[논문]신경전달물질 방출 저해제 FS11052가 신경세포와 PC12 세포의 돌기신장에 미치는 영향

이윤식; 김동섭

doi:10.5352/jls.2006.16.2.315

[국내논문] 신경전달물질 방출 저해제 FS11052가 신경세포와 PC12 세포의 돌기신장에 미치는 영향
Effect of FS11052, an Inhibitor of Exocytosis, on Neurite Extension in Rat Hippocampal Neurons and PC12 Cells 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.16 no.2 = no.75, 2006년, pp.315 - 322

이윤식 (한양대학교 의과대학 약리학교실) , 김동섭 (부산대학교 생명자원과학대학 생명응용과학부)

초록
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신경세포 간 정보교환이 이루어지고 있는 신경전달물질의 방출과정은 극히 복잡하여, 이 방면의 독창적인 연구를 수행하기 위해서는 신규작용을 갖는 특이적인 저분자 probe의 탐색은 필수적이다. PC12세포에 tritium-label된 norepinephrine ($[^3H]-NE$)을 incorporation시킨 후에 60 mM의 고농도의 $K^+$의 자극에 의해서 탈분극 후에 방출되는 $[^3H]-NE$의 양을 scintillation countering하여 생리 활성 물질을 탐색하기 위한 in vitro의 실험계를 세웠다. 이 탐색계를 이용하여 곰팡이, 방선균와 박테리아의 대사산물 1만 1000여 샘플을 탐색한 결과, PC12세포에서 고농도의 $K^+$의 자극에 의해서 탈분극 후에 유도되는 $[^3H]-NE$의 방출을 효과적으로 저해하는 FS11052를 방선균 유래의 대사산물로부터 얻었다. FS11052는 또한 PC12세포와 rat cortical neurons에서 동일한 고농도의 $K^+$의 자극에 의한 탈분극 후에 유도되는 신경전달 물질로서 ATP의 방출에도 유의한 저해효과를 나타냈으며, 이 저해 효과는 ionopore로 알려진 ionomycin ($1{\mu}M$)을 포함하는 저농도의 $K^+$의 버퍼를 처리하였을 때에도 보여졌다. 이틀 결과로부터 FS11052의 신경전달 물질의 방출에 대한 저해작용은 세포내 $Ca^{2+}$ 유입 이 후의 반응으로 추정하며 이 작용기구에 대한 해석을 하기위하여, 신경세포의 돌기신장 형태에 대한 영향을 관찰한 결과, 분화를 유도하는 적정 농도인 $5{\mu}g/ml$의 NGF 존재 하에서의 PC12 세포의 돌기 신장에 대하여서는 억제작용을 나타냈다. 또 rat의 대뇌 해마 세포에 대하여 특정적인 형태의 돌기를 내고 있어, FS11052 물질의 첨가에 의해 통상의 긴 축색돌기는 억제되고 얇은 침상의 돌기가 세포체로부터 돌출되어 있었으며, growth cone 를 갖고 있지 않은 뉴우런이 많이 관찰되었다. FS11052 물질의 작용에 관해서는, 탈분극된 synaptic membrane이 $Ca^{2+}$ 이온을 유입 후 활성화되어 신경전달물질을 방출에 중요한 역할을 하고 있는 synaptotagmin, syntaxin, synapsin, SNAP25 등의 synaptosome을 구성하는 단백질에 직접 혹은 이와 밀접한 관련을 갖고 있는 인자와 간접적으로 작용하며, 신경전달물질의 방출을 억제하여 growth cone의 전향과 신경세포의 가소성을 조절하는 물질로 사료되어, 이 물질이 $Ca^{2+}$ 이온을 유입 후 일어나는 exocytosis와 신경계의 기능연구를 위해 사용되어질 수 있을 것으로 기대된다.

