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제안 방법
- Indole 생성 시험은 1% peptone이 포함된 tryptone 액체배지에 균주를 접종한 후, 20방울의 Kovac 시약을 첨가하여 시험관을 가볍게 흔들어 주면서 배지의 색 변화를관찰하였다. H2S의 생성은 KIA (Difco, Detroit, MI, USA)에 균주를 접종한 후, 고체배지 표면의 색 변화를관찰하였으며, gelatin 평판배지에 균주를 접종한 후, HgCL를 첨가하여 집락 주위에 투명대 형성을 관찰하였고 urease 생성 여부는 색의 변화를 관찰하였다. Lithmus milk 시험은 lithmus milk (Difco, Detroit, MI, USA)에 균주를 접종하여 37℃에서 48시간 배양한 후 펩톤화 (peptonization)를 관찰하였다 [19].
- 5% glucose 가 포함된 MR-VP 배지에 분리 세균을 접종한 후 MR 배지에서는 pH 지시약인 methyl red를 3방울 떨어뜨리고, VP 배지에는 a-naphthol 12방울과 40% KOH 6방울을 첨가 후 색깔 변화를 관찰하였다 [18]- 분리 세균의 citrate 이용여부를 조사하기 위하여 Simmon's citrate 평판배지 (Difco, Detroit, MI, USA)에 분리세균을 접종한 후, 색 변화를 관찰하였고, 녹말의 분해여부를 알아보기 위하여 녹말 고체평판배지에 세균을 접종하고 그람 요오드 용액을첨가하여 집락 주위에서 투명대 형성여부를 관찰하였다. Indole 생성 시험은 1% peptone이 포함된 tryptone 액체배지에 균주를 접종한 후, 20방울의 Kovac 시약을 첨가하여 시험관을 가볍게 흔들어 주면서 배지의 색 변화를관찰하였다. H2S의 생성은 KIA (Difco, Detroit, MI, USA)에 균주를 접종한 후, 고체배지 표면의 색 변화를관찰하였으며, gelatin 평판배지에 균주를 접종한 후, HgCL를 첨가하여 집락 주위에 투명대 형성을 관찰하였고 urease 생성 여부는 색의 변화를 관찰하였다.
- H2S의 생성은 KIA (Difco, Detroit, MI, USA)에 균주를 접종한 후, 고체배지 표면의 색 변화를관찰하였으며, gelatin 평판배지에 균주를 접종한 후, HgCL를 첨가하여 집락 주위에 투명대 형성을 관찰하였고 urease 생성 여부는 색의 변화를 관찰하였다. Lithmus milk 시험은 lithmus milk (Difco, Detroit, MI, USA)에 균주를 접종하여 37℃에서 48시간 배양한 후 펩톤화 (peptonization)를 관찰하였다 [19].
- 본 연구를 통하여 콩 발효식품으로부터 혈전분해효소 활성이 우수한 세균인 Bacillus sp. MK-15를 분리하였으며, 이 균주의 생리화학적 특성조사를 실시하였다. 향후 Bacillus sp.
- 1 thrombin을 첨가하여 혼합한 후, 즉시 well plate에 붓고 실온에서 5-10 분간 방치하여 굳힌 다음 cork borer로 구멍을 만들어 fibrin plate를 제조하였다 [17]. 각 시료 50 成를 취하여 fibrin plate의 시료구멍에 주입하고 37℃에서 18시간동안 반응시킨 후, fibrin plate의 용해 면적을 측정하였다. 대조구로서는 정제된혈전용해효소인 plasmin (1.
- 균주의 생육과정에서 혈전용해효소를 생산하여 투명 환을 나타내는 균주를 1차 선별하여 [15], 132시간 동안 배양하면서 24시간 단위로 배양액을 원심분리한 상등액에 대하여 혈전용해 효소활성을 측정하였다. 배양에는 2% skim milk를 첨가한 PCA 배지를 사용하였으며, 효소 활성측정을 위한 단백질 배지는 콩을 믹서로 분쇄한 후, 고운체(mesh)를 이용하여 거른뒤, 5 g의 콩가루에 0.
- 대조구로서 plasmin을 이용하였으며, 영양배지 (nutrient agar)에서 배양한 경우와 콩배지에서 배양한 경우의 solid fibrinolytic activity을 관찰하였다 [그림 1]. Plasmin을 대조군으로 보았을 때, 콩배지에서 배양한 경우의 solid fibrinolytic activity는 2.
- 각 시료 50 成를 취하여 fibrin plate의 시료구멍에 주입하고 37℃에서 18시간동안 반응시킨 후, fibrin plate의 용해 면적을 측정하였다. 대조구로서는 정제된혈전용해효소인 plasmin (1.0 unit/n粉을 사용하였으며, 다음과 같은 방법으로 혈전용해 활성을 계산하였다.
