolyl-B-D-galatoside)을 골고루 도포한 후, 대상 균주 한 백금이를 접종하였다. 24시간이 경과한 후 colony의 색깔을 확인함으로써 Q-galactoside의 존재 여부를 조사하였다.
- extract: 이하 PME라 칭함)의 항균, 항진균 및 항산화 효과가 발표되면서 광범위한 분야에서 탁월한 효과를 나타내고 있다(14). 본인 등도 매실 추출물로부터 항균성 물질로 알려진 citric, malic, acetic 및 p-coumaric acid 등의 유기산을 분석하고, 5-hydroxymethyl furfural, 3-methyul-2, 3-furandione 등의 휘발성 항균성분을 분리.동정한 바 있다(15).
- 항균력 시험은 여러 농도의 PME로 포화시킨 paper disk 를 brain heart infusion agar plate상에 접촉시 켜 공시균주의 증식도를 비교하여 생육저해정도를 측정하는 paper disk 확산법(16)을 이용하였다. 즉 tryptic soy agar의 사면에 배양된 공시균주 1 백금이를 취하여 10 mL tryptic soy broth에 접종하고 30℃에서 24시간 배양한 후, 일정농도로 희석한 후 0.1 mL를 실온에서 하룻밤 건조한 두께가 5~8 mm BHIA 배지 표면에 접종하고 도말봉으로 균일하게 도포한 다음, 멸균된 6 nun filter paper disk(Whatman No.2)를 무처리구인 대조구를 별도로, phosphate buffer로 희석시킨 50 Hg/mL, 100 ug/mL, 250 μg/mL, 500 ug/mL, 및 1, 000 ug/mL 농도의 매실추출물 용액에서 침지 포화시킨 멸균된 6 mm filter paper disk(Whatman No.2)를 BHIA배지위 에 올려놓 고, 30°C에서 48시간동안 배양한 후, disk 주위의 생육저해 의 직경을 측정하여 항균성을 비교하였다.
- 미생물 생육저해농도 측정은 Turbidimetric Assay방법(17) 에 의하여 측정하였다. 즉, PME의 첨가농도별 항균효 과는 미생물의 생육정도를 specttometer(620 nm)로 흡광도를 측정, 비교하고, 천연항균소재인 PME만을 넣은 tryptic soy broth배지를 blank로 사용하였다.
- PME처리가 미생물 세포막의 기능에 미치는 영향을 알아보기 위하여 세포를 파쇄하지 않고, 비교시험구인 toluene과 PME의 존재 시에 Collectotrichum Jragariae2\ P-galac- tosidase가 정량되는가의 여부를 Miller의 방법(20)에 준하여 살펴보았다. 침출액의 {^galactosidase효소 활성을 측정 하여, 증류수를 넣은 경우를 '0'으로 하고 toluene을 넣어준 경우를, 10CT으로 하여, PME가 미생물의 세포막기능에 미치는 영향을 비교하였다.
- 항균력이 뛰어난 PME의 처리로 인한 미생물의 세포형태 및 기능성 변화를 알아보기 위해 투과전자현미경(TEM : Transmission electron microscope, Hitachi H-600) 주사전자현미경 (SEM : Scanning electron microscope, DS-130C ISI ABT)을 이용하여, 각각 Pyliotis(18) 및 Bendayan(19)의 방법에 준하여 처리 전후의 세포 구조를 관찰하였다.
대상 데이터
- 경남지역에서 생산, 재배되고 있는 매실(F/mims mume Sieb. et Zucc.)을 수확기에 구입하여 물로 세척한 다음, 적외선이 장치되어 있는 추출실에서 박피하고 제핵한 후, 과육 부만을 500 g 을 수거하여 60〜70°C의 건조실에서 30-60분 동안 순환식 열풍건조기 를 사용하여 건조시킨 매실의 과육부를 5 °C 저온실에서 분쇄기로 80-320 mesh 크기로 분쇄하여 추출시료로 사용하였다. 추출 시료에 5배량의 물을 첨가하고, 균질기(homogenizer)로 균질화하여 한약 추출기(H-2000, 한일엔지니어링, Korea)에서 3 시간동안 가압 .