Abstract ▼ AI-Helper

FS11052, a novel microbial metabolite from Streptomyces spp. was identified as a small molecular substance and shown inhibition activities for the release of neurotransmitter from rat hippocampal neuron and PC12 cells. FS11052 is an inhibitor of tritiated norepinephrine ($[^3H]-NE$) release in high $K^+$ buffer solution containing ionomycin, indicating that FS11052 inhibits neurotransmitter release after the influx of $Ca^{2+}$ ions. When examined the effect of FS11052 on glucuronidase release from guinea pig neutrophils, FS11052 inhibited glucuronidase release: when treated with $5{\mu}g/ml$ of FS11052, which was not induced cellular cytotoxicity. The fact that the glucuronidase release in neutrophil and norepinephrine release in neuron was inhibited suggests the similarity in the locations and the mechanisms of FS11052 action targets. When treated with $5{\mu}g/ml$ of FS11052, $[^3H]-NE$ release and neurite extension for both rat hippocampal neurons and PC12 cells were prevented. These observations of FS11052 functioning as an inhibitor of neurotransmitter release suggest that FS11052 has an important role in synaptic transmission in neuron.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

이들 보고로부터 CAM kinase Ⅱ, PKC에 의한 인산 화부위를 갖고 있는 신경계특이단백질, synapsin 등이 시냅 스 소포와 actin cytoskeleton의 cross-linking을 조절함으로써 신경전달물질의 방출을 조절하고 있으며, 또한 시냅스소 포가 시냅스 전막과 융합하는 프로세스가 신경돌기의 신장 과정에도 관여하고 있을 가능성을 시사하고 있어 흥미롭다. 그래서 FS11052 물질이 신경계 세포의 증식 및 형태에 미치는 작용을 검토했다. 먼저 세포독성과 세포증식에 관해서는 astroglia 유래의 세포종양인 C₆ 세포와 마우스의 신경아세 포종양인 Neuro 2A를 0.
신경전달물질 방출에 관여하고 있는 신경계특이단백질 SNAP-25와 synapsin이 신경세포의 돌기신장에도 관여하고 있는 것이 밝혀졌다 [2, 22, 23]. 그래서 본실험에서 신경전달 물질의 방출과정에 저해반응을 나타내고 있는 FS11052 물질이 PC₁₂ 세포(Fig. 5) 및 rat의 primary hippocampal neuron (Fig. 6)의 형태에 대하여 어떤 작용을 가지고 있는가를 검토했다. PC₁₂ 세포는 50 ng/ml의 nerve growth factor (NGF)를 첨가함에 따라 신경세포처럼 긴 돌기의 신장을 유도했다(Fig.
또한 이물질이 보이는 신경전달물질의 저해가 신경계 세포의 특이적인 저해 인지를 조사하기 위하여, 별도의 조절성분비를 하고 있는 몰모트의 neurophil에서 glucuronidase의 방출에 대한 영향을 조사했다. 또 본 물질이 신경계 세포에 대한 독성여부를 검토하기 위하여, 증식 및 형태변화에 미치는 영향을 관찰하였다. 시냅스에는 H*-ATPase 가 존재하고 있어서, 신경전달물질의 시냅스소포에의 농축과정에는 소포내의 organelle 의 산성화가 관여하고 있는 것은 잘 알려진 사실이다.
lonopore인 monensin, vesicular-ATPase 저해제, con- canamycin A 등의 약제는 세포내 organelle의 활성을 저해함으로 분비를 억제하고 있는 사실로부터, FSU052의 경우에도 같은 작용기작을 나타내고 있는가를 세포내 산성 organ- elle의 acridine orange 염색법에 의해 조사했다. 또한 이물질이 보이는 신경전달물질의 저해가 신경계 세포의 특이적인 저해 인지를 조사하기 위하여, 별도의 조절성분비를 하고 있는 몰모트의 neurophil에서 glucuronidase의 방출에 대한 영향을 조사했다. 또 본 물질이 신경계 세포에 대한 독성여부를 검토하기 위하여, 증식 및 형태변화에 미치는 영향을 관찰하였다.

