[논문]매실추출물로부터 항균물질의 분리 및 구조동정

박우포; 이승철; 김성용; 최성길; 허호진; 조성환

매실추출물로부터 항균물질의 분리 및 구조동정
Separation and Identification of Antimicrobial Substances from Prunus mume extract 원문보기

한국식품저장유통학회지 = Korean journal of food preservation, v.15 no.6, 2008년, pp.878 - 883

박우포 (마산대학 식품과학부) , 이승철 (경남대학교 식품생명학과) , 김성용 (경상대학교 농업경제학과) , 최성길 (경상대학교 식품공학과.농업생명과학연구원) , 허호진 (경상대학교 식품공학과.농업생명과학연구원) , 조성환 (경상대학교 식품공학과.농업생명과학연구원)

초록
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항균력이 탁월한 매실추출물로부터 항균활성물질을 column chromatography를 이용하여 순수하게 분리하고, nuclear magnetic resonance (NMR) spectrophtometer 측정기에 의하여 항균활성물질의 화학구조를 다음과 같이 분리 동정하였다. 즉, 매실추출물을 상온에서 메탄올에 현탁한 후, ethyl ether, ethyl acetate, n-butanol로 각각 분배 추출하여 각 용매의 수용성 추출물을 획득하였다. 각 용매의 수용성 추출물을 loading한 후, silica gel(70-230 mesh, Merck) column chromatography하여 소획분을 얻었다. 분리된 분획 중 항균력이 있는 소획분을 Sephadex LH 20을 충진하고 column chromatography하여 각 항균분획물질을 분리하였다. column chromatography에서 분리한 각 항균분획물질(Compound A, Compound B, Compound C)의 구조분석을 위해 $^{1}H$ 및 $^{13}C$ NMR 스펙트럼을 실온에서 측정하였다. NMR은 Bruker DRX500 (500MHz)을 이용하여 측정하였으며, 용매와 기준물질은 $CDCl_3$와 TMS를 각각 사용하였다. 이와같이 분리한 각 항균분획물질을 NMR 분석법으로 동정한 결과, isoeugenol, nomilin 및 $\beta$-sitosterol 등으로 확인되었다.

Abstract ▼ AI-Helper

Prunus mume was extracted using various solvents including ethyl ether, ethyl acetate and n-butanol. The extracts were fractionated by column chromatography. Antimicrobial compounds (A, B and C) in fractions showing antimicrobial activity were purified by Sephadex LH 20 column chromatography, and id...

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

그러나, 많은 연구결과를 통하여 매실추출물의 기능성이 발표되고 있으나, 아직까지 매실추출물의 항균활성물질이 무엇이며 어떠한 기작에 의해 항균기능을 가지는 지에 관한 기초연구는 거의 이루어져 있지 않다. 이러한 연구 상황 속에서 본 연구의 목표는 매실추출물의 항균물질을 분리하고 그 성분들의 구조를 동정하여, 매실추출물의 기능성 구명을 위한 기초자료를 획득하였기에 보고하고자 한다.

