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문제 정의
- 본 연구의 궁극적인 목적은 우리나라의 전통 건강 발효식품으로 알려져 있는 청국장의 발효에 관여하는 세균을 이용하여 혈전용해효소를 생산하는데 있다. 이 목적을 수행하기 위하여 기초단계로서 청국장으로부터 혈전 용해 활성을 갖는 Bacillus licheniformis HK-12를 분리하였으며, 이 세균이 배양시간에 따라 생성하는 단백질을 2-DE 와 MALDLTOF를 활용하여 프로테옴 분석을 실시하였다.
- 3 plasmin unit으로 나타났다 [그림 1], 혈전용해효소의 활성은 배양 온도, 배양초기 pH, 금속이온, 저해제 등의 다양한 물리화학적 요인들에 의하여 영향을 받는 것으로 보고되고 있다. 여기에서는 선별된 B. licheniformis HK-12에서 생산되는 혈전용해효소의 특성을 규명하기 위하여 수행하였으며, 분리된 효소를 정제하여 분자량의 크기를 측정하였고, 혈전용해능을 가지는 단백질을 동정하기 위한 연구로 범위를 한정하였다.
제안 방법
- 균주의 생육 과정에서 protease를 생산하여 투명대(clear zone)를 형성하는 균주를 1차 선별하였고, 혈전용해효소(fibrinolytic enzyme)를 생산하는 균주를 분리하기 위하여 1차 선별 균주들을 5 祝의 액체 영양배지(nutrient broth)에 각각 접종하였다. 1차 선별균주들을 48 시간동안 배양한 뒤 균체를 제거한 배양 상등액을 피브린 평판(fibrin plate)에 점적하여 가장 큰 투명대를 형성한 균주를 활성균주로 최종 선별하였으며, 배양액을 원심 분리한 상등액에 대하여 혈전 용해 효소 활성을 측정하였다.
- 2-D PAGE상에서 급격히 증가된 spot #1에 trypsin을 처리하여 peptide 절편으로 만든 후, MALDI-TOF mass spectrometry를 실시하였다 [그림 4]. MALDI-TOF 분석 결과 나타난 spot #1의 peptide 분자량을 분석 프로그램 Mascot (www.
- 2-DE 상에서 발현의 차이가 나타난 단백질 spot을 동정하기 위해 MALDI-TOF/MS (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometer, Voyager-DE STR Biospectrometry, Applied Biosystems Inc., Germany)을 통하여 분석하였다. 단백질 spot을 microcentrifuge tube로 옮긴 후 30 mM potassium ferricyanide^]- 100 mM sodium thiosulfate# 1:1 로 혼합한 용액으로 g이에 염색된 silver nitrate를 제거하였다.
- B. licheniformis HK-12 배양에서 생성된 혈전 용해 효소의 SDS-PAGE와 분자량을 측정하기 위하여 단백질 정제를 실시하였다. 그 결과 침전을 통해 얻어진 총단백질의 양은 3.
- B. licheniformis HK-12 의 배양상등액을 ammonium sulfate 에 의한 침전, DEAE-cellulose chromatography, Sephadex G-75 chromatography를 사용하여 정제하였으며, SDS-PAGE를 통하여 혈전 용해 효소의 분자량을 결정하였다. B.
- B. licheniformis HK-12에서 생산되는 혈전용해 관련 효소의 배양시간에 따른 발현율을 확인하기 위하여 2-DE 를 수행하였다. 배양 12 시간과 36 시간에서 생성되는 세포 외 단백질의 발현을 비교한 결과, 배양 시간이 경과함에 따라 생성되는 세포외 단백질의 종류와 발현양이 점차 증가하는 것이 관찰되었고, 특히 spot #1은 배양 36 시간에서 급격히 발현양이 증가되었다.
- licheniformis HK-12 의 배양상등액을 ammonium sulfate 에 의한 침전, DEAE-cellulose chromatography, Sephadex G-75 chromatography를 사용하여 정제하였으며, SDS-PAGE를 통하여 혈전 용해 효소의 분자량을 결정하였다. B. licheniformis HK-12의 배양 시간에 따른 혈전용해효소 생산의 차이를 2-DE를 통하여 확인하였으며, 현저히 증가된 혈전용해효소의 단백질 spot #1을 MALDI-TOF MS 분석을 통하여 serine protein kinase (PrkA)로 동정하였다.
