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문제 정의
- 본 연구에서는 inducible promoter인 RAmy3E가 장착된 형질전환된 벼세포를 세포주로 사용하여 GFP가 발현되도록 하였다. 이 RAmy3E promoter는 sugar의 고갈 조건에서 발현되는 시스템으로[5], 이를 이용한 현탁 세포 배양시 su- crose의 농도가 GFP의 생산에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 본 연구에서 sucrose의 농도에 따른 세포의 성장양상, 분리정제 효율에 영향을 미칠 수 있는 요인으로 분비된 총 단백질량과 최종적으로 GFP의 생산량을 측정하였다.
제안 방법
- GFP 유전자가 도입된 형질전환 벼세포의 현탁 배양 세포를 50 mL의 N6액체배지에서 20일 동안 현탁 배양하여 배양 시간에 따른 현탁 세포의 건조중량 (DCW)과 수분함유 정도를 나타내는 지표인 cell size index (생체증량/건조중량)를 측정하여 Fig. 2에 나타내었다. 세포 생산량은 sucrose 농도 3%인 경우 10일째에 건조중량이 2.
- Sucrose 농도가 GFP 생산에 미치는 영향을 측정하기 위해 5 g의 세포를 5ml의 측정용 버퍼에 처리하여(재료 및 방법 참조) fluorescence를 측정하였다 (Fig. 3B, Fig. 4B). 먼저 Fig.
- 이 RAmy3E promoter는 sugar의 고갈 조건에서 발현되는 시스템으로[5], 이를 이용한 현탁 세포 배양시 su- crose의 농도가 GFP의 생산에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 본 연구에서 sucrose의 농도에 따른 세포의 성장양상, 분리정제 효율에 영향을 미칠 수 있는 요인으로 분비된 총 단백질량과 최종적으로 GFP의 생산량을 측정하였다. 본 연구는 향후 inducible promoter를 사용하여 고부가가치의 의료용 단백질을 생산하는데 중요한 기초자료로 활용이 가능할 것으로 생각된다.
- 본 연구에서는 inducible promoter인 RAmy3E가 장착된 형질전환된 벼세포를 세포주로 사용하여 GFP가 발현되도록 하였다. 이 RAmy3E promoter는 sugar의 고갈 조건에서 발현되는 시스템으로[5], 이를 이용한 현탁 세포 배양시 su- crose의 농도가 GFP의 생산에 미치는 영향을 확인하고자 하였다.
- 2, Qualitative)상에서 진공펌프로 시료의 배양액을 걸러내어 생체중량을 측정하였다. 생체중량을 측정한 세포를 옮겨 담아 60℃의 건조기에서 24시간 동안 건조시켜 건조중량 (DCW)을 측정하였다.
- , USA)를 이용하여 측정하였다. 세포 내의 fluorescence를 측정하기 위하여 세포를 생체중량 측정 시 보관되었던 0.5 g의 현탁 세포를 5 mL의 buffer에 반응시킨 후 sonic dismembrator (Fisher Scientific Inc., USA)를 이용하여 세포벽을 파괴시켜 원심분리 (3, 200xgz 5 min) 한후 상층액을 회수하여 얻은 시료를 사용하여 위와 같은 방법으로 fluorescence를 측정하였다. 이때 사용된 buffer는 10 mM Tris-HQ (pH 8.
- 세포의 생장을 측정하기 위해서 건조중량을 측정 하였으며, 그 방법은 300 mL 삼각플라스크에서 배양한 현탁 배양세포를 Buchner funnel을 이용하여 거름종이 (ADVANTEC NO. 2, Qualitative)상에서 진공펌프로 시료의 배양액을 걸러내어 생체중량을 측정하였다. 생체중량을 측정한 세포를 옮겨 담아 60℃의 건조기에서 24시간 동안 건조시켜 건조중량 (DCW)을 측정하였다.