제안 방법

ethyl acetate 분획물을 silica gel (70-230 mesh, Merck) column chromatography (CHCl3/MeOH=98:2 ->70:30, gradient)하여 4 개의 소획분(FA1∼FA4)을 얻었다.
ethyl ether 분획물 silica gel(70-230 mesh, Merck) column chromatography (petrcleum ether/ ethylacetate=99:1->80:20, gradient)하여 4 개의 소획분(FE1∼FE4)을 얻었다.
n-butanol 분획물을 silica gel (70-230 mesh, Merck) column chromatography (n-butanol/ethyl acetate=99;1->80;20, gradient)하여 3 개의 소획분(FB1∼FB3)을 얻었다.
또한, ethyl acetate 분획물을 silica gel(70-230 mesh, Merck) column chromatography( CHCL3/MeOH=98 : 2 → 70 : 30, gradient)하여 4개의 소획분(FA1∼FA4)을 얻었다(Fig. 2).
먼저, ethyl ether추출물을 loading한 후, silica gel(70-230 mesh, Merck) column chromatography(petroleum ether/ethyl acetate=99 : 1 → 80 : 20, gradient)하여 4개의 소획분 (FE1∼FE4)을 얻었다(Fig. 1).
분리된 분획 중 항균력이 있는 소분획 FA3을 Sephadex LH 20을 사용한 column chromatography (CHCl₃/MeOH=10:90)하여 Compound C를 분리하였다. 분리된 Compound A, B 및 C의 구조분석을 위해 ¹H- 및 ¹³C- NMR 스펙트럼을 실온에서 측정하여 항균활성물질을 동정하였다. 기기로는 Bruker DRX500 (500 MHz, Germany)를 사용하였으며 TMS(Trimethyl silane : Cambridge isotope laboratory, Inc.
ethyl acetate 분획물을 silica gel (70-230 mesh, Merck) column chromatography (CHCl₃/MeOH=98:2 ->70:30, gradient)하여 4 개의 소획분(FA₁∼FA₄)을 얻었다. 분리된 분획 중 항균력이 있는 소분획 FA3을 Sephadex LH 20을 사용한 column chromatography (CHCl₃/MeOH=10:90)하여 Compound B를 분리하였다. n-butanol 분획물을 silica gel (70-230 mesh, Merck) column chromatography (n-butanol/ethyl acetate=99;1->80;20, gradient)하여 3 개의 소획분(FB1∼FB3)을 얻었다.
n-butanol 분획물을 silica gel (70-230 mesh, Merck) column chromatography (n-butanol/ethyl acetate=99;1->80;20, gradient)하여 3 개의 소획분(FB1∼FB3)을 얻었다. 분리된 분획 중 항균력이 있는 소분획 FA3을 Sephadex LH 20을 사용한 column chromatography (CHCl₃/MeOH=10:90)하여 Compound C를 분리하였다. 분리된 Compound A, B 및 C의 구조분석을 위해 ¹H- 및 ¹³C- NMR 스펙트럼을 실온에서 측정하여 항균활성물질을 동정하였다.
2). 분리된 분획 중 항균력이 있는 소획분 FA3을 Sephadex LH20을 충진하고 column chromatography (CHCL₃/MeOH=10 : 90)하여 Compound B를 분리하였다. 아울러, n-butanol 분획물을 silica gel(70-230 mesh, Merck) column chromatography(n-butanol/ethyl acetate = 99 : 1 → 80 : 20, gradient)하여, 3개의 소획분(FB1∼FB3)을 얻었다(Fig.
ethyl ether 분획물 silica gel(70-230 mesh, Merck) column chromatography (petrcleum ether/ ethylacetate=99:1->80:20, gradient)하여 4 개의 소획분(FE1∼FE4)을 얻었다. 분리된 분획 중 항균력이 있는 소획분 FE3을 Sephadex LH 20을 사용한 column chromatography (CHCl₃/MeOH=30:70)하여 Compound A를 분리 하였다. ethyl acetate 분획물을 silica gel (70-230 mesh, Merck) column chromatography (CHCl₃/MeOH=98:2 ->70:30, gradient)하여 4 개의 소획분(FA₁∼FA₄)을 얻었다.
1). 분리된 분획 중 항균력이 있는 소획분 FE3을 Sephadex LH 20을 충진하고 column chromatography(CHCL3/MeOH=30 : 70)하여 Compound A를 분리하였다. 또한, ethyl acetate 분획물을 silica gel(70-230 mesh, Merck) column chromatography( CHCL₃/MeOH=98 : 2 → 70 : 30, gradient)하여 4개의 소획분(FA₁∼FA₄)을 얻었다(Fig.
3). 분리된 분획 중항균력이 있는 소획분 FB3을 Sephadex LH 20을 충진하고, column chromatography(CHCL₃/MeOH=30 : 70)하여 Compound C를 분리하였다.
아울러, Fig. 9에서 보는 바와 같이, Compound C의 13C-NMR 스펙트럼으로부터 모든 특성 공명선의 해석이 다음과 같이 가능하여 본 시료가 β-sitosterol임을 규명하였다.
아울러, n-butanol 분획물을 silica gel(70-230 mesh, Merck) column chromatography(n-butanol/ethyl acetate = 99 : 1 → 80 : 20, gradient)하여, 3개의 소획분(FB1∼FB3)을 얻었다(Fig. 3).
즉, syrup 상인 매실추출물 100 g을 상온에서 메탄올 300 mL로 3 회 추출하여 메탄올 추출물을 얻었다. 이 추출물을 증류수 300 mL에 현탁한 후, ethyl ether, ethyl acetate, n-butanol 순서로 각각 3 회씩 추출 및 분획하여 ethyl ether 분획물, ethyl acetate 분획물, n-butanol 분획물을 얻었다. ethyl ether 분획물 silica gel(70-230 mesh, Merck) column chromatography (petrcleum ether/ ethylacetate=99:1->80:20, gradient)하여 4 개의 소획분(FE1∼FE4)을 얻었다.
75% BHIA 10 mL에 첨가하여 petri dish에 고르게 부었다. 잘 굳힌 후 표면에 paper disk(thick, 지름 10 mm)를 얹고, 무처리한 대조구와 함께 나머지 paper disk에 매실추출물의 추출용매별 항균성이 높은 일정농도(250 mg/disk)의 column chromatography분획물을 각각 첨가한 후, 30℃에서 48 시간동안 배양한 후, disk 주위의 생육저해의 직경을 측정하여 항균성을 비교하였다.
전술한 결과에서와 같이, column chromatography에서 분리한 각 항균분획물질(Compound A, Compound B, Compound C)의 구조분석을 위해 ¹H 및 ¹³C NMR 스펙트럼을 실온에서 측정하였다. Fig.
항균력이 탁월한 매실추출물로부터 항균활성물질을 column chromatography를 이용하여 순수하게 분리하여 얻어진 결과는 다음과 같다. 즉, 매실추출물 100 g씩을 상온에서 메탄올 300 mL에 현탁한 후, ethyl ether, ethyl acetate, n-butanol로 각각 3회씩 분배․추출하여 ethyl ether 분획물, ethyl acetate 분획물, n-butanol 분획물을 획득하였다. 먼저, ethyl ether추출물을 loading한 후, silica gel(70-230 mesh, Merck) column chromatography(petroleum ether/ethyl acetate=99 : 1 → 80 : 20, gradient)하여 4개의 소획분 (FE₁∼FE₄)을 얻었다(Fig.
추출 시료에 5 배량의 물을 첨가하고, 균질기(homogenizer)로 균질화하여 한약추출기 (H-2000, 한일엔지니어링, Korea)에서 3 시간동안 가압 · 침출시킨 후, 여과하여 1 차 추출하고 , 다시 잔사에 5 배량의 물을 가하여 상기와 동일한 방법으로 2 차 추출한 후, 추출액을 합하여 여과지 Whatman No.2로 여과하였다.
항균력이 탁월한 매실추출물로부터 항균활성물질을 column chromatography를 이용하여 순수하게 분리하고, nuclear magnetic resonance (NMR) spectrophotometer 측정기에 의하여 항균활성물질의 화학구조를 다음과 같이 분리 · 동정하였다.

