박과 (Cucurbitaceae) 작물에서 박 (Lagenaria siceraria Standl.)은 식용뿐만 아니라 주로 저온 신장성의 확보와 토양전염성 병해를 회피하기 위한 수단으로서 수박의 대목으로 많이 사용된다. 유전공학 방법을 이용한 토양병 내성이 증대된 신품종 개발이 필요한 요즘 박 형질전환체 개발의 효과적인 시스템 확립을 위하여 식물형질전환 연구에 매우 효율적으로 이용되는 마커인 GFP 유전자를 도입하였다. 실험재료로 이용된 박 계통은 9005, 9006 및 G5였으며, 신초 유기를 위한 선발 배지는 3.0 mg/L_ BAP + 100 mg/L kanamycin +500 mg/L cefotaxime + 0.5 mg/L $AgNO_3$, pH 5.8이었다 박 선발배지에 치상된 자엽 절편체는 3주 정도 지나면 절단면 즉 치상 부위에서 작은 돌기들이 발생하였고, 갈수록 절편체는 갈변하여 고사하였다. 선발된 개체에서는 신초가 발생하였으며 선발 후 7주가 경과하면 pot로 이식하여 발근된 완전한 식물체를 얻을 수 있었다. 본 실험결과 박 형질전환 시 genotype에 따른 신초 발생률에 상당한 차이를 보였는데 계통 9005의 경우 신초 발생율이 0.0%이였으며 계통 G5의 경우 4.1%이였다. 형질전환으로 발생된 신초는 GFP가 발현되지 않는 것과 GFP가 발현되는 것 두 가지 양상을 볼 수 있었다. PCR 및 Southern blot 분석을 한 결과, 9006과 G5 두 genotype에서 형질전환 신초에서 GFT 유전자를 가지고 있는 것으로 확인되었으며 GFP 유전자가 도입된 박 형질전환체를 얻을 수 있었다. 따라서 GFP 유전자는 박 형질전환시 유식물체에서 형질전환체를 쉽게 선발할 수 있는 유용한 마커로 이용 될 수 있다.
박과 (Cucurbitaceae) 작물에서 박 (Lagenaria siceraria Standl.)은 식용뿐만 아니라 주로 저온 신장성의 확보와 토양전염성 병해를 회피하기 위한 수단으로서 수박의 대목으로 많이 사용된다. 유전공학 방법을 이용한 토양병 내성이 증대된 신품종 개발이 필요한 요즘 박 형질전환체 개발의 효과적인 시스템 확립을 위하여 식물형질전환 연구에 매우 효율적으로 이용되는 마커인 GFP 유전자를 도입하였다. 실험재료로 이용된 박 계통은 9005, 9006 및 G5였으며, 신초 유기를 위한 선발 배지는 3.0 mg/L_ BAP + 100 mg/L kanamycin +500 mg/L cefotaxime + 0.5 mg/L $AgNO_3$, pH 5.8이었다 박 선발배지에 치상된 자엽 절편체는 3주 정도 지나면 절단면 즉 치상 부위에서 작은 돌기들이 발생하였고, 갈수록 절편체는 갈변하여 고사하였다. 선발된 개체에서는 신초가 발생하였으며 선발 후 7주가 경과하면 pot로 이식하여 발근된 완전한 식물체를 얻을 수 있었다. 본 실험결과 박 형질전환 시 genotype에 따른 신초 발생률에 상당한 차이를 보였는데 계통 9005의 경우 신초 발생율이 0.0%이였으며 계통 G5의 경우 4.1%이였다. 형질전환으로 발생된 신초는 GFP가 발현되지 않는 것과 GFP가 발현되는 것 두 가지 양상을 볼 수 있었다. PCR 및 Southern blot 분석을 한 결과, 9006과 G5 두 genotype에서 형질전환 신초에서 GFT 유전자를 가지고 있는 것으로 확인되었으며 GFP 유전자가 도입된 박 형질전환체를 얻을 수 있었다. 따라서 GFP 유전자는 박 형질전환시 유식물체에서 형질전환체를 쉽게 선발할 수 있는 유용한 마커로 이용 될 수 있다.