- 이 추출여액을 5O°C~6O°C water bath상에서 감압. 농축하고 5°C의 냉장고에서 하룻밤 방치한 후, 원심분리하여 침전된 불순물을 제거하고 상층의 매실과육부 추출물을 모아 실험재료로 사용하였다.
- 본 실험에서 PE 항균력 검색을 위해 사용한 균주들은 일반적으로 곡류가공식품, 낙농가공식품, 육가공식품, 수산가공식품 및 기타 발효식품의 변질에 관여하는 부패미 생물들로서 경상대학교 식품공학 과에서 보관 중이거나 한국종균협회에서 분양받아 실험에 사용하였다. 곰팡이 및 효모는 potato dextrose agar, 세균은 brain heart infusion agar (BHIA), tryptic soy agar (TSA) 등의 사면배지에 계대배양하여 4°C에 보관하면서 사용하였다.
이론/모형
- PME처리가 미생물 세포막의 기능에 미치는 영향을 알아보기 위하여 세포를 파쇄하지 않고, 비교시험구인 toluene과 PME의 존재 시에 Collectotrichum Jragariae2\ P-galac- tosidase가 정량되는가의 여부를 Miller의 방법(20)에 준하여 살펴보았다. 침출액의 {^galactosidase효소 활성을 측정 하여, 증류수를 넣은 경우를 '0'으로 하고 toluene을 넣어준 경우를, 10CT으로 하여, PME가 미생물의 세포막기능에 미치는 영향을 비교하였다.
- 미생물 생육저해농도 측정은 Turbidimetric Assay방법(17) 에 의하여 측정하였다. 즉, PME의 첨가농도별 항균효 과는 미생물의 생육정도를 specttometer(620 nm)로 흡광도를 측정, 비교하고, 천연항균소재인 PME만을 넣은 tryptic soy broth배지를 blank로 사용하였다.
- 항균력 시험은 여러 농도의 PME로 포화시킨 paper disk 를 brain heart infusion agar plate상에 접촉시 켜 공시균주의 증식도를 비교하여 생육저해정도를 측정하는 paper disk 확산법(16)을 이용하였다. 즉 tryptic soy agar의 사면에 배양된 공시균주 1 백금이를 취하여 10 mL tryptic soy broth에 접종하고 30℃에서 24시간 배양한 후, 일정농도로 희석한 후 0.
성능/효과
- 2와 같다. PME 100 ppn 이상의 농도에침지 처리한 paper disk 주위에는 균의 증식이 억제되어 clear zone을 형성함으로써 PME의 항균력을 뚜렷하게 관찰할 수 있었다. PME는 Giam양성균, Gram음성균, 곰팡이 및 효모 등 광범위한 영역의 미생물에 대하여 뚜렷한 생육저해 환을 보여 항균 및 항진균 작용이 우수한 식품보존료로 이용가능성을 확인해 주었다.
- 11에 나타낸 바와 같이, 증류수 를 가해준 대조군에서의 값을 0으로 하고 toluene 을 가하여 준 대조군을 100으로 하였을 때, PME의 총추출물의 경우 72%의 활성이 검출되었다. PME의 소수성 분획은 8%의 활성을 나타내는데 비하여, 친수성 분획은 toluene을 가하여 준 경우보다 더 높은 값을 보여 110%의 활성이 관측되었다. 즉, PME의 친수성 분획은 toluene 보다 세포막을 더 손상시키는 것으로 판단되었다.
- choleraesuis의 생육저해환의 지름은 전처리 온도범위에서 관계없이 생육저해환의 직경이 약 18 mm정도로 일정하였고, Bac. cereus의 경우에도 전처 리온도에 관계없이 약 12 mtn로 일정하여 광범위한 처리온도범위에서 PME 항균성분은 열에 대하여 상당히 안정한 물질임을 알 수 있었다. 아울러, PME 항균성분의 pH 항균성분의 pH안전성은 Fig.
