[논문]식물의 초경량 조직을 이용한 미토콘드리아의 DNA와 RNA 정제

김경민; 임용숙; 신동일; 설일환

doi:10.5352/jls.2006.16.2.240

[국내논문] 식물의 초경량 조직을 이용한 미토콘드리아의 DNA와 RNA 정제
Development of a Highly Efficient Isolation Protocol for Mitochondrial DNA and RNA Using Small Scale Plant Tissues 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.16 no.2 = no.75, 2006년, pp.240 - 244

김경민 (상주대학교 생명자원과학대학 환경원예학과) , 임용숙 (대구외국어대학교 생명공학부) , 신동일 (대구가톨릭대학교 자연대학 생명자원학부) , 설일환 (대구외국어대학교 생명공학부)

초록
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본 실험에서는 토마토의 종자를 기내 배양하여 얻어진 1g 이하의 무균 잎 조직을 이용하여 미토콘드리아를 분리 정제하여 MitoTracker를 이용하여 세포생물학적으로 확인하였고, 이들의 mt를 이용하여 미토콘드리아 DNA와 RNA를 추출과 검정을 하였다. 또한 고농도의 이온성을 이용하여 미토콘드리아와 mtDNA 및 mtRNA을 추출할 수 있었으며, 식물의 여러 종류에도 사용되어질 수 있을 것이다. mtDNA는 PCR 분석에 의하여 plastid DNA와 혼재되어 있지 않음을 확인하였다. mtRNA는 RT-PCR 분석을 통하여 plastid RNA와 흔재되어 있지 않음을 확인할 수 있었다.

Abstract ▼ AI-Helper

We present a fast and simple protocol for purification of mitochondria, mitochondrial DNA, and RNA from small amounts of tomato leaves. This method uses a high ionic strength medium to isolate mitochondria and extract mitochondrial DNA and RNA from a single preparation and is easily adaptable to other plant species. Mitochondria was confirmed by MitoTracker. The mitochondrial DNA was not contaminated by plastid DNA, was successfully used for PCR. Similarly, the isolated mitochondrial RNA was not contaminated only slightly contaminated (leaves) by plastid RNA. RNA prepared according to our method was acceptable for RT-PCR analysis

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

최근에 Scotti 등[9]이 감자의 조직을 이용하여 식물의 mtDNA 뿐만 아니라mtRNA을 추출한 한 바 있으나, 재료로 사용하는 양이 많아 기내 또는 lg 이하의 재료일 경우 효과적이지 못한 실정이다. 따라서 본 실험에서는 토마토의 종자를 기내 배양하여 얻어진 무균잎조직 1응 이하의 양을 이용하여, mt 추출 과정 을 확인하는 방법과 mtDNA와 mtRNA 추출의 과정을 제시하고자 한다. 또한 지금까지 식물의 mt에 대한 분자생물학 연구의 기초자료로 제시하고자 한다.
따라서 본 실험에서는 토마토의 종자를 기내 배양하여 얻어진 무균잎조직 1응 이하의 양을 이용하여, mt 추출 과정 을 확인하는 방법과 mtDNA와 mtRNA 추출의 과정을 제시하고자 한다. 또한 지금까지 식물의 mt에 대한 분자생물학 연구의 기초자료로 제시하고자 한다.