Bottle gourd (Lagenaria siceraria Standl.) has been used as a rootstock for the watermelon cultivation because of better growth ability at low temperature and avoidance from contamination of the soil disease. Since the genetic source for the elite rootstock is limited in nature, the genetic engineer...
Bottle gourd (Lagenaria siceraria Standl.) has been used as a rootstock for the watermelon cultivation because of better growth ability at low temperature and avoidance from contamination of the soil disease. Since the genetic source for the elite rootstock is limited in nature, the genetic engineering method is inevitable to develop new lines especially to obtain the functionally important or multi-disease resistant bottle gourd. Recently, our lab has set up a successful system to transform the bottle gourd. in order to monitor the transformation process, GFP gene is used. Cotyledons of the inbred line 9005, 9006 and G5 were used to induce the shoot under the selection media with MS + 30 g/L sucrose + 3.0 mg/L BAP + 100 mg/L kanamycin + 500 mg/L cefotaxime + 0.5 mg/L $AgNO_3$, pH 5.8. The shoot was developed from the cut side of the explants after 3 weeks on the selection media. The shoot was incubated in the rooting media with 1/2 MS + 30 g/L sucrose + 0.1 mg/L IAA + 50 mg/L kanamycin + 500 mg/L cefotaxime, pH 5.8 and moved to pot for acclimation. Although the shoot development rate was depended on the genotype, the G5 was the best line to be transformed. Monitoring GFP expression from the young shoot under microscope could make the selection much easier to distinguish the transformed shoot from the non-transformed shoots.
Bottle gourd (Lagenaria siceraria Standl.) has been used as a rootstock for the watermelon cultivation because of better growth ability at low temperature and avoidance from contamination of the soil disease. Since the genetic source for the elite rootstock is limited in nature, the genetic engineering method is inevitable to develop new lines especially to obtain the functionally important or multi-disease resistant bottle gourd. Recently, our lab has set up a successful system to transform the bottle gourd. in order to monitor the transformation process, GFP gene is used. Cotyledons of the inbred line 9005, 9006 and G5 were used to induce the shoot under the selection media with MS + 30 g/L sucrose + 3.0 mg/L BAP + 100 mg/L kanamycin + 500 mg/L cefotaxime + 0.5 mg/L $AgNO_3$, pH 5.8. The shoot was developed from the cut side of the explants after 3 weeks on the selection media. The shoot was incubated in the rooting media with 1/2 MS + 30 g/L sucrose + 0.1 mg/L IAA + 50 mg/L kanamycin + 500 mg/L cefotaxime, pH 5.8 and moved to pot for acclimation. Although the shoot development rate was depended on the genotype, the G5 was the best line to be transformed. Monitoring GFP expression from the young shoot under microscope could make the selection much easier to distinguish the transformed shoot from the non-transformed shoots.
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문제 정의
2004 a, b) GFP를 삽입 유전자와 co-transformation 한다면 GFP 발현을 통한 삽입유전자 확인 및 선발이 훨씬 더 용이해 질 수 있다. 따라서 본 연구에서는 박 자엽 절편체로부터 신초가 자라는 과정에서 GFP 발현을 monitor 할 수 있는지를 확인하기 위해서 GFP 유전자를 박에 형질전환하였다.
Kanamycin 저항성 선발 개체는 GFP 분석을 위하여 형광현미경(BX51 OLYMPUS, Japan)을 이용하여 수행하였다. Agrobacteria공동배양 후 자엽에서 유기된 신초에 UV 광을 조사 한 결과 형광 발현되지 않는 것과 형광 발현되는것 두 가지 양상을 볼 수 있었다 (Figure 3B, Figure 3D).
8% agarose gel로 전기영동 후 band 유무를 관찰하였다. PCR 분석시 GFP 유전자 도입이 확인된 식물체를 대상으로 Southern 분석을 실시하였다. 하우스에서 생육중인 박 잎을 이용하여 genomic DNA를 분리 하였으며 분리 한 DNA (50 ]lg)를 Hind m 와 Xba I 제한효소로 각각 절단하여 0.