- 1)를 사용하여 벼세포를 형질전환 하여 제작된 세포주를 분양 받아 사용하였다. 현탁배양 배지로는 2, 4-D (2.0 mg /L), kinetin (0.2 mg/L), hygromycin B (5.0 mg/L)를 포함한 N6액체배지 (pH 5.7)를 사용하였고, 50 mL의 액체배지에 초기 세포로 생체중량 2.5 g을 접종하였다. 배양조건은 300 mL 삼각플라스크를 이용하여 25℃, 120 rpm에서 암배양 하였으며, 배양된 현탁 세포를 7일 간격으로 auto pipette를 이용하여 10 mL의 비율로 계대배양하였다.
대상 데이터
- 본 연구에서 사용한 세포주는 전북대학교에서 RAmy3E promoter에 의해서 GFP유전자의 발현이 조절되도록 벡터 (Fig. 1)를 사용하여 벼세포를 형질전환 하여 제작된 세포주를 분양 받아 사용하였다. 현탁배양 배지로는 2, 4-D (2.
이론/모형
- 총 단백 질의 측정은 Bradford assay kit (Bio-Rad, USA)을 사용하여 정 량하였다. 표준물질로는 Bovine Serum Albumin (Sigma, St.
성능/효과
- 36 g/L로 가장 높았으며, 그 이후에는 건조 중량이 각각 감소하는 경향을 나타내었다.다음으로 sucrose 농도가 6% 이상의 (12%, 18% 및 24%) 농도에서는 세포의 성장이 계속해서 증가하는 경향을 보이고 있으며, 20일 동안 현탁 배양한 결과에서 가장 높은 값은 20 일째 sucrose농도 12%에서 7.06 g/L로 나타났다. 반면에 20 일 이후부터는 sucrose 농도 18%를 제외한 12%와 24%에서는 오히려 감소하는 경향을 보였다.
- 또한, sucrose 농도 3% 이상의 농도에서는 배지내의 탄소원의 고갈에 걸리는 시간이 sucrose 농도 3%보다 지연되므로, 배지내로 분비된 GFP량은 sucrose 농도가 높아질수록 그 값이 작다는 것을 알 수 있다. 따라서 본 연구에서는 20일 동안의 실험에서 관찰 된 GFP의 분비 량이 sucrose 농도 3%에서 가장 높게 나타났다. 앞의 결과를 확인하기 위하여 배지내로 분비된 GFP생산량의 차이를 낮은 sucrose 농도에서 보기 위하여 1%-5%의 농도에서 실험한 결과 sucrose 농도가 3% 이하에서는 확실히 보다 짧은 시간 내에 GFP가 생산되고 있는 것을 알 수 있다(Fig.
- 이러한 원인은 탄 소원 인 sucrose의 고갈에 따른 RAmy3E promoter의 발현으로 인한 현상으로 보인다. 또한, sucrose 농도 3% 이상의 농도에서는 배지내의 탄소원의 고갈에 걸리는 시간이 sucrose 농도 3%보다 지연되므로, 배지내로 분비된 GFP량은 sucrose 농도가 높아질수록 그 값이 작다는 것을 알 수 있다. 따라서 본 연구에서는 20일 동안의 실험에서 관찰 된 GFP의 분비 량이 sucrose 농도 3%에서 가장 높게 나타났다.
- 또한, 당의 농도가 높아질수록 cell size index가 뚜렷하게 낮아지는 경향을 나타내었는데 (Fig. 2B), 이러한 결과는 배지내의 당의 농도가 높아짐에 따른 삼투압의 증가와 삼투압 증가에 따른 생체중량의 감소에 의한 것으로 판단되며 삼투압의 증가에 따른 cell size index의 감소는 고농도의 식물세포배 양을 가능하게 하여 생산성의 향상에 기여할 수 있다고 판단된다. [6].