- 6에서 보는 바와 같이 Bac. subrilis 및 E. coli 모두 PME농도 100 yg/mL에서는 뚜렷한 저해효과가 확인되지 않았으나, 그 이상의 농도에서는 PME의 농도가 높아질수록 미생물의 생육이 크게 억제되었다. 즉 250 pg/mL 이상의 PME농도에서는 균의 생육이 급격히 억제되어 48시간 이후 균의 증식이 거의 중지되었다.
- 즉 250 pg/mL 이상의 PME농도에서는 균의 생육이 급격히 억제되어 48시간 이후 균의 증식이 거의 중지되었다. 따라서 실험한 두 균주에 대하여 항균효과를 나타내는 최소생육저해농도는 250 lig/mL으로 사료되 었다.
- 이상의 결과에서 미생물 균체세포에 대한 PMm의 항균작용이 탁월함을 확인할 수 있었다. 따라서, 부패성 및 병원성 균주의오염 가능성이 있는 식품을 PME로 예방 처리 함으로써 변패성 미생물균주 에 의 한 농축수산 식품원료 및 그 가공식품의 변패현상을 억제할 수 있을 것으로 추정되었다.
- 8에서 보는 바와 같이, TEM에 의한 시료촬영결과, PME용액에 처리한 미생물 균 체세포 및 곰팡이 포자는 세포막의 기능이 파괴되어 세포막의 기능이 상실되는 것을 알수 있었고, 세포내용물이 균체 외부로 유출되어 균체의 생육이 억제되었으며, 세포막의 삼투조절기능의 상실로 인하여 세포내용이 빈 ghost형태의 사멸균체수가 증가함을 알 수 있었다. 또한, Fig. 9어서 보는 바오) 같이, SEM에 의한 시료 촬영결과에서도 PME처리로 미생물 균체가 세포벽 또는 세포막 파괴로 인하여 세포형태 의 변화가 뚜렷하게 관찰되었다. 이상의 결과에서 미생물 균체세포에 대한 PMm의 항균작용이 탁월함을 확인할 수 있었다.
- 매실추출물의 항균력을 조사한 결과, 250 ug/mL 이상의 농도에서 뚜렷한 항균활성을 보였고, 광역의 병원성 및 부패성 미생물들에 대하여 항균활성을 나타내었다. 또한, 매 실추출물의 항균물질은 넓은 범위의 온도(40〜120°C) 및 pH(3〜11)에서 안정성을 나타냈다. 따라서 매실추출물의 항균물질은 항균활성이 높고, 항균 spectrum이 광범위 할 뿐아니라, 넓은 범위의 온도 및 pH에 안정하여 이상적인 천연 항균제로서의 개발가능성을 제시하였다.
- 매실추출물의 항균력을 조사한 결과, 250 ug/mL 이상의 농도에서 뚜렷한 항균활성을 보였고, 광역의 병원성 및 부패성 미생물들에 대하여 항균활성을 나타내었다. 또한, 매 실추출물의 항균물질은 넓은 범위의 온도(40〜120°C) 및 pH(3〜11)에서 안정성을 나타냈다.
- 아울러, 매 실추출물의 항균작용을 조사한 결과, 매실추출물에는 두 종류 이상의 항균물질이 존재하며 이 물질들의 상승작용으로 항균활성을 나타냄을 확인하였다. 매실추출물의 항균활성은 친수성 성분임을 확인하였으며, 항균물질의 주요 작용기작은 세포막 perturbation0]] 기인한 것으로 사료되었다.
- 따라서 매실추출물의 항균물질은 항균활성이 높고, 항균 spectrum이 광범위 할 뿐아니라, 넓은 범위의 온도 및 pH에 안정하여 이상적인 천연 항균제로서의 개발가능성을 제시하였다. 아울러, 매 실추출물의 항균작용을 조사한 결과, 매실추출물에는 두 종류 이상의 항균물질이 존재하며 이 물질들의 상승작용으로 항균활성을 나타냄을 확인하였다. 매실추출물의 항균활성은 친수성 성분임을 확인하였으며, 항균물질의 주요 작용기작은 세포막 perturbation0]] 기인한 것으로 사료되었다.