GFP 유전자가 도입된 식물체는 형광현미경 하에서 UV (360-400 nm)나 청색광 (440-480 nm)을 조사하면 녹색 형광을 발현한다. 또한 GFP 유전자에 대한 PCR 분석을 실시하였다. Genomic DNA isolation은 Dellaporta 등 (1983)의 방법에서 약간 변형된 방법으로 수행하였다.
실험에 이용된 박 형질전환 방법은 Han 등 (2004a, b)이 발표한 방법과 동일하게 수행하였다. 박 종자의 종피를 인위적으로 제거한 후, 70% (v/v) ethanol에서 1분, Tween20을 섞은 25% (v/v) sodium hypochlorite (Yuhan-Clorox, Korea) 에서 20분, 다시 70% (v/v) ethanol 에서 1 분, 25% (v/v) sodium hypochlorite에서 15분 각각shaking 하여 표면 살균하였다. 각 단계 마다 1회 증류수로 세척하였으며 마지 막에는 3회 증류수로 세척하였다.
신초 선발 배지는 균 세척액과 동일한 배지에 8 g/L agar를 첨가하였다. 배양 3주차에 동일한 신초 선발배지로 계대배양 하였으며 계대 배양 4주 후 선발배지에서 재분화된 신초를 절편체에서 분리하여 신초 발근 배지 (1/2MS + 30 典 sucrose + 0.1 mg/L IAA + 50 mg/L kanamycin + 500 mg/L cefotaxime + 8 g/L agar, pH 5.8)로 이식하였다. 이식 4주 후 발근된 개체는 Jippy pot으로 이식하여 순화하였다.
PCR 조건은 premix (Accupower®, Bioneer)를 이용하였으며 pre-denaturation은 94℃에서 5분간 하였고 그 후 denaturation은 94 ℃에서 1분, annealing은 60 ℃ 에서 1분, extension은 72 ℃ 에서 1분간으로 35 cycle을 하였으며 last extention은 72℃에서 5분간 하였다. 분석은 PCR 기 계 (CORBETT RESEARCH, Aus- tralia)로 수행하였다. 합성된 DNA는 0.
선발된 식물체에서 GFP 유전자 삽입 여부를 확인하기 위하여 형광 현미경 (BX51 OLYMPUS, Japan)을 이용하였다. GFP 유전자가 도입된 식물체는 형광현미경 하에서 UV (360-400 nm)나 청색광 (440-480 nm)을 조사하면 녹색 형광을 발현한다.
)은 식용뿐만 아니라 주로 저온 신장성의 확보와 토양 전염성 병해를 회피하기 위한 수단으로서 수박의 대목으로 많이 사용된다. 유전공학 방법을 이용한 토양병 내성이 증대된 신품종 개발이 필요한 요즘 박 형질전환체 개발의 효과적인 시스템 확립을 위하여 식물형질전환 연구에 매우 효율적으로 이용되는 마커인 GFP 유전자를 도입하였다. 실험재료로 이용된 박 계통은 9005, 9006 및 G5였으며, 신초 유기를 위한 선발 배지는 3.
Agarose gel 싱.의 DNA 밴드를 ZetaR-Probe nylon membrane (Bio-Rad)에 전이시켜 32P-dCTPS 표지된 약 572 bp GFP Probe를 이용하여 Southern 분석하였다 (Southern 1975).
PCR 분석시 GFP 유전자 도입이 확인된 식물체를 대상으로 Southern 분석을 실시하였다. 하우스에서 생육중인 박 잎을 이용하여 genomic DNA를 분리 하였으며 분리 한 DNA (50 ]lg)를 Hind m 와 Xba I 제한효소로 각각 절단하여 0.8% agarose gel에 전기 영동하였다. Agarose gel 싱.
분석은 PCR 기 계 (CORBETT RESEARCH, Aus- tralia)로 수행하였다. 합성된 DNA는 0.8% agarose gel로 전기영동 후 band 유무를 관찰하였다. PCR 분석시 GFP 유전자 도입이 확인된 식물체를 대상으로 Southern 분석을 실시하였다.