제안 방법

신경세포 간 정보교환이 이루어지고 있는 신경전달물질의 방출과정은 극히 복잡하여, 이 방면의 독창적인 연구를 수행하기 위해서는 신규작용을 갖는 특이적인 저분자 probe의 탐색은 필수적이다. 21래서 PC₁₂세포 에서 신경전달물질의 방출에 대한 효과를 조사한 결과 PC₁₂ 세포에 incorporation된 노르에피네피린([³H]-NE)의 고농도 K* 자극에 의한 exocytosis를 특이적으로 저해하는 물질 FS11052를 방선균 대사산물로부터 얻었고, 이 저분자물질, FS11052가 신경전달물질 방출에 대한 저해작용과 신경돌기 신장에 미치는 영향을 해석하였다.
002% DNase I (Sigma)를 첨가 후 10분간 더 반응시켰다. 5% HS를 포함한 DMEM을 첨가하여 다시 한번 피펫팅한 후 autoclave 해둔 lens paper로 여과하여 세포를 분산시킨 후 1000 rmp에서 5분간 원심분리를 2회 반복하여 세포를 세정했다. 세포수를 카운트한 후, primary culture용 배지에 현탁하여 24-well plate (Nunc Co.
Neurophile cytochalasin B의 존재 하에서의 케미칼메디 에이터의 일종인 FMLP에 의한 자극에 따라 분비과립에 축적된 glucuronidase를 exocytosis에 의해 방출한다. 상청에 방출된 glucuronidase를 측정함으로써 neurophil의 탈과립에 대한 FS11052 물질의 작용을 검토했다.
신경세포 간 정보교환이 이루어지고 있는 신경전달물질의 방출과정은 극히 복잡하여, 이 방면의 독창적인 연구를 수행 하기 위해서는 신규작용을 갖는 특이적인 저분자 probe의 탐색은 필수적이다. PC₁₂ 세포에 tritium-label 된 norepinephrine ([³H]-NE) 을 incorporation시킨 후에 60 mM의 고농도의 K* 의 자극에 의해서 탈분극 후에 방출되는 Fh]-NE의 양을 scintillation countering하여 생리활성 물질을 탐색하기 위한 in vitro의 실험계를 세웠다. 이 탐색계를 이용하여 곰팡이, 방선균와 박테리아의 대사산물 1만 1000여 샘플을 탐색한 결과, PC₁₂세포에서 고농도의 K* 의 자극에 의해서 탈분극 후에 유도되는 FH]-NE의 방출을 효과적으로 저해하는 FS11052를 방선균 유래의 대사산물로부터 얻었다.
4). PCI2 세포를 FS11052, 또는 organelle 산성화 저해제를 처리한 대조군으로서 concanamycin A (1 pg/ml) 로 1시간 전처리하여, acridine orange에 의한 염색 후 형광 현미경으로 관찰했다. 대조군에서는 세포 내 orange색의 소과립이 많이 보였다(pan이 A).
변형하여 행했다[28]. 몰모트(Hartley, 10-12 weeks)에 생리식염수로 녹인 12% 카제인 산나트리윰 20 ml/마리를 에테르 마취 하에서 주사했다. 주사 후 후두부를 구타하여 실신시킨 후, 경동맥을 전달하여 방혈사시켰다.
세포증식 assay는 PC₁₂ B3 세포를 콜라겐코팅한 96-well plate에 ZxlO, cells/wel!의 농도로 접종하였다. 배양 24시간 후 FSU052를 01, 1, 10 ㎍/ml의 농도로 처리하였다. 처리 48시간 후에 MTT[3-(4z5-dimethylthiazol -2-yl)-2z5~diphenyltetrazolium bromide] assay를 Mosmann 의 방법에 따라 행했다[21].
형광광도계의 여기파장을 365 nmz 형광파장을 450 nm 에 맞추어 유리한 4-methylumbelliferonee fleuroscence density를 측정했다. 별도로 neurophil 부유액을 0.2% Triton X-100로 세포를 용해하여, 원심상청액 중의 glucuronidase 활성을 100%의 과립 방출량으로 했다.
Neurophile cytochalasin B의 존재 하에서의 케미칼메디 에이터의 일종인 FMLP에 의한 자극에 따라 분비과립에 축적된 glucuronidase를 exocytosis에 의해 방출한다. 상청에 방출된 glucuronidase를 측정함으로써 neurophil의 탈과립에 대한 FS11052 물질의 작용을 검토했다. FMLPe 1 pM와 cytochalasin B는 10 μM의 농도로 처리했을 때, 좋은 유도반응을 나타냈다(Fig.
5분 후에 얼음 위에서 반응을 멈추게 하여 4℃, 1,500 rpm으로 2분간 원심분리했다. 얻은 상청 100 μ1를 사용하여 glucuronidase의 활성을 측정했다.
6C)의 시간 경과 따라 신경돌기의 신장을 보였다. 이 primary hippocampal neuron에서의 FS11052 물질의 역할을 알아보기 위해 신경전달물질로서 ATP의 exocytosis에 대해서 저해반응을 보인 FS11052 물질을 배양 1일째에 처리하였다. Primary hippocampal neuron에 FS11052 물질 5 ng/ml을 2일 동안 처리배양 3일째(Fig.
탄산가스 incubator 내에 습기를 공급한 상태에서 배양했다. 임신 18일의 rat을 단두하여, 전신을 70% ethanol 로 세정 후 복부로부터 태아를 자궁과 함께 추출했다. 태아를 자궁으로부터 분리하여, 두피 두 개를 해부하여 선단이 완곡한 완충액 속에 넣어 해부현미경하에서 메스로 좌우의 대뇌반구를 잘라냈다.
몰모트(Hartley, 10-12 weeks)에 생리식염수로 녹인 12% 카제인 산나트리윰 20 ml/마리를 에테르 마취 하에서 주사했다. 주사 후 후두부를 구타하여 실신시킨 후, 경동맥을 전달하여 방혈사시켰다. 5 U/ml 헤파린이 든 Hanks 완충액 20 ml/마 리 를 ip 주사하여 neurophil을 취한다.
3) 20 μ1를 첨가하여 효소반응을 멈추게 했다. 형광광도계의 여기파장을 365 nmz 형광파장을 450 nm 에 맞추어 유리한 4-methylumbelliferonee fleuroscence density를 측정했다. 별도로 neurophil 부유액을 0.
4)에 몇 번 세정하여, cover glass의 세포가 붙어있지 않은 측의 수분을 잘 닦은 후 건조시켜 KR으로 슬라이드글라스 상에 마운팅했다. 형광현미경에 의한 관찰은 Olympus BH-2 현미경을 사용, U 큐브, 보조흡수필터 Y455, 100배의 대물렌즈에 유침 상태에서 관찰했다. 세포증식 assay는 PC₁₂ B3 세포를 콜라겐코팅한 96-well plate에 ZxlO, cells/wel!의 농도로 접종하였다.

