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제안 방법
- ELISA readers. 405 nm에서 흡광도를 측정하고 실험군의 평균 OD405 값을 구하여 대조군의 평균 ODms 값에 대한 백분율로 나타내었다.27刽)
- Clone M-3의 melanin 생합성에 대한 새삼, 실새삼 및 갯실새 삼의 영향을 확인하기 위하여 10~50 卩g/mZ의 농도로 48시간 처리하였다. 시료의 melanin 생성 억제 정도는 실험에 적용한 최고 농도인 50 卩以血의 농도에서 다음과 같이 나타났다.
- Clone M-3의 tyrosinase 활성에 대한 새삼, 실새삼 및 갯실새삼의 영향을 확인하기 위하여 10〜50 卩g/m/의 농도로 48시간 처리하였다. 시료의 tyrosinase 활성 저해율은 실험에 적용한 최고 농도인 50 卩g/mZ의 농도에서 다음과 같은 순서로 나타났다.
- Melanin 양 측정법은 Hosoi 등의 방법을 변형하여 사용하였다. 96-well cell culture plate에 대수 증식기의 Clone M-3 세포를 1乂1。5 cell/weU씩 첨가하고 1개의 well에는 세포 부유액 대신 배지만 넣어 흡광도 측정 시 blank로 사용하였다.
- 분말로 된 새삼, 실새삼 및 중국 토사를 각각 50 g 취하여 증류수 5001血로 90°C에서 24시간 추출한 후 여과하고 300 m四 증류수로 2회 더 추출한 뒤 여액을 합하여 rotary vacuum evaporator로 60°C 수욕 상에서 감압 농축하여 동결 건조 시킨 것을 냉동 보관하였다. 따로 새삼, 실새삼 및 중국 토사를 각각 50 g 취하여 에탄올 500 成로 실온에서 24시간 동안 1회 추 출하고 300 mZ의 에탄올로 2회 더 추출한 뒤 그 여액을 합하여 rotary vacuum evaporator로 감압 농축하여 동결건조시킨 것을 냉동 보관하였다. 새삼과 실새삼의 줄기는 각각 건조하지 않은 상태로 단편화한 후면 거즈에 싸서 즙을 내어 원심분리한 후 상징액을 취하여 건조하지 않고 그대로 냉동보관 하였다.
- 검체 투여가 끝난 plate를 37°C, 5% CO2 배양기에서 4& 시간 배양한 후 2mg/m/ 3-(4, 5-Dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl-2H- tetrazolium bromide(MTT) 용액 50 p〃well을 넣고 다시 4시간 동안 배양하였다. 배양 종료 후 3000rpm에서 30분간 원심분리 후 배지를 제거하고 Dimethyl sulfoxide(DMSO) 150 p〃well을 첨가하고 15분간 실온에서 진탕하여 살아있는 세포가 MTT와 반응하여 생성된 보라색의 불용성 formazan을 용해시키고 균일하게 만든 후 ELISA reader[Biotek Instruments 사(U.S.A.)의 ELx808J로 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군과 실험군의 세포 생존율은 실험군의 평균。。汹 값을 구하여 대조군의 평균 OEy。값에 대한 백분율로 나타내었다.
- 중국 토사는 종자만을 구입하여 건조 후 분말로 만들었다. 분말로 된 새삼, 실새삼 및 중국 토사를 각각 50 g 취하여 증류수 5001血로 90°C에서 24시간 추출한 후 여과하고 300 m四 증류수로 2회 더 추출한 뒤 여액을 합하여 rotary vacuum evaporator로 60°C 수욕 상에서 감압 농축하여 동결 건조 시킨 것을 냉동 보관하였다. 따로 새삼, 실새삼 및 중국 토사를 각각 50 g 취하여 에탄올 500 成로 실온에서 24시간 동안 1회 추 출하고 300 mZ의 에탄올로 2회 더 추출한 뒤 그 여액을 합하여 rotary vacuum evaporator로 감압 농축하여 동결건조시킨 것을 냉동 보관하였다.
- 새삼, 실새삼 및 갯실새삼의 미백작용과 항산화 작용을 규명하기 위하여 mouse melanoma Clone M-3의 생존율에 대한 영향을 측정하여 생체에 대한 안정성을 검증한 후 동일 세포의 melanin 생합성과 tyrosinase 활성에 미치는 영향을 측정하여 미백효과를 검증하였고 DPPH free radical 제거 능을 측정하여 항산화 효과를 검증함으로써 피부 미백제로서의 효용 및 안전성을 확인하였고, 향후 개발 가능성을 알아보기 위하여 실험을 시행하여, 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 새삼, 실새삼 및 갯실새삼의 영향을 확인하기 위하여 10-50 卩血의 농도로 48人] 간 처리하였다. DPPH radical 제거 활성은 실험에 적용한 최고 농도인 50 昭同의 농도에서 다음과 같이 나타났다.