대상 데이터
각 단계 마다 1회 증류수로 세척하였으며 마지 막에는 3회 증류수로 세척하였다. 1/2 MS 배지 (Murashige and Skoog 1962)에 살균된 종자를 파종하여 25 ℃, 16L/8D 광주기에서 배양하였으며 파종 후 5일째 된 자엽 절편체를 실험 재료로 사용하였다. 자엽 상부 2/5와 유근 및 유아를 제거하고 하반편만 Agrobactrerium 과 공동배양하기 위한 재료로 사용하였다.
유전공학 방법을 이용한 토양병 내성이 증대된 신품종 개발이 필요한 요즘 박 형질전환체 개발의 효과적인 시스템 확립을 위하여 식물형질전환 연구에 매우 효율적으로 이용되는 마커인 GFP 유전자를 도입하였다. 실험재료로 이용된 박 계통은 9005, 9006 및 G5였으며, 신초 유기를 위한 선발 배지는 3.0 mg/L BAP + 100 mg/L kanamycin + 500 mg/L cefotaxime + 0.5 mg/L AgNOs, pH 5.8이었다. 박 선발배지에 치상된 자엽 절편체는 3주 정도 지나면 절단면 즉 치상 부위에서 작은 돌기들이 발생하였고, 갈수록 절편체는 갈변하여 고사하였다.
연구에 이용된 식물체 재료는 박 (Lagenaria siceraria Standi.) 계통인 9005, 9006 (농우바이오) 및 G5 (원예연구소)를 이용하였다. 실험에 이용된 박 형질전환 방법은 Han 등 (2004a, b)이 발표한 방법과 동일하게 수행하였다.
1/2 MS 배지 (Murashige and Skoog 1962)에 살균된 종자를 파종하여 25 ℃, 16L/8D 광주기에서 배양하였으며 파종 후 5일째 된 자엽 절편체를 실험 재료로 사용하였다. 자엽 상부 2/5와 유근 및 유아를 제거하고 하반편만 Agrobactrerium 과 공동배양하기 위한 재료로 사용하였다.
형질전환을 위하여 Agrobactrerium tumefaciens strain은 EHA105를 사용하였으며 EHA105는 GFP 유전자가 삽입된 pmGFP5-ER 벡터를 포함하고 있다 (Figure 1). Agro bactrerium EHA105를 50 mg/L kanamycin와 30 mg/L rifampicin 이 첨가된 YEP 액체배지에 접종한 후, 28℃에서 220 rpm으로 진탕하면서 O.
이론/모형
) 계통인 9005, 9006 (농우바이오) 및 G5 (원예연구소)를 이용하였다. 실험에 이용된 박 형질전환 방법은 Han 등 (2004a, b)이 발표한 방법과 동일하게 수행하였다. 박 종자의 종피를 인위적으로 제거한 후, 70% (v/v) ethanol에서 1분, Tween20을 섞은 25% (v/v) sodium hypochlorite (Yuhan-Clorox, Korea) 에서 20분, 다시 70% (v/v) ethanol 에서 1 분, 25% (v/v) sodium hypochlorite에서 15분 각각shaking 하여 표면 살균하였다.
성능/효과
형질전환으로발생된 신초는 GFP가 발현되지 않는 것과 GFP가 발현되는 것 두 가지 양상을 볼 수 있었다. PCR 및 Southern blot 분석을 한 결과, 9006고} G5 두 genotype에서 형질전환 신초에서 GFP 유전자를 가지고 있는 것으로 확인되었으며 GFP 유전자가 도입된 박 형질전환체를 얻을 수 있었다. 따라서 GFP 유전자는 박 형질전환시 유식물체에서 형질전환체를 쉽게 선발할 수 있는 유용한 마커로 이용 될 수 있다.
Southern 분석에서 GFP 유전자의 복수 copy를 확인하였는데 여러 차례 반복실험을 수행한 결과 동일한 결론을 얻을 수 있었으며, Hind HI와 I 두 가지 제한 효소 처 리에서도 각각의 복수 copy 양상을 나타냈다. 이는 GFP 유전자의 형질전환시 여러 copy의 GFP 유전자가 동시에 삽입된 것으로 추론 할 수 있다.