- 9)와도 일치한다. 이상의 결과로, PME의 항균활성 물질은 친수성 인 component에 기인한다는 것을 알았으며, 그 물질의 주요 항균작용은 세포의 membrane perturbation에 기인한 것으로 사료되었다.
- cerews 의 경우, 생육저해환의 지름은 약 15 mm정도 로 전처리 pH에 관계없이 일정하게 나타나 PME의 항균활 성물질은 넓은 pH범위 에서 안정하였다. 이상의 결과를 요약하면 PME의 항균성분은 넓은 온도 범위(40〜120°C)와 pH범위(pH 3〜11)에서 동일한 생육 저해환을 보여 광범위한 영역의 식품원료 및 가공식품에 대해서 PME처리로 뚜렷한 항균효과 및 저장효과를 기대할 수 있었다.
- 9어서 보는 바오) 같이, SEM에 의한 시료 촬영결과에서도 PME처리로 미생물 균체가 세포벽 또는 세포막 파괴로 인하여 세포형태 의 변화가 뚜렷하게 관찰되었다. 이상의 결과에서 미생물 균체세포에 대한 PMm의 항균작용이 탁월함을 확인할 수 있었다. 따라서, 부패성 및 병원성 균주의오염 가능성이 있는 식품을 PME로 예방 처리 함으로써 변패성 미생물균주 에 의 한 농축수산 식품원료 및 그 가공식품의 변패현상을 억제할 수 있을 것으로 추정되었다.
- coli 모두 PME농도 100 yg/mL에서는 뚜렷한 저해효과가 확인되지 않았으나, 그 이상의 농도에서는 PME의 농도가 높아질수록 미생물의 생육이 크게 억제되었다. 즉 250 pg/mL 이상의 PME농도에서는 균의 생육이 급격히 억제되어 48시간 이후 균의 증식이 거의 중지되었다. 따라서 실험한 두 균주에 대하여 항균효과를 나타내는 최소생육저해농도는 250 lig/mL으로 사료되 었다.
- 9와 같다. 즉, Fig. 7및 Fig. 8에서 보는 바와 같이, TEM에 의한 시료촬영결과, PME용액에 처리한 미생물 균 체세포 및 곰팡이 포자는 세포막의 기능이 파괴되어 세포막의 기능이 상실되는 것을 알수 있었고, 세포내용물이 균체 외부로 유출되어 균체의 생육이 억제되었으며, 세포막의 삼투조절기능의 상실로 인하여 세포내용이 빈 ghost형태의 사멸균체수가 증가함을 알 수 있었다. 또한, Fig.
- PME의 소수성 분획은 8%의 활성을 나타내는데 비하여, 친수성 분획은 toluene을 가하여 준 경우보다 더 높은 값을 보여 110%의 활성이 관측되었다. 즉, PME의 친수성 분획은 toluene 보다 세포막을 더 손상시키는 것으로 판단되었다. 이러한 결과는 전자현미경 을 이용한 미생물 세포조직 및 세포형태 변화 실험에서 세포막이 손상을 받았다는 실험 결과(Fig.
후속연구
- 24시간이 경과한 후 colony의 색깔을 확인함으로써 Q-galactoside의 존재 여부를 조사하였다. 측정하고자 하는 효소 ^galactosidase는 균체내에 존재하므로 PME가 세포막에 영향을 주지 않는다면, 증류수를 가하여 준 negative 대조군에서처 럼 ^galactosidase의 활성을 나타내지 않으며, 이와는 반대로 세포막에 영향을 주어 세포막이 손상을 받아 Q-galactisidase가 세포 밖으로 유출이 되면, toluene을 가하여 준 positive 대조군에서처 럼 효소 활성이 검출될 것이다. Fig.
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