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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 CCI4, TBH 및 GalN으로 독성을 유발 시킨 일차 배양 흰쥐 간세포를 이용하여 glyc可nhizin과 balicalin 의 간세포 보호 활성을 알아보고자 하였다.
- 현재 간 질환 치료제로 임상적으로 몇몇 화학물질이 사용되고 있으나 이들의 치료 효과의 한계와 부작용이 빈번히 발생되므로 최근에는 천연물로부터 유래된 물질에 대한 관심이 집중되고 있다. 따라서 본 연구에서는 임상적으로 간 보호 작용이 알려진 약재인 감초와 황금으로부터 분리된 이ycyrrhizin과 baicalin의 간 보호 활성을 알아보기 위하여 일차 배양 간세포를 이용한 급성 간독성 실험을 수행하였다.
제안 방법
- 감압 농축한 MeOH 추출액을 증류수에 현탁 시키고, 동량의 CH2CI2를 가하여 분획 깔때기로 CH2C12 층과 H2O 층을 분획하는 조작을 3회 반복 실시한 후, CH2C12 층을 감압 농축하여 CH2C12 분획을 얻었다. 남은 H2O 층에 다시 EtOAc를 동량 가해서 H2O 층과 EtOAc 층을 분획하는 조작을 3회 반복 실시한 후, EtOAc 층을 감압 농축하여 EtOAc 분획을 얻고, 나머지를 H2O 분획으로 하였다. 얻어진 분획 중 EtOAc 분획 (150 g)을 지름 10 cm인 silica gel column에 loading 시켜 EtOAc/n-hex.
- 흰쥐에 pentobarbital sodium(40 mg/kg)을 복강 내 주사하여 마취한 후 개복한 뒤, 간 문맥에 21 guage catheterf- 삽관하여 CO?와。2의 혼합기체를 공급해 주면서 Kiebs-Ringer-HEPES 완충용액과 collagenase로 구성된 소화 용액을 15m〃min의 속도로 10분간 재순환시켰다. 간세포가 소화된 후 간 막을 벗겨 간세포가 유리되게 한 다음, nylon mesh를 사용하여 여과하였다. 여과액은 200rpm에서 3분간 원심분리한 후 상등액을 버리고 침전된 간세포를 BSA가 포함된 완충용액에 현탁 시켜 다시 원심분리하였다.
- 여과액은 200rpm에서 3분간 원심분리한 후 상등액을 버리고 침전된 간세포를 BSA가 포함된 완충용액에 현탁 시켜 다시 원심분리하였다. 침전된 간세포를 배양액에 다시 현탁 시켜 세포 현탁액을 얻은 뒤, trypan blue 용액으로 생존율을 측정하여, 생존율이 90% 이상인 경우에만 실험에 사용하였다. 생존율이 90% 이상 되면 간세포의 농도가 5X105 cells/mZ이 되도록 조절하여, collagen type L으로 미리 도포된 배양 용기에 이식하였다.
- 간세포를 24 well plate에 세포 농도 2.5X105 cel0m/로 조절하여 18시간 동안 배양한 후 glycyrrhizin 및 baicalin을 각 농도 별로(0.1, 1, 10, 100 및 200 卜iM) 처리한 후 72시간 동안 추가 배양하였다. 72시간 후 MTT(0.
- 1, 1, 10, 100 및 200 卜iM) 처리한 후 72시간 동안 추가 배양하였다. 72시간 후 MTT(0.25 mg/m/)가 함유된 배양액으로 교환하여 4시간 동안 처리 후 생성된 formazan crystal을 dimethyl sulfoxide(300 p〃well)에 녹여 540 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
- Kiso의 방법23을 일부 수정하여 간세포를 배양한 지 18시간 후 10 mM CCI4를 함유한 배양액으로 교체하여 간독성을 유도하였으며, 동시에 glycyrrhizin 및 baicalin을 각 농도별(0.1, 1, 10 및 100 ㈣로 처리하여 24시간 동안 세포를 배양한 후 그 배양액을 취하여 간세포 보호 작용을 알아보았다.
- Ibeng의 방법24)을 일부 수정하여 간세포를 배양한 지 18시간 후 0.5mM TBH를 함유한' 배양액으로 간독성을 유도하였으며, 동시에 glycyrrhizin 및 baicalin을 각 농도별 (0.1, 1, 10 및 100 pM)로 처리하여 1시간 동안 세포를 배양한 후 그 배양액을 취하여 간세포 보호 작용을 알아보았다.
- Kiso의 방법 25)을 일부 수정하여 간세포를 배양한 지 18시간 후 30 mM Gall橹 함유한 배양액으로 교체하여 간독성을 유도하였으며, 동시에 glycyrrhizin 및 baicalin을 각 농도별(0.1, 1, 10 및 100 pM)로 처리하여 48시간 동안 세포를 배양한 후 그 배양액을 취하여 간세포 보호 작용을 알아보았다.