대상 데이터

해파린나 트리움 주사액 Novo-heparin 1000 (1000 U/ml)를 Nordisk 사(Denmark)로부터 구입 후 희석하여 사용했다. N-form- yl-L-methionyl-L-leucyl-phenylalanine (FMLP)는 Sigma사, 4-methylumbelliferyl-D-gluculonide와 카제인산나트리 윰은 Nakara사(Tokyo, Japan)의 제품을 구입하여 사용했다. 0.
본 실험에서 사용한 모든 세포는 DMEM 배지에서 37℃, 10% CO₂ 탄산가스 incubator 내에 습기를 공급한 상태에서 배양했다. 임신 18일의 rat을 단두하여, 전신을 70% ethanol 로 세정 후 복부로부터 태아를 자궁과 함께 추출했다.
상청에 0.1 M 초산완충액(pH 4.6) 300 μ1를 가해 37℃에서 15분간 배양하여, 기질로서 50 μ1의 1 mM 4-methyl- umbelliferyl-D-glucuronide-J- 첨가했다. 15분 후에 0.
혈청은 소태 아혈청 (fetal calf serum, FCS; Japan Bio-Test) 및 말혈청 (horse serum, HS; Gibco)을 사용, 세포 계대배양용 배 지로서는 5% FCS와 5% HS를 가하여 사용했다. 신경세포 초 대배양용 배지로서는 DMEM에 5 ug/ml 인슐린(Sigma, St. Louis, MO, USA), 5 lig/ml 트란스페 린(Sigma), 1 mM 피루 빈산나트륨(Sigma), 5% HS를 첨가하여 실험에 사용했다.
3)을 조제했다. 해파린나 트리움 주사액 Novo-heparin 1000 (1000 U/ml)를 Nordisk 사(Denmark)로부터 구입 후 희석하여 사용했다. N-form- yl-L-methionyl-L-leucyl-phenylalanine (FMLP)는 Sigma사, 4-methylumbelliferyl-D-gluculonide와 카제인산나트리 윰은 Nakara사(Tokyo, Japan)의 제품을 구입하여 사용했다.
22 μm pore 멸균필터를 이용하여 멸균했다. 혈청은 소태 아혈청 (fetal calf serum, FCS; Japan Bio-Test) 및 말혈청 (horse serum, HS; Gibco)을 사용, 세포 계대배양용 배 지로서는 5% FCS와 5% HS를 가하여 사용했다. 신경세포 초 대배양용 배지로서는 DMEM에 5 ug/ml 인슐린(Sigma, St.