대상 데이터

경남지역 생산지에서 구입하여 저온저장실에 저장한 매실을 물로 세척한 다음, 적외선이 장치되어 있는 추출실에서 박피하고 제핵한 후, 과육부만을 500 g 을 수거하여 60～70℃의 건조실에서 30～60 분 동안 순환식 열풍건조기를 사용하여 건조시킨 매실의 과육부를 5℃ 저온실에서 분쇄기로 80～320 mesh 크기로 분쇄하여 추출시료로 사용하였다. 추출 시료에 5 배량의 물을 첨가하고, 균질기(homogenizer)로 균질화하여 한약추출기 (H-2000, 한일엔지니어링, Korea)에서 3 시간동안 가압 · 침출시킨 후, 여과하여 1 차 추출하고 , 다시 잔사에 5 배량의 물을 가하여 상기와 동일한 방법으로 2 차 추출한 후, 추출액을 합하여 여과지 Whatman No.
분리된 Compound A, B 및 C의 구조분석을 위해 ¹H- 및 ¹³C- NMR 스펙트럼을 실온에서 측정하여 항균활성물질을 동정하였다. 기기로는 Bruker DRX500 (500 MHz, Germany)를 사용하였으며 TMS(Trimethyl silane : Cambridge isotope laboratory, Inc., USA)를 기준물질로 사용하였다.
본 실험에서 매실추출물의 항균력 검색을 위해 사용한 균주들은 일반적으로 곡류가공식품, 낙농가공식품, 육가공식품, 수산가공식품 및 기타 발효식품의 변질에 관여하는 부패미생물들로서 경상대학교 식품공학과에서 보관중이거나 한국종균협회에서 분양받아 실험에 사용하였다. 이때 사용한 공시균주인 Fusarium sp.
실험에 사용한 청매실(Prunus mume Sieb. et Zucc.)은 경남 악양면에서 재배, 생산되고 있는 매실을, 2004년 3월에 직접 생산지에서 구입하여 2∼5℃로 유지되는 저온저장실에 저장하면서 실험재료로 이용하였다.
이 추출여액을 50℃～60℃ water bath상에서 감압 · 농축하고 5℃의 냉장고에서 하룻밤 방치한 후, 원심분리하여 침전된 불순물을 제거하고 상층의 매실과육부추출물을 모아 실험재료로 사용하였다.