제안 방법

0), 1 mM EDTA, TE-saturated phenol/chloroform (50:50), Water-saturated phenol/chloroform/isoamyl alco hol (50:49:1). 10.mg/mL RNase A, RNA extraction buffer (4 M Guanidine thiocyanate, 25 mM Sodium citrate (pH 7.0), 0.5% sarcosyl, 0.1% p-mercaptoethanol), 4 M LiCl등의 시으¥을 만들어 이용하였다.
각각의 어린 잎을 채취하여 mitochodria (mt) 분리와 mtDNA 추출은 Scotti 등[9] 방법을 응용하였고, mtRNA의 추출은 Chomeczynski 와 Sacchi [2]의 방법을 응용하여 아래와 같이 수행하였다. Homogenization buffer A (50 mM Tris-HCl (pH 8.
식물의 재료는 원예시험장에서 분주받은 토마토의 종자를 이용하였다. 무균의 잎을 얻기 위하여 각각의 종자를 1% NaOCl에 30분과 70% 알콜에 30초로 소독한 다음 멸균수로 3회 수선하여, 토마토는 MS 기본 배지[6]에 0.1 mg/L BA와 0.35 mg/L IAA 그리고 30 g/L sucrose, 8 옹/L agar를 넣어 만든 배지를 30ml씩 배양병(0 15 cm)에 넣고 26±1℃에서 30일간 배양하였다.
본 실험에서는 토마토의 종자를 기내 배양하여 얻어진 1 g 이하의 무균 잎 조직을 이용하여 미토콘드리아를 분리 정제하여 MitoTracker를 이용하여 세포생물학적으로 확인하였고, 이들의 mt를 이용하여 미토콘드리아 DNA와 RNA를 추출과 검정을 하였다. 또한 고농도의 이온성을 이용하여 미토콘드리아와 mtDNA 및 mtRNA을 추출할 수 있었으며, 식물의 여러 종류에도 사용되어질 수 있을 것이다.
추출한 mtRNA는 mtDNA에서 PCR을 수행한 결과 중 가장 band가 확실한 것을 이용하여 RT-PCR (AccessQuickTM RT-PCR System, Promega)을 수행하여 mtRNA인을 확인하였다. RT-PCR의 PCR 조건은 94°C에 2분간 predenatuTation 을 하였고/ denaturation은 95°C에 5초간, annealing은 55°C 에 2。초간 polymerization은 72°C 에서 1。초간 3。회 실시하고 final extension^ 72°C 7분간 수행 후 0.
토마토의 잎에서 분리 정제한mt임을 확인하기 위하여 mt를 염색하는 MitoTracker (Molecular Probes)를 이용하였다 추출한 mtDNA는 mt와 관련된 유전자의 PCR primer를 만들어 PCR을 수행하여 mtDNA임을 확인하였다.

대상 데이터

4% BSA. 0.1% cysteine 과 56 mM Q-mercaptoethanol)를 신선한 잎을 채취하여 호모게나제이션 할 때 이용하였다. Lysis buffer (25 mM Tris-HCl (pH 8.
식물의 재료는 원예시험장에서 분주받은 토마토의 종자를 이용하였다. 무균의 잎을 얻기 위하여 각각의 종자를 1% NaOCl에 30분과 70% 알콜에 30초로 소독한 다음 멸균수로 3회 수선하여, 토마토는 MS 기본 배지[6]에 0.

성능/효과

16, 000 rpm으로 20분 처리하고 상 등액을 버린다. 20 ul의 멸균수를 넣고 0.8% 아가 로즈젤에 전 기영동하여 mtDNA임을 확인하였다. Fig.
4B와 같이 1, 2, 4, 5, 6번의 PCR primer 조합에서 증폭된 밴드를 확인할 수 있었으며, 특히 2, 4, 5번은 밴드 증폭 양상이 아주 깨끗하였다. Bookjans 등[1]이 보고한 고이온성 재배지에서 분리한mtDNA와 Perez 등[8]이 발표한 해바라기 및 Hsu와 Mullin[4]이 보고한 목화 유묘기의 mtDNA 추출에 이용된 많은 양의 시료를 이용하여 Southern 분석으로 mtDNA임을 확인하였는데, 본 실험에서는 PCR에 의하여 mtDNA임을 확인하여 Southern 분석에 의한 실험 절차의 복잡함을 간소화할 수 있었다.
mtDNA는 PCR 분석에 의하여 plastid DNA와 혼재되어 있지 않음을 확인하였다. mtRNA는 RT-PCR 분석을 통하여 plastid RNA 와 혼재되어 있지 않음을 확인할 수 있었다.
2), 600 mg 과 900mg의 토마토의 잎으로부터 추출한 mt가 든 16ml 튜브를 3등분하여 아세토카민과 MitoTracker®를 염색한 바, 분리한 mt는 90% 이상 (아세토카민염색과 MitoTracker® 염색세포수와 차이) 세포가 건전한 mt로 추출할 수가 있었으며, 또한 듀브 내에 전 층이 mt가 존재해 있음을 확인하였다. 따라서 본 실험의 protocol 중 10분간 3, 900 rpm에서 2번하여 상등액을 모두 모아서, 15분간 12z000 rpm 원심한 튜브 내의 하층부위는 모두 mt임을 추정할 수 있다. 이는 Scotti 등[9]이 이용하여 얻어진mt의 확인 방법을 mtDNA와 mtRNA에서 확인한 것보다 MitoTracker®로 염색함으로 그 다음 단계인 mtDNA 추출 과정을 보다 확신을 가져줌으로써 mt에 관한 실험의 효율을 향상시킬 수가 있다고 생각된다.
6에서 PCR primer 2 번으로 RT-PCR 하여 얻어진 band로 하였다. 본 실험에서 추출된 mtRNA의 검정 방법을 RT-PCR에 의하여 수행하여 얻어진 결과는, Scotti 등[9]에 의하여 mtRNA 검정 방법을 Northern 분석으로 수행한 결과와 동일하게 mtRNA임을 확인 할 수 있었다.
따라서 본 실험의 protocol 중 10분간 3, 900 rpm에서 2번하여 상등액을 모두 모아서, 15분간 12z000 rpm 원심한 튜브 내의 하층부위는 모두 mt임을 추정할 수 있다. 이는 Scotti 등[9]이 이용하여 얻어진mt의 확인 방법을 mtDNA와 mtRNA에서 확인한 것보다 MitoTracker®로 염색함으로 그 다음 단계인 mtDNA 추출 과정을 보다 확신을 가져줌으로써 mt에 관한 실험의 효율을 향상시킬 수가 있다고 생각된다.
토마토 의 무균 배양한 잎으로부터 분리한 미토콘드리아에 아세토카민과 MitoTracker®로 염색한 결과(Fig. 2), 600 mg 과 900mg의 토마토의 잎으로부터 추출한 mt가 든 16ml 튜브를 3등분하여 아세토카민과 MitoTracker®를 염색한 바, 분리한 mt는 90% 이상 (아세토카민염색과 MitoTracker® 염색세포수와 차이) 세포가 건전한 mt로 추출할 수가 있었으며, 또한 듀브 내에 전 층이 mt가 존재해 있음을 확인하였다. 따라서 본 실험의 protocol 중 10분간 3, 900 rpm에서 2번하여 상등액을 모두 모아서, 15분간 12z000 rpm 원심한 튜브 내의 하층부위는 모두 mt임을 추정할 수 있다.