- HK-12 배양에서 생산된 혈전용해 효소의 정제 여부와 분자량을 확인하기 위하여 SDS-PAGE를 실시하였다 [10], SDS-PAGE에서 Separating gel은 12% acrylamide gel을 사용하였고, stacking gel은 5% acrylamide gel을 사용하여 전개하였다. Bradford 방법으로 단백질 정량을 실시하여 동일량의 단백질을 준비하였고, 5x sample buffer 로 총량을 맞추었다.
- , Little Chalfont, England)를이용하여 300 V에서 30 분, 500 V에서 30 분, 1000 V에서 1 시간 30 분 3000 V에서 1 시간 30 분 5000 V에서 1 시간 30 분, 8000 V에서 2 시간, 마지막으로 8000 V에서 1 시간 동안 fbcusing을 실시하였다. IEF (iso electronic focusing)o] 끝난 후 gel을 DTT (10 mg/口粉가첨가된 equilibration buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.8, 6 M urea, 30% glycerol, 2% SDS, 0.002% bromophenol blue)에서 15 분간 평형화를 실시하였다. SDS-PAGE는 PROTEIN II XL electrophoresis kit (Bio-Rad, Co)를 사용하여 gel 당 5 皿로 1 시간 동안 전기영동 하고, 다시 gel 당 10 mA로 13 시간 동안 전기영동 하였다.
- 002% bromophenol blue)로 단백질 표 품을 녹여, Immobiline DryStrip gel (pH 3-10, 18 cm) (Amersham Biosciences Co) 을 rehydration 시 켰다. Rehydration이 끝난 후, 팽윤된 gel을 manifold gel tray (Amersham Biosciences Co) 로 옮긴 후, IPGphor (Amersham Biosciences Co., Little Chalfont, England)를이용하여 300 V에서 30 분, 500 V에서 30 분, 1000 V에서 1 시간 30 분 3000 V에서 1 시간 30 분 5000 V에서 1 시간 30 분, 8000 V에서 2 시간, 마지막으로 8000 V에서 1 시간 동안 fbcusing을 실시하였다. IEF (iso electronic focusing)o] 끝난 후 gel을 DTT (10 mg/口粉가첨가된 equilibration buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.
- Gel 염색은 silver staining 방법으로 실시하였다. 고정 용액 (50% ethanol, 10% acetic acid) 에 1 시간 동안 고정시키고, 감광 용액 (0.02% sodium thiosulfate, 30% ethanol, 83 mM sodium acetate)에 30 분 동안 gei을 반응시킨 후 증류수로 5 분간 3 회 세척하였다. 세척 후 gei을 silver reagent (0.
- 배양기에서 꺼낸 튜브로부터 100 以의 청국장 현탁액을 고체 영양 배지(nutrient agar)에 도말하고 37'C 에서 48 시간동안 배양한 후 생성된 집락을 1% skim milk가 첨가된 plate count agar 배지에서 24 시간동안 배양하였다. 균주의 생육 과정에서 protease를 생산하여 투명대(clear zone)를 형성하는 균주를 1차 선별하였고, 혈전용해효소(fibrinolytic enzyme)를 생산하는 균주를 분리하기 위하여 1차 선별 균주들을 5 祝의 액체 영양배지(nutrient broth)에 각각 접종하였다. 1차 선별균주들을 48 시간동안 배양한 뒤 균체를 제거한 배양 상등액을 피브린 평판(fibrin plate)에 점적하여 가장 큰 투명대를 형성한 균주를 활성균주로 최종 선별하였으며, 배양액을 원심 분리한 상등액에 대하여 혈전 용해 효소 활성을 측정하였다.
- 2-Dimensional electrophoresis (2-DE)는 세균이 어떤 환경의 변화에 노출되었을 때, 발현되는 세균의 모든 수용성 단백질을 전개시키기 때문에 선별을 통하여 이들 단백질의 유도 여부를 확인할 수 있다. 따라서 혈전용해효소를 생산하는 세균에 대하여 이 프로테옴 분석법을 적용하여 배양기간동안에 이 효소의 생산을 확인하고, 동정을 하였다.