- 세포 독성이 유도된 간세포의 배양액을 취하여 LDH, ALT 및 AST의 활성을 아이비디-랩 측정 kit인 C121, C123 및 C124를, 사용하여 spectrophotometers. 긱각 측정하였다.
- Glycyrrhizin 및 baicalin 세포독성 측정과 더불어 농도 범위 결정을 위하여 MTT assay를 시행하였다. MTT assay를 시행하여 일차 배양 간세포에서 대조군에 비해 생존율이 50%가 되 는 약물의 농도를 측정하였다.
- Glycyrrhizin 및 baicalin 세포독성 측정과 더불어 농도 범위 결정을 위하여 MTT assay를 시행하였다. MTT assay를 시행하여 일차 배양 간세포에서 대조군에 비해 생존율이 50%가 되 는 약물의 농도를 측정하였다. 그 결과 Table I에서 보는 바와 같이 glycyrrhizin과 baicalin의 IC%은 각각 625.
대상 데이터
- 실험에 사용한 감초는 대구광역시 약령시장, 황금은 전남 순천에서 재배한 황금을 구입하여 경희대학교 이제현 교수의 감정을 받아 사용하였다. Type I collagen, collagenase type insulin, epidermal growth fector, hydrocortisone, glucagon, antibiotic antimycotics, trypan blue, bovine serum albumin (BSA), methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide(MTT), CC14)TBH 및 GalN 등은 Sigma사(St.
- 실험에 사용한 감초는 대구광역시 약령시장, 황금은 전남 순천에서 재배한 황금을 구입하여 경희대학교 이제현 교수의 감정을 받아 사용하였다. Type I collagen, collagenase type insulin, epidermal growth fector, hydrocortisone, glucagon, antibiotic antimycotics, trypan blue, bovine serum albumin (BSA), methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide(MTT), CC14)TBH 및 GalN 등은 Sigma사(St. Louis, MO, USA.)에서, lactate dehydrogenase(LDH), alanine aminotransferase(ALT) 및 aspartate aminotransferase(AST) assay kit는 (주)아이비디- 랩, Dulbecco's Modified Ease's Medium(DMEM) 및 fetal bovine serum(FBS) 등은 GIBCO-BRL사(GRAND Island, NY, U.SA)에서 구입하여 사용하였으며, 기타 일반 시약들은 특급 시 약을 구입흐} 여 사용하였다. Fraction collector는 Advantec의 SF- 16。을 사용하였다.
- Fraction collector는 Advantec의 SF- 16。을 사용하였다. 】H- 및 13C-NMR spectrmm은 Bruker ARK 250(250 MHz) spectrometer# 사용하였으며, 내부표준물질로는 tetramethylsilane를 사용하였고, chemical shift value는 part per million(ppm) 단위로 나타내었다. 추출 및 분리용 용매는 시약용 1급을 사용하였다.
- 추출 및 분리용 용매는 시약용 1급을 사용하였다. TLC plate는 Kieselgel 60 F254 및 RP-18을 사용하였다. Column chromatography 용 고정상은 silicagel(70~230 mesh, Merck), MCI-gel CHP-20P(75~150 pm, Mitsubishi Chem.
- TLC plate는 Kieselgel 60 F254 및 RP-18을 사용하였다. Column chromatography 용 고정상은 silicagel(70~230 mesh, Merck), MCI-gel CHP-20P(75~150 pm, Mitsubishi Chem. Co.), RP-18(40~63 pm, Merck), 등을 사용하였다. 발색 시약은 vanillin-sulfiiric acid 시액, 10% sulfuric acid, 1% FeC%/ ethanol 용액, anisaldehyde sulfuric add 시액을 사용하였다.
- ), RP-18(40~63 pm, Merck), 등을 사용하였다. 발색 시약은 vanillin-sulfiiric acid 시액, 10% sulfuric acid, 1% FeC%/ ethanol 용액, anisaldehyde sulfuric add 시액을 사용하였다.
- 체중 180~220 g의 Sprague-Dawley계 웅성 흰쥐를 (주) 현대 바이오로부터 공급받아 온도 23±1°C, 상대습도 55±15% 및 300~500Lux의 주두루 12시간 간격으로 명암이 조절되는 성균관대학교 약학대학 동물 사육실에서 일주일 이상 순화시킨 후 육안적 증상을 관찰하여 정상적인 동물만을 실험에 시용하였으며, 고형 사료 및 물은 자유롭게 섭취시켰다.