1%이였다. 따라서 G5 가 다른 계통에 비해 다소 높은 신초 발생율을 나타내었을 뿐만 아니라 신초가 먼저 유도 되었고, 발생된 신초의 신장이 빠르며 뿌리 발생도 빨랐다.
Agrobacterium-mediateii trans- formation에서는 주로 one copy가 나오는 것이 일반적이나 산화스트레스 내성 형질전환 감자에서 다수 복수 copy의 Southern 결과가 보고 된 경우도 있다 (Tang et al 2004). 따라서 본 실험 수행결과 형질전환 식물체의 report 유전자분석 (GFP 분석) 및 분자생물학적 분석(PCR 및 Southern blot)을 통하여 식물체내 외래유전자 GFP의 안정적 삽입과 발현을 확인하였다. 향후 유용유전자가 도입된 대목 용 박 형질전환체가 본 실험의 시스템을 토대로 현미 경상에서 GFP 발현을 monitor 하면서 선발될 수 있을 것으로 기대된다.
Halfhill 등 (2001)의 보고에 따르면 배추의 어린잎, 줄기, 잎맥 그리고 꽃 등에서 GFP 발현을 볼 수 있었는데 본 실험에서도 식물체 전체에서 발현되고 있음을 확인하였고 특히 GFP가 도입된 박 형질전환 신초에서는 UV광 조사 전후 확연한 형광반응의 차이를 보였다 (Figure 3C, 3D). 따라서 형질전환 한 후 kanamycin 선발과 병행하여 형광현미경을 이용한 GFP 발현은 형질전환 식물체를 확인하는데 있어서 선발 마커로 효과적임을 알 수 있었다.
선발된 개체에서는 신초가 발생하였으며 선발 후 7주가 경과하면 pot 로 이식하여 발근된 완전한 식물체를 얻을 수 있었다. 본 실험 결과 박 형질전환 시 genotype에 따른 신초 발생률에 상당한 차이를 보였는데 계통 9005의 경우 신초 발생율이 0.0%이였으며 계통 G5의 경우 4.1%이였다. 형질전환으로발생된 신초는 GFP가 발현되지 않는 것과 GFP가 발현되는 것 두 가지 양상을 볼 수 있었다.
본 실험결과 박 형질전환시 계통에'따른 신초 발생률에 상당한 차이를 보였다 (Table 1). 계통 9005의 경우 신초 발생율이 0.
박 선발배지에 치상된 자엽 절편체는 3주 정도 지나면 절단면 즉 치상 부위에서 작은 돌기들이 발생하였고, 갈수록 절편체는 갈변하여 고사하였다. 선발된 개체에서는 신초가 발생하였으며 선발 후 7주가 경과하면 pot 로 이식하여 발근된 완전한 식물체를 얻을 수 있었다. 본 실험 결과 박 형질전환 시 genotype에 따른 신초 발생률에 상당한 차이를 보였는데 계통 9005의 경우 신초 발생율이 0.
선발된 형질전환 신초의 GFP 유전자 유무를 알기 위해서 PCR 분석을 한 결과, G5-3과 9006-1 각각에서 GFP 유전자를 가지고 있는 것으로 확인되었다 (Figure 4). 이 신초들을 하우스에서 생장시킨 후 잎으로부터 genomic DNA 를 추출하여 Southern 분석을 수행 하였고 그 결과 형질전환 식물체내로 GFP가 도입되었음을 확인할 수 있었다 (Figure 5).
가지고 있는 것으로 확인되었다 (Figure 4). 이 신초들을 하우스에서 생장시킨 후 잎으로부터 genomic DNA 를 추출하여 Southern 분석을 수행 하였고 그 결과 형질전환 식물체내로 GFP가 도입되었음을 확인할 수 있었다 (Figure 5). 그리고 형질전환을 하지 않은 control은 GFP밴드를 나타내지 않았다.
후속연구
따라서 본 실험 수행결과 형질전환 식물체의 report 유전자분석 (GFP 분석) 및 분자생물학적 분석(PCR 및 Southern blot)을 통하여 식물체내 외래유전자 GFP의 안정적 삽입과 발현을 확인하였다. 향후 유용유전자가 도입된 대목 용 박 형질전환체가 본 실험의 시스템을 토대로 현미 경상에서 GFP 발현을 monitor 하면서 선발될 수 있을 것으로 기대된다.