이론/모형

Vescular-ATPase 저해제가 세포내 단백질의 막 수송을 저해하는 것, 특히 바피로마이신 A1 이 프로락틴의 분비를 tans-golgi 이후의 과정에서 저해하고 있는 것이 알려져 있다. [20], 방선균 대사산물로부터 탐색하여 얻어진 FSU052가 이와 동일한 작용기작을 통하여 신경세포에서 [3H]-NE 및 ATP, neurophii에서 FLMP오, cytochalasin B의 자극에 의한 glucuronidase의 조절성분비를 저해하고 있는가를 세포내 산성화 organelle을 acridine orange 염색방법에 의해서 검토했다(Fig. 4). PCI2 세포를 FS11052, 또는 organelle 산성화 저해제를 처리한 대조군으로서 concanamycin A (1 pg/ml) 로 1시간 전처리하여, acridine orange에 의한 염색 후 형광 현미경으로 관찰했다.
세포와 rat primary hippocampal neuron에서 조절성분비에 의해서 방출되는 신경전달물질을 효과적으로 저해하는 결과를 얻었다. lonopore인 monensin, vesicular-ATPase 저해제, con- canamycin A 등의 약제는 세포내 organelle의 활성을 저해함으로 분비를 억제하고 있는 사실로부터, FSU052의 경우에도 같은 작용기작을 나타내고 있는가를 세포내 산성 organ- elle의 acridine orange 염색법에 의해 조사했다. 또한 이물질이 보이는 신경전달물질의 저해가 신경계 세포의 특이적인 저해 인지를 조사하기 위하여, 별도의 조절성분비를 하고 있는 몰모트의 neurophil에서 glucuronidase의 방출에 대한 영향을 조사했다.
본 실험은 Tsujii 등의 방법을. 변형하여 행했다[28].
배양 24시간 후 FSU052를 01, 1, 10 ㎍/ml의 농도로 처리하였다. 처리 48시간 후에 MTT[3-(4z5-dimethylthiazol -2-yl)-2z5~diphenyltetrazolium bromide] assay를 Mosmann 의 방법에 따라 행했다[21].