- 생존율이 90% 이상 되면 간세포의 농도가 5X105 cells/mZ이 되도록 조절하여, collagen type L으로 미리 도포된 배양 용기에 이식하였다. 배양액으로는 10% FBS, 500 U// insulin, 7 |ig/Z glucagon, 20 昭7 epidermal growth 包ctor, 7500 jig/7 hydrocortisone, 105U/Z penicillin, 100 mg/Z streptomycin, 250 gg/Z amphotericin B를 포함하 는 DMEM을 사용하였으며 일정한 온도와 습도가 유지되는 37°C 배양기에서 02 95%와 CO2 5%의 혼합기체를 공급하여 배양하였다. 배양 시작 4시간 후 새로운 배양액으로 교환하였다.
데이터처리
- 모든 측정 결과는 평균값土표준오차로 나타내었으며, 실험군 간의 차이는 Dunnett's t-test를 사용하여 통계적 유의성을 나타내었고, F<0.05인 경우에 통계적으로 유의적 차이가 있는 것으로 판정하였다.
이론/모형
- 흰쥐의 간세포는 Berry와 Friend의 방법幻物을 변형한 2단계 collagenase 관류법을 이용하여 분리하였다. 흰쥐에 pentobarbital sodium(40 mg/kg)을 복강 내 주사하여 마취한 후 개복한 뒤, 간 문맥에 21 guage catheterf- 삽관하여 CO?와。2의 혼합기체를 공급해 주면서 Kiebs-Ringer-HEPES 완충용액과 collagenase로 구성된 소화 용액을 15m〃min의 속도로 10분간 재순환시켰다.
성능/효과
- 황금은 꿀풀과의 다년생 식물인 Scutdk折q baicalensis Georgi의 뿌리로 항염증, 항암, 항균 및 콜레스테롤 저하작용이 보고되고 있으며, 현재 항고혈압약으로 한방처방에 빈번히 사용되고 있다.8) 황금의 주요 생리활성성분인 baicalin은 인간 간암 세포에서 항암 활성을 나타내며, 9 흰쥐의 결장암 생성을 억제한다고 한다.10) 또한 흰쥐에서 carrageenan으로 유도된 염증 및 포도상구균에 의해 발현되는 여러 염증 매개 인자들의 분비 억제 작용이 있으며, 11-13) 간세포에서의 항산화 작용이 보고되고 있다.
- 4%로 CCL 단독 군에 비해 현저히 억제되었다. Fig. 3에서와 같이 LDH 활성은 baicalin 0.1, 1 및 100 卩祖 농도에서 각각 95.4+ 4.9, 124.1±15.0 및 U1.1±1L3%로 CC14 단독 군에 비해 LDH 활성을 현저히 억제하였으며, baicalin 10 및 100 gM 농도에서도 ALT 수치가 CC14 단독 군에 비해 각각 151.5±6.1, 78.8土9.0%로 ALT 활성을 현저히 억제하였다. 또한 AST 수치는 baicalin 0.
- 0%로 ALT 활성을 현저히 억제하였다. 또한 AST 수치는 baicalin 0.1, 1 및 100 pM의 농도에서 CC14 단독 군에 비해 159.8 ±9.2, 169.4+10.8 및 74.5土9.8%로 AST의 활성을 현저히 억제하였다.
- 4%로 대조군에 비해 현저한 활성 증가를 나타내었다. 이러한 LDH 및 ALT 활성 증가는 glycyrrhizin 모든 농도에서 TBH 단독 군에 비해 현저히 억제되었다. 그러나 이와는 달리 glycyrrhizin은 AST 활성에는 별다른 영향을 미치지 않았다.
- 6%로 현저한 증가를 나타내었다. Baicalin 10 및 100 pM의 농도에서 각각 310.8+14.1 및 301.3±10.7%로 TBH 단독 군에 비해 현저한 LDH 활성 감소를 나타내었으나, TBH로 유도된 ALT 활성에는 별다른 영향을 미치지 않았다. TBH로 유도된 AST 활성은 baicalin 100 皿 의 농도에서 125.
- 7%로 TBH 단독 군에 비해 현저한 LDH 활성 감소를 나타내었으나, TBH로 유도된 ALT 활성에는 별다른 영향을 미치지 않았다. TBH로 유도된 AST 활성은 baicalin 100 皿 의 농도에서 125.9土3.4%로 TBH 단독 군에 비해 현저히 감소되 었다.
- Fig. 6에서 보는 바와 같이 LDH, ALT 및 AST 활성은 GalN 단독군의 경우 각각 229.2+5.2, 188.9+18.6 및 203.5+11.5%로 대조군에 비해 현저한 활성 증가를 나타내었다. 이러한 LDH 활성의 증가는 glycyrrhizin 0.