- 배양된 MicroPlate의 결과는 직접 확인하였으며, MicroLog™ database software를 통해 동정하였다. 또한 분리 세균에 대하여 16S rRNA의 염기서열 분석을 실시하여 NCBI의 GenBank program을 사용하여 상동성을 조사하였다.
- 96 well plates에 각각 다른 종류의 탄소원을 넣고, MK-15를 접종하여 탄 소원 이용여부를 조사하였으며, MicroLog™ database soWare를 이용하여 분석한 결과, 이 세균은 98% 이상의 신뢰도를 보이는 Bacius subtilise 동정되었다 [표 2]. 또한 이 혈전용해 활성세균에서 16S rRNA 유전자의 일부를 PCR 반응으로 증폭하여 염기서열을 결정하였다 [그림 2]. MK-15세균에 대한 16S rRNA 염기서열을 NCBI의 GenBank program을 사용하여 상동성을 조사한 결과, 이 세균은 이미 보고된 Bacillus 속(genus)의 염기서열과 비교하여 볼 때 매우 높은 상동성을 나타냈다.
- )를 이용하여 20%까지 맞추고 GP2 MicroPlate의 96개의 well에 각각 150 以씩 분주하였고, 30℃ 에서 4-6 시간 동안 배양하였다. 배양된 MicroPlate의 결과는 직접 확인하였으며, MicroLog™ database software를 통해 동정하였다. 또한 분리 세균에 대하여 16S rRNA의 염기서열 분석을 실시하여 NCBI의 GenBank program을 사용하여 상동성을 조사하였다.
- 균주의 생육과정에서 혈전용해효소를 생산하여 투명 환을 나타내는 균주를 1차 선별하여 [15], 132시간 동안 배양하면서 24시간 단위로 배양액을 원심분리한 상등액에 대하여 혈전용해 효소활성을 측정하였다. 배양에는 2% skim milk를 첨가한 PCA 배지를 사용하였으며, 효소 활성측정을 위한 단백질 배지는 콩을 믹서로 분쇄한 후, 고운체(mesh)를 이용하여 거른뒤, 5 g의 콩가루에 0.02% KH2PO4를 섞고, 100℃에서 30분간 끓인 뒤, 여과지 (Advantec No. 2)로 걸러 12「C에서 15분간 고압 멸균하였다.
- 본 논문에서는 전통방법에 의해 발효된 청국장으로부터 혈전용해활성을 가지는 MK-15 세균을 분리하여 동정하였다. 혈전용해활성을 가지는 이 세균에 대한 다양한 생리 화학적 안 특성 조사를 실시하였으며, 혈전용 해 활성을 측정하였다.
- 상당히 유익하다는 인식이 확산되면서 청국장에 대한 새로운 차원에서 관심이 고조되고 있다. 본 연구에서는 전통방법에 의해 발효된 청국장으로부터 발효에 관여하는 세균을 분리하여 생리화학적인 특성조사를 실시하였고, 16S rRNA 염기서열을 통하여 동정하였으며, 이 분리세균이 가지는 혈전용해활성도 조사하였다.
- 분리 세균의 생리 화학적 특성을 조사하기 위하여 glucose 이용여부, methyl red-voges proskauer (MR-VP) 시험, citrate와 녹말의 이용여부, indole 생성유무, Klingler iron agar (KIA) 시험, gelatin 이용여부, urease 존재여부, lithmus milk 시험 등을 실시하였다. 탄소원으로 1% glucose가 포함된 액체배지에 분리된 세균을 접종한 후, 색의 변화를 관찰하였으며, 0.
- 배양기에서 꺼낸 튜브로부터 100 成의 청국장 현탁액을 고체 영양배지(nutrient agar)에 도말하고 37E 에서 48 시간동안 배양하여 단일세균인 MK-15를 분리하였다. 이 분리세균을 청국장 생산 균주으로 이용하기 우하여특성조사를 실시하였다.
- 청국장에서 분리한 균주인 MK-15를 영양평판배지에도말하여 단일 집락의 형태학적 관찰을 하였고, 그람 염색 후 위상차 현미경으로 세균의 형태학적 특성을 조사하였다. 분리 세균의 생리 화학적 특성을 조사하기 위하여 glucose 이용여부, methyl red-voges proskauer (MR-VP) 시험, citrate와 녹말의 이용여부, indole 생성유무, Klingler iron agar (KIA) 시험, gelatin 이용여부, urease 존재여부, lithmus milk 시험 등을 실시하였다.
- 청국장에서 분리한 세균인 MK-15의 동정은 여러 가지 생리생화학적 시험과 GP2 Microplate™ Identification System (BIOLOG, Hayward, USA)를 이용하여 동정하였다. 사용된 베]지는 BUG agai와 0.
- 충남 예산 지역에서 전통발효방법으로 생산된 청국장으로부터 발효에 관여하는 세균들을 농화(enrichment)시켜 우점종이며 발효능이 뛰어난 3 종류의 집락을 분리하였다. 이들 세균 가운데 영양고체평판배지에서 3회에 걸친 도말평판법을 통한 순수배양으로 발효능이 탁월한 세균인 MK-15를 분리하였다.