- 본 논문에서는 충남 예산지역의 농가에서 전통발효 방법으로 제조된 청국장으로부터 Bacillus licheniformis HK・12를 분리하여 혈전용해활성과 프로테옴 분석을 실시하였다. B.
- 6%가 되도록 용해시키고, 완전히 용해된 fibrinogen 용액 5 皿에 동일한 완충용액에 1% agarose 용액 5 r戒를 첨가하여 충분히 혼합하였다. 여기에 100 畝 thrombin (100 NIH unit/mQ (Sigma Co, St. Louis, MO, US A) 을 첨가하여 혼합한 후, 즉시 Petri dish 에 붓고 실온에서 5-10 분간 방치하여 굳힌 다음, Pasteur pipette으로 지름 3 mm 구멍을 만들어 fibrin plate를 제조하였다, 각 시료 10 以를 취하여 fibrin plate의 시료 구멍에 주입하고 37°C에서 18 시간 동안 반응시킨 후, 생성된 투명 대의 서로 수직인 두 개의 지름을 측정하였다 투명대가 타원인 경우에는 가장 긴지름 (山)과 가장 짧은 지름 他)을 측정하여 투명대의 면적을 (而 그 兀 X di/2 X d2/2 의 공식에 의거하여 측정하였다. 대조구로서는 정제된 혈전 용해 효소인 plasmin (1.
- 영양 액체배지에서 배양한 B. licheniformis HK-12의혈전용해 활성을 측정하기 위하여 피브린 평판에 배양액을 점적하여 활성을 측정하였다. Plasmin (1 imit/m幻을 대조군으로 보았을 때, HK-12의 혈전용해 활성은 약 2.
- 4) 10 mC에완전히 재현탁 하였다. 완충용액에 녹인 침전물 10 叫을투석튜브(dialysis tubing) (Sigma Co. St. Louis, MO, USA)에 넣고 1 £ 의 동일한 완충용액에서 2 시간 간격으로 3번 완충용액을 교환한 뒤 12 시간 동안 투석하였다. 투석을 마친 용액을 一70"C deep freezer에서 12 시간 동안 얼린 후 동결건조기로 농축하였다' 농축된 효소액을 20 mM Tris-HCl buffer (p 니 7.
- 5 畝/min의 유속으로 용출하였다. 용출액은 280 顶에서 분광광도계로 흡광도를 측정하였고, 혈전용해 활성을 측정하여 가장 활성이 높은 분획을 모아 동결건조기로 농축하였다. 모든 실험수행은 4C 에서 실시하였다.
- 2 网/min의 유속으로 실시하였다. 용출액은 분획기(fraction collector)로 모아 280 run에서 자외선 분광광도계로 흡광도를 측정하였고, 피브린 평판법을 통해 활성이 높은 분획을 모은 후 동결건조기로 농축하였다. 이온교환 크로마토그래피로 정제한 효소액을 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.
- 이용하여 혈전용해효소를 생산하는데 있다. 이 목적을 수행하기 위하여 기초단계로서 청국장으로부터 혈전 용해 활성을 갖는 Bacillus licheniformis HK-12를 분리하였으며, 이 세균이 배양시간에 따라 생성하는 단백질을 2-DE 와 MALDLTOF를 활용하여 프로테옴 분석을 실시하였다.
- 이들 세균 가운데 1% skim milk가 첨가된 plate count agar 배지에서 3회에 걸친 도말 평판법을 통한 순수배양으로 혈전용해효소 생성 및 활성능이 탁월한 세균인 Bacillus licheniformis HK-12를 선별하였다. 동양의 대표적인 콩발효 전통식품으로서 일본의 낫또(natto), 중국의 도치(douchi)와 함께 한국에서는 청국장이 알려져 있으며, 이들 식품들은 콩의 발효과정에서 혈전용해효소를 생산하는 것으로 알려져 있다 [11-14].
- 8 배 증가하였다 [표 1]. 정제 효소의 농축 정도와 분자량을 확인하기 위하여 단계별로 분비된 각각의 단백질 시료를 12% SDS-polyacrylamide gel에서 전기영동을 실시하였다 SDS-PAGE를 통해 정제 단계별로 증가되는 밴드와 제거되는 밴드를 관찰하였다 [그림 2],
- 정제된 혈전용해 효소의 양상을 이차원 전기영동으로 비교 분석하였다. 정제된 효소액에 40% TCA (trichloroacetic acid)을 동량 첨가하여 단백질을 침전시켰다.