- 96-well cell culture plate에 대수 증식기의 Clone M-3 세포를 1乂1。5 cell/weU씩 첨가하고 1개의 well에는 세포 부유액 대신 배지만 넣어 흡광도 측정 시 blank로 사용하였다. 시료 용액은 원하는 농도의 10배 용액으로 만들어 PBS로 희석하여 20 pi/well 씩 첨가하였고 세포 부유액을 넣은 well 중 마지막 well에는 시료 대신 PBS를 첨가하여 100% melanin 생성 군(Control)으로 하였다. 검체 투여가 끝난 plate를 37°C, 5% CO2 배양기에서 4& 시 간 배양하였다.
- 96-well cell culture plate에 대수 증식기의 Clone M- 3 세포를 1X105 cell/well 씩 첨가하고 1개의 well에는 세 포부 유액 대신 배지만 넣어 흡광도 측정 시 blank로 사용하였다. 시료 용액은은 원하는 농도의 10배 용액으로 만들어 PBS로 희석하여 20 世/wel씩 첨가하였고 세포 부유액을 넣은 마지막 well에는 시료 대신신 PBS를 첨가하여 100% tyrosinase 활성 군(Control)으로 하였다. 검체 투여가 끝난 platet 37°C, 5% CO2 배양기에서 48시간 배양하였고 종료 후 3000 rpm에서 20분간 원심분리하고 배지를 제거한 뒤 PBS로 2회 세척하여 준비한 세포 침전물에 lOOpZ/well의 세포 용해액(1% Triton X-100, 10 mM sodium phosphate, 0.
- Clone M-3 세포를 2xi()4 cell 씩 각 well에 첨가하고 1개의 well에는 세포 부 유액 대신 배지만 넣어 흡광도 측정 시 blank로 사용하였다. 시료 용액은은 원하는 농도의 10배 용액으로 만들어 PBS로 희석하여 20B/well씩 첨가하였고 세포 부유액을 넣은 well 중 마지막 well에는 시료 대신 PBS를 첨가하여 100% 생존 군으로 하였다. 검체 투여가 끝난 plate를 37°C, 5% CO2 배양기에서 4& 시간 배양한 후 2mg/m/ 3-(4, 5-Dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl-2H- tetrazolium bromide(MTT) 용액 50 p〃well을 넣고 다시 4시간 동안 배양하였다.
- 시료를 각 농도별로 조제한 용액 100p/(control : 99.5% ethanol)에 0.1 mM DPPH(99.5% ethanol)용액 950 p/와 0.1 M sodium acetate buffer 950 p/를 가하였다. 30초 동안 진탕하고 30분간 실온에서 반응시킨 후 517nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 30초 동안 진탕하고 30분간 실온에서 반응시킨 후 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료의 항산화 활성은 각 농도의 실험군의 OD517 값을 구하여 대조군의 OR” 값에 대한 백분율로 나타내었다.33'初
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 Clone M-3는 한국세포주은행 (Korean Cell Line Bank; KCLB) 에서 분양받은 mouse melanoma 세포이다. Clone M-3는 10% fetal bovine serum(FBS, Hyckme사, Canada)이 포함된 RPMI medium 1640 (Gibco사, U.
- 본 실험에 사용한 새삼, 실새삼은 줄기와 종자로 분류하여 건조하고 분말로 만들었다. 중국 토사는 종자만을 구입하여 건조 후 분말로 만들었다.
- 상징액을 제거하고 성장 배지를 넣어 세 포부 유액을 만들어 1:3으로 계대 배양하였다. 일부는 냉동 배지에 분산하여 냉동 후 액체질소 tank에 보관하였으며 본 실험에는 2〜10세대 사이의 세포를 사용하였다.
데이터처리
- 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 실험군의 평균 01法5 값을 구하여 대조군의 평균 OD^ 값에 대한 백분율로 나타내었다.紐32)
이론/모형
- Tyrosinase 활성도는 Matinez-Esparza 등의 방법에 의하여 측정하였다. 96-well cell culture plate에 대수 증식기의 Clone M- 3 세포를 1X105 cell/well 씩 첨가하고 1개의 well에는 세 포부 유액 대신 배지만 넣어 흡광도 측정 시 blank로 사용하였다.
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