성능/효과

이 neurophil과 신경세포에서의 exocytosis를 저해하는 결과로부터 FSU052의 작용이 세포독성에 의한 가능성을 확인했다. 0.4% trypan blue와 세포의 형태학적 관찰을 통하여 검토한 결과, 처리농도 5 μg/ml에서는 세포수나 세포의 형태학적인 변화는 검출되지 않았다(data not shown). PCI2 세 포를 가지고 FS11052 물질이 세포독성과 세포증식에 미치는 영향을 cell vitality를 나타내는 MTT reduction activity와 세포의 형태학적 변화를 관찰한 결과, 처리한 0.
5B). 50 ng/ml의 NGF를 처리한 PC₁₂ 세포에 FS11052 물질을 이 세포에서 FH]-NE의 방출을 저해한 5 ug/ml의 농도로 처리하여 2일 동안 배양한 결과, PC₁₂ 세포의 NGF에 의해서 유도되는 돌기 신장에 대하여 현저한 저해작용을 나타냈다(Fig. 5C). 또 rat의 primary hippocampal neurone primary culture medium에서 배양 일수, day 0의 대조군 (Fig- 6A), 배양 1일째(Fig.
Acridine orange는 산성화한 organelle에 축적하여 형광을 띠기 때문에, 이들 과립이 리소조옴 등이라고 생각되어 진다. Concanamycin A의 처리시에는 예상했던 것처럼 이들 orange색의 세포내 과립이 소실되어, 산성화의 저해가 일어나고 있는 것이 확인되었다 (panel B). 그러나 5 pg/ml의 FS11052를 처리한 경우에 있어서는 concanamycin A와 같은 산성화 저해제를 처리 한 경우에서 보이는 과립의 소실은 관찰되지 않았으며 아무것도 처리하지 않은 대조군과 유사한 결과를 나타냈다(panel C).
이 결과로부터 신경전달물질과 glucuronidase의 exocytosis에 대해 현저한 저해를 보이는 이 물질의 작용 target0] neutrophil와 신경세포에서 유사한 기구로 해석되어, 비만세포에서 보이는 histamine 의 exocytosis의 결과와 이에 대한 FS11052의 영향에 대한 구체적인 연구가 필요하다. FS11052 물질을 처리하여 신경세포의 돌기신장 형태를 관찰한 결과, 분화를 유도하는 적정농도인 50 ng/ml의 NGF 존재하에서의 PC₁₂ 세포의 돌기 신장에 대하여서는 억제작용을 나타냈다. 또 rat의 대뇌 해마 세포에 대하여 특징적인 형태의 돌기를 내고 있어, FS11052 물질의 첨가에 의해 통상의 긴 축색돌기는 억제되고 얇은 침상의 돌기가 세포체로부터 돌출되어 있었으며, growth cone 를 갖고 있지 않은 뉴우런이 많이 관찰되었다.
4% trypan blue cell vitality assay와면밀한 현미경적 관찰의 결과, 이 세포들의 세포사를 유도하지는 않았다. PC₁₂세포에서의 영향을 검토하기 위하여 MTT assay로 조사한 결과, 이 FS11052물질이 PC₁₂세포들의 형태 및 증식에 관해서도 처리농도에서는 심각한 영향을 미치지 않았다(Fig. 3). 그러나 FSU052는 고농도 K+ 이온에 의한 탈분극자극에 의해 방출되는 신경전달물질로서 노르에피네피린과 ATP, neurophil의 FMLP와 cytochalasin B의 자극에 의한 탈과립이 방출되는 exocytosis를 저해했다.
4% trypan blue와 세포의 형태학적 관찰을 통하여 검토한 결과, 처리농도 5 μg/ml에서는 세포수나 세포의 형태학적인 변화는 검출되지 않았다(data not shown). PCI2 세 포를 가지고 FS11052 물질이 세포독성과 세포증식에 미치는 영향을 cell vitality를 나타내는 MTT reduction activity와 세포의 형태학적 변화를 관찰한 결과, 처리한 0.1, 1, 10 yg/ml 의 농도에서는 유의한 세포독성과 세포의 형태적인 변화를 보이지 않았다(Fig. 3).
이 primary hippocampal neuron에서의 FS11052 물질의 역할을 알아보기 위해 신경전달물질로서 ATP의 exocytosis에 대해서 저해반응을 보인 FS11052 물질을 배양 1일째에 처리하였다. Primary hippocampal neuron에 FS11052 물질 5 ng/ml을 2일 동안 처리배양 3일째(Fig. 6C)의 대조군과 비교하여 세포변화를 관찰한 결과, 신경돌기의 신장을 현저하게 억제하는 결과를 보였다(Fig. 6D, Table 2).
FS11052 물질을 처리하여 신경세포의 돌기신장 형태를 관찰한 결과, 분화를 유도하는 적정농도인 50 ng/ml의 NGF 존재하에서의 PC₁₂ 세포의 돌기 신장에 대하여서는 억제작용을 나타냈다. 또 rat의 대뇌 해마 세포에 대하여 특징적인 형태의 돌기를 내고 있어, FS11052 물질의 첨가에 의해 통상의 긴 축색돌기는 억제되고 얇은 침상의 돌기가 세포체로부터 돌출되어 있었으며, growth cone 를 갖고 있지 않은 뉴우런이 많이 관찰되었다. 시냅스전달에 관여하는 신경계 특이단백질 중 syntaxin의 경우에 있어서도 이의 antisense RNA를 처리한 결과로부터 신경돌기신장의 과정에 대해서, 또 신경섬유의.