- 충남 예산 지역에서 전통발효 방법으로 생산된 청국장으로부터 발효에 관여하는 세균들을 농화시켜, 혈전 용해 효소 생성 및 활성능이 뛰어난 3 개의 세균을 분리하였 匸}. 이들 세균 가운데 1% skim milk가 첨가된 plate count agar 배지에서 3회에 걸친 도말 평판법을 통한 순수배양으로 혈전용해효소 생성 및 활성능이 탁월한 세균인 Bacillus licheniformis HK-12를 선별하였다.
- 25% silver nitrate)에 30 분간 반응시키고, 증류수로 1 분씩 2 회 세척하였다. 현상 용액 (3% sodium carbonate, 40 卩戈 37% formaldehyde)에서 단백질 spot이 관찰되면 sodium EDTA (14.6 g//)로 반응을 멈추었다 염색된 gel 은 PD-QUEST Image system (Bio-Rad Co., Hercules, US A) 으로 분석하였다.
대상 데이터
- Louis, MO, US A) 을 첨가하여 혼합한 후, 즉시 Petri dish 에 붓고 실온에서 5-10 분간 방치하여 굳힌 다음, Pasteur pipette으로 지름 3 mm 구멍을 만들어 fibrin plate를 제조하였다, 각 시료 10 以를 취하여 fibrin plate의 시료 구멍에 주입하고 37°C에서 18 시간 동안 반응시킨 후, 생성된 투명 대의 서로 수직인 두 개의 지름을 측정하였다 투명대가 타원인 경우에는 가장 긴지름 (山)과 가장 짧은 지름 他)을 측정하여 투명대의 면적을 (而 그 兀 X di/2 X d2/2 의 공식에 의거하여 측정하였다. 대조구로서는 정제된 혈전 용해 효소인 plasmin (1.0 unit/mg) (Sigma Co, St. Louis, MO, US A) 을 사용하였다. 혈전용해 활성은 다음과 같이 계산하였다.
- 본 실험에 사용된 균주는 충남 예산지역의 농가에서 전통방법에 의해 제조된 청국장에서 채취하였다. 획득된 청국장 시료 1 g과 /당 8 g의 NaCI이 포함된 생리식염수 5 叫를 원심분리용 튜브에 넣고 160 rpm으로 회전하는 진탕 배양기에 2 시간 동안 방치하였다.
- 준비된 시료를 95C에서 5 분간 열처리하고, 얼음에 냉각한 후에 well에 주입하였다. 표지 단백질은 myosin (198 kDa), p-gaiactosidase (115 kDa), bovine serum albumin (90.5 kDa), glutamate dehydrogenase (61.5 kDa), ovalbumin (46.2 kDa), carbonic anhydrase (37.8 kDa), myoglobin (26 kDa), lysozyme (18.5 kDa)과 aprotinin (9 kDa) (Prestained Protein Marker, Intron, Inc., Korea)를 사용하였다. 전기영동은 stacking gel에서는 60 V에서 20 분간 실시하였고, separating ge!에서는 100 V에서 1 시간 30 분 동안 실시하였다.
데이터처리
- 동일한 10 成 matrix but如로 추출된 peptide를 녹인 후, matrix 용액과 peptide 용액을 1:1로 혼합하여 PTFE (polytetrafluoroethylene) 필름으로 코팅된 96 well plate (Applied Biosystems)에 주입하였다. Peptide의 분자량은 MALDI-TOF-MS로 분석하였고 분석된 분자량은 분석 프로그램인 Mascot (www.matrixscience.com) 와 Tigr (www.tigr.org) 으] database를 사용하여 동정하였다.
이론/모형
- 전개하였다. Bradford 방법으로 단백질 정량을 실시하여 동일량의 단백질을 준비하였고, 5x sample buffer 로 총량을 맞추었다. 준비된 시료를 95C에서 5 분간 열처리하고, 얼음에 냉각한 후에 well에 주입하였다.