참고문헌 (25)
Ando S, Yuka S, Kamachi S, Sakai S (2001) Isolation of MADS-box gene (ERAF17) and correlation of its expression with induction of formation of female flowers by ethylene in cucumber plants. Planta 231 :943-952
Ayub R, Guis M, Ben A M, Gillot L, Roustan JP, Latche A, Bouzyen M, Pech JC (1996) Expression of ACC oxidase antisense gene inhibits ripening of cantaloup melon fruits. Nat Biotechnol 14:862-866
Cardoza V, Stewart CN (2003) Increased Agrobacteriummediated transformation and rooting efficiencies in canola (Brassica napus L.) from hypocotyl segment explants. Plant Cell Rep 21 :599-604
Chee PP, Slightom JL (1991) Transfer and expression of cucumber mosaic virus coat protein gene in the genome of Cucumis sativus. J Amer Soc Hort Sci 116: 1098-1102
Compton ME (2000) Interaction between explant size and cultivar affects shoot organogenic competence of watermelon cotyledons. HortScience 35: 749-750
Dabauza M, Bordas M, Salvador A, Roig LA, Moreno V (1997) Plant regeneration and Agrobacterium-mediated transformation of cotyledon explants of Citrullus colocynthis (L.) Schrad. Plant Cell Rep 16: 888-892
Ellul P, Rios G, Atares A, Roig LA, Serrano R, Moreno V (2003) The expression of the Saccharomyces cerevisiae HALl gene increases salt tolerance in transgenic watermelon [Citrullus lanatus (Thunb) Matsun. & Nakai.]. Theor Appl Genet 107:462-469
Galperin M, Patlis L, Ovadia A, Wolf D, Zelcer A, Kenigsbuch D (2003) A melon genotype with superior competence for regeneration and transformation. Plant Breed 122:66-69
Halfhill MD, Richards HA, Mabon SA (2001) Expression of GFP and Bt transgenes in Brassica napus and hybridization with Brassica rapa. Theor Appl Genet 103:659-667
Han JS, Oh DG, Mok IG, Park HG, Kim CK (2004b) Efficient plant regeneration from cotyledon explants of bottle gourd (Lagenaria siceraria Standl.). Plant Cell Rep 23:291-296
Kim JW, Oh SY, Lee HS, Jo MH, Lee EM, Woo IS, Kwak SS (1998) Expression of pea superoxide dismutase gene in transgenic cucumber (Cucumis sativus L.) plant. Kor J Plant Tiss cult 25:210-206
Kim YS, Kim MY, Kang TJ, Kwon TH, Jang YS, Yang MS (2005) Expression of the green fluorescent protein (GFP) in tabacco containing low nicotine for the development of edible vaccine. J Plant Biotechnology 7(2):97-103
Lee JM (2003) New trends in production and utilization of world vegetables. Proceedings of international vegetable symposium. Orgamized by National Horticultural Research Institute Asian Vegetable Research and Development center:9-30
Lee JM, Oda M (2003) Grafting of herbaceous vegetable and ornamental crops. Hortic Rev 28:61-124
Martin G, Ganal M, Tanksley SD (1992) Construction of a yeast artificial chromosome library of tomato and identification of cloned segments linked to two disease resistance loci. Mol Gen Genet 233:25-32
Park SM, Lee JS, Jegal S, Jeon BY, Jung M, Park YS, Han SL, Shin YS, Her NH, Lee JH, Lee MY, Ryu KH, Yang SG, Harn CH (2005) Transgenic watermelon rootstock resistant to CGMMV (cucumber green mottle mosaic virus) infection. Plant Cell Rep 24:350-356
Tang LI, Kwon SY, Kwak SS, Sung CK, Lee HS (2004) Selection of transgenic potato plants expressing both CuZnSOD and APX in chloroplasts with enhanced tolerance to oxidative stress. Kor J Plant Biotechnol 31: 109-113
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