SNAP-25 등이 시냅스 전막뿐만 아니라 축색막상에도 전반적으로 다량 존재하는 것으로부터 별도의 기능을 갖고 있다고 예상되어진다. 또한, hi vivo 및 in oifro의 antisense 법을 통하여 해석한 결과 신경돌기의 신장에도 중요한 역할을 하고있음이 증명되었다. 이들 보고로부터 CAM kinase Ⅱ, PKC에 의한 인산 화부위를 갖고 있는 신경계특이단백질, synapsin 등이 시냅 스 소포와 actin cytoskeleton의 cross-linking을 조절함으로써 신경전달물질의 방출을 조절하고 있으며, 또한 시냅스소 포가 시냅스 전막과 융합하는 프로세스가 신경돌기의 신장 과정에도 관여하고 있을 가능성을 시사하고 있어 흥미롭다.
미생물의 대사산물로부터 얻은 FSU052는 PC₁₂세포와 rat primary hippocampal neuron에서 조절성분비에 의해서 방출되는 신경전달물질을 효과적으로 저해하는 결과를 얻었다. lonopore인 monensin, vesicular-ATPase 저해제, con- canamycin A 등의 약제는 세포내 organelle의 활성을 저해함으로 분비를 억제하고 있는 사실로부터, FSU052의 경우에도 같은 작용기작을 나타내고 있는가를 세포내 산성 organ- elle의 acridine orange 염색법에 의해 조사했다.
이것은 PKC에 의한 인산화부위를 갖고 있는 syn- apsin이 활성화되어, 시냅스소포와 actin의 cross-linking을 조절함에 의해 신경전달물질의 방출을 조절하고 있다고 생각되어 진다. 반면, 신경세포체와 axon에서 PMA에 의한 PKC의 활성을 증가시켜도 신경전달물질의 조절에는 변화가 없으며, 상대적으로 PKA의 활성감소가 신경전달물질의 방출량을 적게하여 시냅스의 기능을 저하시키는 결과를 보였다. 이 결과로부터, 시냅스의 활성화에는 PKA의 기능이 신경전달물질의 방출과 유지에 중요하다고 보는 견해도 보고되었다[13].
이것은 FS11052가 바피로마이신과 같이 V-ATPase 저해 작용을 갖고, 동일하게 V-ATPase 저해작용을 같는 con- canamycin A가 G 단백질의 세포내 수송을 골지 이전에 정지시킨다는 가능성을 시사하고 있다[4, 22]. 본 실험계에서 FS11052 물질이 V-ATPase의 저해에 의해 신경전달물질의 소포에 농축되는 것을 억제한 결과, 방출량을 감소시켜서 exocytosis를 저해한다고 볼 수 있는 가능성은 매우 낮다. Acridine orange에 의한 염색결과와 같이, FS11052 물질은 V-ATPase 저해 활성은 갖고 있지 않으므로 FS11052의 신경 전달물질 방출 저해 작용은 별도의 메카니즘을 통한 것으로 사료되어진다.
FS11052는 고농도 K* 이온에 의한 탈분극자극에 의해 방출되는 신경전달물질로서 노르에피네피 린과 ATP의 exocytosis를 저해반응을 나타냈으며㎛ press), neurophil-S] FMLP와 cytochalasin B의 자극에 의한 탈과립 에 대한 검토 결과에서도 glucuronidase의 exocytosis에 대해서도 대조군에 비해 현저한 저해반응을 나타냈다(Table 1). 이 neurophil과 신경세포에서의 exocytosis를 저해하는 결과로부터 FSU052의 작용이 세포독성에 의한 가능성을 확인했다. 0.
PC₁₂ 세포에 tritium-label 된 norepinephrine ([³H]-NE) 을 incorporation시킨 후에 60 mM의 고농도의 K* 의 자극에 의해서 탈분극 후에 방출되는 Fh]-NE의 양을 scintillation countering하여 생리활성 물질을 탐색하기 위한 in vitro의 실험계를 세웠다. 이 탐색계를 이용하여 곰팡이, 방선균와 박테리아의 대사산물 1만 1000여 샘플을 탐색한 결과, PC₁₂세포에서 고농도의 K* 의 자극에 의해서 탈분극 후에 유도되는 FH]-NE의 방출을 효과적으로 저해하는 FS11052를 방선균 유래의 대사산물로부터 얻었다. FS11052는 또한 PC₁₂세포와 rat cortical neurons에서 동일한 고농도의 K* 의 자극에 의한 탈분극 후에 유도되는 신경전달 물질로서 ATP의 방출에도 유의한 저해효과를 나타냈으며, 이 저해 효과는 ionopore로 알려진 ionomycin (1 pM)을 포함하는 저농도의 K* 의 버퍼를 처리하였을 때에도 보여졌다.
FS11052는 또한 PC₁₂세포와 rat cortical neurons에서 동일한 고농도의 K* 의 자극에 의한 탈분극 후에 유도되는 신경전달 물질로서 ATP의 방출에도 유의한 저해효과를 나타냈으며, 이 저해 효과는 ionopore로 알려진 ionomycin (1 pM)을 포함하는 저농도의 K* 의 버퍼를 처리하였을 때에도 보여졌다. 이들 결과로부터 FS11052의 신경전달 물질의 방출에 대한 저해작용은 세포내 Ca²⁺ 유입 이 후의 반응으로 추정하며 이 작용기구에 대한 해석을 하기위하여, 신경세포의 돌기신장 형태에 대한 영향을 관찰한 결과, 분화를 유도하는 적정 농도인 50 pg/ml의 NGF 존재 하에서의 PC₁₂ 세포의 돌기 신장에 대하여서는 억제작용을 나타냈다. 또 rat의 대뇌 해마 세포에 대하여 특징적인 형태의 돌기를 내고 있어, FS11052 물질의 첨가에 의해 통상의 긴 축색돌기는 억제되고 얇은 침상의 돌기가 세포체로부터 돌출되어 있었으며, growth cone 를 갖고 있지 않은 뉴우런이 많이 관찰되었다.