- SDS-PAGE는 PROTEIN II XL electrophoresis kit (Bio-Rad, Co)를 사용하여 gel 당 5 皿로 1 시간 동안 전기영동 하고, 다시 gel 당 10 mA로 13 시간 동안 전기영동 하였다. Gel 염색은 silver staining 방법으로 실시하였다. 고정 용액 (50% ethanol, 10% acetic acid) 에 1 시간 동안 고정시키고, 감광 용액 (0.
- 혈전용해 활성(fibrinolytic activity) 측정은 Astrup 등 [9]의 방법을 따랐다. 0.
성능/효과
- 실시하였다 [그림 4]. MALDI-TOF 분석 결과 나타난 spot #1의 peptide 분자량을 분석 프로그램 Mascot (www.matrixscience.com)에서 확인한 결과, serine protein kinase (PrkA)로 동정되었다. °] serine protein kinase (PrkA) 의 amino acid sequence 를 Tigr (www.
- 특히 청국장에서 분리한 혈전 용해 능을 가지는 균주인 8. licheniformis CK 11・4에서 생산하는 혈전용해효소는 alkaline thrombophilic serine protease로서 [17], 본 연구에서 확인된 B. licheniformis HK-12도 serine protease 계열의 혈전용해효소를 생성하는 것으로 판단된다. 향후 본 연구를 통해 B.
- licheniformis HK-12 배양에서 생성된 혈전 용해 효소의 SDS-PAGE와 분자량을 측정하기 위하여 단백질 정제를 실시하였다. 그 결과 침전을 통해 얻어진 총단백질의 양은 3.06 mg/m.。였으며, 정제최종단계인 Sephadex G-75 column chromatography를 거치면서 2.
- 그 결과 혈전용해효소의 분자량은 약 23 kDa으로 측정되었다. B.
- licheniformis HK-12에서 생산되는 혈전용해 관련 효소의 배양시간에 따른 발현율을 확인하기 위하여 2-DE 를 수행하였다. 배양 12 시간과 36 시간에서 생성되는 세포 외 단백질의 발현을 비교한 결과, 배양 시간이 경과함에 따라 생성되는 세포외 단백질의 종류와 발현양이 점차 증가하는 것이 관찰되었고, 특히 spot #1은 배양 36 시간에서 급격히 발현양이 증가되었다. spot #1은 12 시간 배양 이후부터 서서히 발현되다가 36 시간에 최대로 발현되었다 [그림 3].
- HK-12 배양액에서 얻어진 조효소(crude enzyme)로부터 황산암모늄 침전, DEAE-cellulose ion exchange chromatography, Sephadex G-75 chromatography 이용한 정제단계를 거쳐 분리 . 정제한 결과 혈전용해 효소의 특이 활성은 47.4 unit/mg으로 배양 상등액에 비해 5.8 배 증가하였다 [표 1]. 정제 효소의 농축 정도와 분자량을 확인하기 위하여 단계별로 분비된 각각의 단백질 시료를 12% SDS-polyacrylamide gel에서 전기영동을 실시하였다 SDS-PAGE를 통해 정제 단계별로 증가되는 밴드와 제거되는 밴드를 관찰하였다 [그림 2],
- 청국장은 원료인 콩이 가지는 영양소 이외에도 인체의 건강증진을 위한 생리활성 물질로 알려진 식이섬유, 인지질, 사포닌(saponins), 트립신저해물질(trypsin inhibitor) 등의 성분을 포함하고 있어 동맥경화, 심장병, 당뇨병 예방효과, 노인성 치매 예방효과, 항암효과, 골다공증 억제 등의 성인병 예방효과가 있음이 발표되었다. 청국장은 또한 미생물에 의한 발효과정 중 새로운 생리활성 물질을 생성하여, 혈전용해능, 혈압 상승 억제효과 및 지질 대사개선 효과, 항 돌연변이성 및 항암성, 항균작용 등을 나타내는 것으로 보고되고 있다 [1].
후속연구
- licheniformis HK-12도 serine protease 계열의 혈전용해효소를 생성하는 것으로 판단된다. 향후 본 연구를 통해 B. licheniformis HK-12에서 생산되는 혈전용해효소의 프로테옴 분석에서 얻어진 결과를 바탕으로, 이 단백질에 대한 효소학적 및 분자유전학적 특성을 규명하는 방향으로 진행될 것이다.
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