후속연구

본 실험에서는 토마토의 종자를 기내 배양하여 얻어진 1 g 이하의 무균 잎 조직을 이용하여 미토콘드리아를 분리 정제하여 MitoTracker를 이용하여 세포생물학적으로 확인하였고, 이들의 mt를 이용하여 미토콘드리아 DNA와 RNA를 추출과 검정을 하였다. 또한 고농도의 이온성을 이용하여 미토콘드리아와 mtDNA 및 mtRNA을 추출할 수 있었으며, 식물의 여러 종류에도 사용되어질 수 있을 것이다. mtDNA는 PCR 분석에 의하여 plastid DNA와 혼재되어 있지 않음을 확인하였다.

참고문헌 (11)

Bookjans, G., B. M. Stummann and K. W. Henningsen. 1984. Preparation of chloroplast DNA from pea plastids isolated in a medium of high ionic strength. Anal. Biochem. 141, 244-247

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Chomeczynski, P. and N. Sacchi. 1987. Single-step method of RNA isolation by acid guanidium thiocyanate phenol chloroform extraction. Anal. Bichem. 162, 156-159
Douce, R., J. Bourguignon, R. Brouquisse and M. Neuburger. 1987. Isolation of plant mitochondria: general principles and criteria of integrity. Meth. Enzymol. 148, 403-415
Hsu, C. I. and B. C. Mullin. 1988. A new protocol for isolated of mitochondria DNA from cotton seedlings. Plant Cell Reports 7, 356-360

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Kemble, R. J. 1987. A rapid single leaf, nucleic acid and assay for determining the cytoplasmic organelle complement of rapeseed and related Brassica species. Theor. Appl. Genet. 73, 451-458

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Murashige, T. and F. Skoog. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant 15, 473-497

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Pehu, E. 1991. RFLP analysis of organellar genomes in somatic bybrids. In: Plant Tissue Culture Manual D6, pp. 1-8, Kluwer Academic Publishers, The Netherlands
Perez, C., J. F. Bonavent and A. Berville. 1990. Preparation of mitochondrial DNAs from sunflowers (Helianthus annuus L.) using a medium with high ionic strength. Plant Mol. Biol. Reptr. 8, 104-113

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Scotti, N., T. Cardi and L. Marechal-Drouard. 2001. Mitochondrial DNA and RNA isolation from small amounts of potato tissue. Plant Molecular Biology Reports 19, 67a-67h

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Triboush, S., N. G. Danilenko and O. G. Davydenko. 1998. A method for isolation of chloroplast DNA and mitochondrial DNA from sunflower. Plant Mol. Biol. Reptr. 16, 183-189

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Wilson, A. J. and P. S. Chourey. 1984. A rapid inexpensive method for the isolation of restrictable mitochondrial DNA from various plant sources. Plant Cell Rep. 3, 237-242

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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