- 3A를 살펴보면 sucrose의 농도가 3%일 때 GFP 생산량은 세포의 사멸기로 접어드는 10일째 이 후부터 그 양이 차츰 증가하다가 15일째 이후 부터는 급격하게 증가하여 sucrose 농도 3%를 제외한 다른 농도와의 GFP생산량을 비교하기 어려웠다. 또한, 배지내로 분비된 단백질을 측정하였을 경우에도 sucrose 농도 3%일 때 가장 높은 값을 나타냈다. 이러한 결과로 미루어볼 때 GFP 생산량이 급격하게 증가한 것은 배지 내의 sucrose가 에너지원 등으로 소모되어 15일 이 후로 사멸기에 접어든 세포의 파괴로 인해 세포내부의 단백질이 세포 외로 분비된 결과에 의한 것으로 판단된다.
- 반면에 세포내부의 GFP 측정 실험 에서는 sucrose 농도 3%에서 뿐만 아니라 다른 농도에서의 GFP생산량 차이를 확인 할 수 있었다. Sucrose 농도 6%에서는 15일째 이후부터 GFP량이 증가하는 경향을 보였다(Fig.
- 2에 나타내었다. 세포 생산량은 sucrose 농도 3%인 경우 10일째에 건조중량이 2.78 g/L로 가장 높았고, sucrose 농도 6%에서는 15일째가5.36 g/L로 가장 높았으며, 그 이후에는 건조 중량이 각각 감소하는 경향을 나타내었다.다음으로 sucrose 농도가 6% 이상의 (12%, 18% 및 24%) 농도에서는 세포의 성장이 계속해서 증가하는 경향을 보이고 있으며, 20일 동안 현탁 배양한 결과에서 가장 높은 값은 20 일째 sucrose농도 12%에서 7.
- 따라서 본 연구에서는 20일 동안의 실험에서 관찰 된 GFP의 분비 량이 sucrose 농도 3%에서 가장 높게 나타났다. 앞의 결과를 확인하기 위하여 배지내로 분비된 GFP생산량의 차이를 낮은 sucrose 농도에서 보기 위하여 1%-5%의 농도에서 실험한 결과 sucrose 농도가 3% 이하에서는 확실히 보다 짧은 시간 내에 GFP가 생산되고 있는 것을 알 수 있다(Fig. 4).
- 위의 결과를 살펴보면 sucrose 농도에 따른 식물세포의 성장에 있어서 sucrose 농도가 12%일 때 가장 큰 영향을 미친것을 알 수 있으며, 너무 많은 sucrose의 양은 세포의 생장에 있어서 좋지 않은 영향을 미친 다는 것을 알 수 있다. 또한, 당의 농도가 높아질수록 cell size index가 뚜렷하게 낮아지는 경향을 나타내었는데 (Fig.
- 또한, 배지내로 분비된 단백질을 측정하였을 경우에도 sucrose 농도 3%일 때 가장 높은 값을 나타냈다. 이러한 결과로 미루어볼 때 GFP 생산량이 급격하게 증가한 것은 배지 내의 sucrose가 에너지원 등으로 소모되어 15일 이 후로 사멸기에 접어든 세포의 파괴로 인해 세포내부의 단백질이 세포 외로 분비된 결과에 의한 것으로 판단된다.
후속연구
- 또한, RAmy3E promoter의 높은 발현율을 이용하여 상업적으로 유용한 재조합 단백질을 발현시킴으로서 보다 높은 생산율과 가치를 얻을 수 있을 것으로 판단된다.
- 본 연구에서 sucrose의 농도에 따른 세포의 성장양상, 분리정제 효율에 영향을 미칠 수 있는 요인으로 분비된 총 단백질량과 최종적으로 GFP의 생산량을 측정하였다. 본 연구는 향후 inducible promoter를 사용하여 고부가가치의 의료용 단백질을 생산하는데 중요한 기초자료로 활용이 가능할 것으로 생각된다.
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