후속연구

또 rat의 대뇌 해마 세포에 대하여 특징적인 형태의 돌기를 내고 있어, FS11052 물질의 첨가에 의해 통상의 긴 축색돌기는 억제되고 얇은 침상의 돌기가 세포체로부터 돌출되어 있었으며, growth cone 를 갖고 있지 않은 뉴우런이 많이 관찰되었다. FS11052 물질의 작용에 관해서는, 탈분극된 synaptic membrane이 Ca²⁺ 이온을 유입 후 활성화되어 신경전달물질을 방출에 중요한 역할을 하고 있는 synaptotagmin, syntaxin, synapsin, SNAP25 등의 synaptosome을 구성하는 단백질에 직접 혹은 이와 밀접한 관련을 갖고 있는 인자와 간접적으로 작용하며, 신경전달물질의 방출을 억제하여 growth cone의 전향과 신경세포의 가소성을 조절하는 물질로 사료되어, 이 물질이 Ca²⁺ 이온을 유입 후 일어나는 exocytosis와 신경계의 기능연구를 위해 사용되어질 수 있을 것으로 기대된다.
따라서 FS11052 물질의 작용에 관해서는, Fig. 7에서 보여주는 것처럼 여러 자극에 의하여 탈분극된 synaptic mem- brane이 Ca²⁺ 이온을 유입 후 활성화되어 신경전달물질의 방출에 중요한 역할을 하고 있는 synaptotagmin, syntaxin, synapsinz SNAP25 등의 synaptosome을 구성하는 단백질에 직접 혹은 이와 밀접한 관련을 갖고 있는 인자와 간접적으로 작용, 또는 이 과정에 관여하고 있는 kinase나 phosphatase 에 작용하여 신경전달물질의 방출을 제어하며, growth cone 의 전향, 보수와 신경세포의 가소성을 조절하는 물질로 사료되어 이후의 생리적인 연구를 통한 작용기구에 대한 해석이 기대된다. [7, 1 이.
그러나 FSU052는 고농도 K+ 이온에 의한 탈분극자극에 의해 방출되는 신경전달물질로서 노르에피네피린과 ATP, neurophil의 FMLP와 cytochalasin B의 자극에 의한 탈과립이 방출되는 exocytosis를 저해했다. 이 결과로부터 신경전달물질과 glucuronidase의 exocytosis에 대해 현저한 저해를 보이는 이 물질의 작용 target0] neutrophil와 신경세포에서 유사한 기구로 해석되어, 비만세포에서 보이는 histamine 의 exocytosis의 결과와 이에 대한 FS11052의 영향에 대한 구체적인 연구가 필요하다. FS11052 물질을 처리하여 신경세포의 돌기신장 형태를 관찰한 결과, 분화를 유도하는 적정농도인 50 ng/ml의 NGF 존재하에서의 PC₁₂ 세포의 돌기 신장에 대하여서는 억제작용을 나타냈다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

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용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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