이론/모형

항균력 시험은 매실추출물 분획물로 포화시킨 paper disk를 배지상에 접촉시켜, 앞에서 기술한 부패균주를 공시균주로 하여, 공시균주의 증식도를 비교하여 생육저해정도를 측정하는 paper disk 확산법(15)을 이용하였다. 즉, 각 공시균주의 한 백금이를 따서, 10 mL nutrient rich 액체 배지에서 24시간 배양한 후, 이중 0.

성능/효과

80μg/mL에서 나타났다. 아울러, Fig. 5에서 보는 바와 같이, Compound A의 모든 탄소 공명선은 잘 해석이 가능해 1H-NMR의 해석 결과와 동일하게 isoeugenol으로 규명되었다. 즉, 두종류의 메틸탄소 (1, 10)은 각각 18.
39 μg/mL에서 2H 면적의 단일선으로 나타났다. 아울러, Fig. 7에서 보는 바와 같이, Compound B의 탄소 공명선은 잘 해석되어져 1H-NMR의 해석 결과와 동일하게 nomilin으로 규명되었다. 즉, 4종류의 카르보닐 탄소 (13, 5, 22, 2)가 각각206.
이와같이 분리된 Compound A(FE₃), Compound B(FA₃) 및 Compound C(FE₃)의 세균 및 효모에 대한 항균력을 측정하기 위하여 이들 분획물을 BHIA plate상에 위치한 paper disk상에 분주하고, 공시균주의 증식도를 비교하여 생육저해정도를 측정하는 disk확산법을 실시한 결과, Table 1에서 보는 바와 같이, Compound A(FE₃), B(FA₃) 및 C(FB₃) 모두 뚜렷한 생육저해환을 나타내고 있어 항균력이 있는 것으로 확인되었다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	매실 가공산업의 과학화를 촉진하게된 배경은 무엇인가?	특히, 기능성 식품소재의 중요성이 부각되면서 매실추출물의 기능적 특성 및 활용 범위가 확대되어 가고 있다. 매실추출물의 항산화성(1-3) 및 항균성(4,5)이 연구, 발표되면서 매실 가공산업의 과학화를 촉진하고 있다. 본 연구진에서도 휘발성분(6), 항균특성(7-9), 가공산업의 응용 가능성(10-12) 및 매실가공식품에 대한 소비자의 구매 형태 및 선호도 분석(13,14)을 수행하여 발표한 바 있다.
	실험에 사용한 청매실은 어디에서 재배되었는가?	et Zucc.)은 경남 악양면에서 재배, 생산되고 있는 매실을, 2004년 3월에 직접 생산지에서 구입하여 2∼5℃로 유지되는 저온저장실에 저장하면서 실험재료로 이용하였다.
	매실추출물의 항균력 검색을 위해 사용한 균주는 무엇인가?	본 실험에서 매실추출물의 항균력 검색을 위해 사용한 균주들은 일반적으로 곡류가공식품, 낙농가공식품, 육가공식품, 수산가공식품 및 기타 발효식품의 변질에 관여하는 부패미생물들로서 경상대학교 식품공학과에서 보관중이거나 한국종균협회에서 분양받아 실험에 사용하였다. 이때 사용한 공시균주인 Fusarium sp.와 Candida albicans는 potato dextrose agar, Bacillus cereus와 Escherichia coli는 각각 brain heart infusion agar(BHIA)와 tryptic soy agar(TSA) 등의 사면배지에 계대배양하여 4℃에 보관하면서 사용하였다.

참고문헌 (15)

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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