- 콩배지에서 최적조건으로 배양한 청국장 발효균주 MK-15에서 생성하는 solid fibrinolytic activity를 관찰하였다. 대조구로서 plasmin을 이용하였으며, 영양배지 (nutrient agar)에서 배양한 경우와 콩배지에서 배양한 경우의 solid fibrinolytic activity을 관찰하였다 [그림 1].
- 분리 세균의 생리 화학적 특성을 조사하기 위하여 glucose 이용여부, methyl red-voges proskauer (MR-VP) 시험, citrate와 녹말의 이용여부, indole 생성유무, Klingler iron agar (KIA) 시험, gelatin 이용여부, urease 존재여부, lithmus milk 시험 등을 실시하였다. 탄소원으로 1% glucose가 포함된 액체배지에 분리된 세균을 접종한 후, 색의 변화를 관찰하였으며, 0.5% glucose 가 포함된 MR-VP 배지에 분리 세균을 접종한 후 MR 배지에서는 pH 지시약인 methyl red를 3방울 떨어뜨리고, VP 배지에는 a-naphthol 12방울과 40% KOH 6방울을 첨가 후 색깔 변화를 관찰하였다 [18]- 분리 세균의 citrate 이용여부를 조사하기 위하여 Simmon's citrate 평판배지 (Difco, Detroit, MI, USA)에 분리세균을 접종한 후, 색 변화를 관찰하였고, 녹말의 분해여부를 알아보기 위하여 녹말 고체평판배지에 세균을 접종하고 그람 요오드 용액을첨가하여 집락 주위에서 투명대 형성여부를 관찰하였다. Indole 생성 시험은 1% peptone이 포함된 tryptone 액체배지에 균주를 접종한 후, 20방울의 Kovac 시약을 첨가하여 시험관을 가볍게 흔들어 주면서 배지의 색 변화를관찰하였다.
- 혈전용해활성을 가지는 세균인 MK-15에 대하여 형태학적 관찰과 생리화학적 특성을 조사하였다. 이 세균은 위상차 현미경으로 관찰한 결과는 간상형으로 나타났으며, 그람염색을 실시하여 그람 양성임이 확인되었다.
- 혈전용해활성을 가지는 이 세균에 대한 다양한 생리 화학적 안 특성 조사를 실시하였으며, 혈전용 해 활성을 측정하였다. Biolog 시험과 16S rRNA 염기서열 분석을 통하여 Bacillus subtilise 동정되었으며, 얻어진 분석 결과는 GenBank에 [DQ163021]로 등록되었다.
- 형태학적 및 생리학적 특성을 관찰한 혈전용해 활성 세균인 MK-15에 대한 동정(identification)을 실시하였다. 먼저 이 세균에 대하여 다양한 탄소원 이용여부를 확인하는 BIOLOG system을 사용하였다.
대상 데이터
- 사용된 베]지는 BUG agai와 0.2%의 maltose를 혼합하여 만들었다. 세균 현탁액을 Biolog Turbidimeter (BIOLOG, Hayward, USA.
- 청국장에서 분리된 균주는 2% skim milk를 첨가한 plate count agar (PCA) 배지에서 24시간 배양하였다. 균주의 생육과정에서 혈전용해효소를 생산하여 투명 환을 나타내는 균주를 1차 선별하여 [15], 132시간 동안 배양하면서 24시간 단위로 배양액을 원심분리한 상등액에 대하여 혈전용해 효소활성을 측정하였다.
- 충남 예산지역의 농가에서 전통방법에 의해 제조된 청국장을 채취하여 원심분리용 튜브에 1 g의 청국장 시료와 5 M 생리식염수에 넣고 진탕배양기에 2시간 방치하였다. 배양기에서 꺼낸 튜브로부터 100 成의 청국장 현탁액을 고체 영양배지(nutrient agar)에 도말하고 37E 에서 48 시간동안 배양하여 단일세균인 MK-15를 분리하였다.
이론/모형
- 실시하였다. 먼저 이 세균에 대하여 다양한 탄소원 이용여부를 확인하는 BIOLOG system을 사용하였다. 96 well plates에 각각 다른 종류의 탄소원을 넣고, MK-15를 접종하여 탄 소원 이용여부를 조사하였으며, MicroLog™ database soWare를 이용하여 분석한 결과, 이 세균은 98% 이상의 신뢰도를 보이는 Bacius subtilise 동정되었다 [표 2].
- 혈전용해활성 측정은 Astrup 등 [16]의 방법에 의해 0.1 M 인산완충용액에 fibrinogen을 0.3%가 되도록 용해시키고, 완전히 용해된 fibrinogen 용액 5 mH에 동일한 완충용액에 1% agarose 용액 5 를 첨가하여 충분히 혼합하였다. 여기에 0.
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