- 5%로 대조군에 비해 현저한 활성 증가를 나타내었다. 이러한 LDH 활성의 증가는 glycyrrhizin 0.1과 1皿의 농도에서 GalN 단독 군에 비해 현저한 LDH 활성 억제를 나타내었으며, glycyrrhizin 1 uM의 농도에서도 GalN 단독군에 비해 현저하게 ALT 활성이 감소되었다. 그러나 이와는 달리 glycyrrhizin은 AST 활성에는 별다른 영향을 미치지 않았다.
- 1 및 1皿의 농도에서 GalN 단독군에 비해 GalN으로 유도된 LDH 활성 증가를 현저히 억제하였으나 GalN으로 유도된 ALT 수치에는 별다른 영향을 미치지 않았다. GMN으로 유도된 AST 활성의 증가는 baicalin 0.1 曲의 농도에서 GalN 단독군에 비해 현저히 감소하였다(Fig. 7).]
- 먼저 glycyrrhizin과 baicalin의 간세포 독성작용을 알아보기 위하여 일차 배양 간세포를 이용한 MTT assay를 시행한 결과 glycyrrhizin과 baicalin의 가 각각 625.2 및 807.3 讯也로 본 실험에서 사용된 glycyrrhizin과 baicalin의 최고농도인 100 jiM 처치 시도 세포독성을 나타내지 않음을 알 수 있었다.
- 26) 본 연구 결과에서 보듯이 CCL 처치 시 LDH, ALT 및 AST 수치가 현저히 증가되었으며 glycyrrhizin은 100 pM의 고농도에서만。兀로 유도된 ALT 및 AST 수치를 현저히 억제하였다. 그러나 이와는 달리 baicalin 처치 시 10 및 100 pM의 농도에서 CCI4로 증가된 ALT 수치를 억제하였을 뿐 아니라 모든 처치 농도에서 CCL로 증가된 LDH와 AST를 현저히 억제하였다. 이상의 결과로 보아 baicalin이 glycghizin에 비해 CCL에 의한 간세포 독성에 대해 탁월한 간세포 보호 작용이 있음을 알 수 있었다.
- 그러나 이와는 달리 baicalin 처치 시 10 및 100 pM의 농도에서 CCI4로 증가된 ALT 수치를 억제하였을 뿐 아니라 모든 처치 농도에서 CCL로 증가된 LDH와 AST를 현저히 억제하였다. 이상의 결과로 보아 baicalin이 glycghizin에 비해 CCL에 의한 간세포 독성에 대해 탁월한 간세포 보호 작용이 있음을 알 수 있었다.
- 간접적으로 반응하여 과산화 과정을 통해 간세포의 세포고사나 세포 괴사를 일으킨다.gw) 본 실험결과에서 감초의 glycyrrhizin은 모든 처치 농도에서 TBH로 인한 LDH 및 ALT의 증가를 뚜렷이 억제하였으며, 황금의 baicalin 또한 고농도에서 TBH로 유도된 LDH 및 ALT 수치를 현저히 억제하였다. 이러한 결과는 血泌와 HwangS의 실험 결과와도 유사하게 나타났으며, glycyrrhizin과 baicalin의 간세포 보호 작용은 아마도 항산화 작용을 통해 나티나는 것으로 여겨진다.
- 간세포 내에 GalN의 처치는 인간의 바이러스성 간염과 유사한 간독성을 나타내며, 28) 이는 GalN이 간세포 내에 RNA와 단백질 합성 저해를 통해 독성을 유발한다고 한다. 감초의 glycyrrhizin은 일부 저농도에서 GalN으로 유도된 LDH 및 ALT 증가를 억제하는 효과를 뚜렷이 나타내었으며, 황금의 baicalinE 저농도 처치 시 GalN으로 유도된 LDH 및 AST의 증가를 현저히 억제하였다.
- 9%로 대조군에 비해 현저한 활성 증가를 나타내었다. Glycyrrhizin은 CCI4로 유도된 LDH 활성 증가에는 별다른 영향을 미치지 않았으나 glycyrrhizin 100 卩M의 농도에서 ALT 수치는 168.6±15.9%로, AST 수치는 139 8±8.4%로 CCL 단독 군에 비해 현저히 억제되었다. Fig.
- 이상의 결과를 보아 감초의 glycyrrhizin과 황금의 baicalin은 흰쥐의 일차배양 간세포에서 우수한 급성 간독성 억제 작용을 나타내는 것으로 여겨진다. 또한 본 결과를 바탕으로 현재 생체 내 동물 모델을 이용한 간장 보호 효능 및 작용기전 연구가 진행 중이다.
후속연구
- 이상의 결과를 보아 감초의 glycyrrhizin과 황금의 baicalin은 흰쥐의 일차배양 간세포에서 우수한 급성 간독성 억제 작용을 나타내는 것으로 여겨진다. 또한 본 결과를 바탕으로 현재 생체 내 동물 모델을 이용한 간장 보호 효능 및 작용기전 연구가 진행 중이다.
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