식물생장 촉진 호르몬인 auxin을 생산하는 균주를 선발하기 위해 경산지역 경작지 토양에서 29종의 세균을 분리하였으며 Salkowsky test를 통해 auxin을 생산하는 14종을 선발하였다. 이 중 CAS(chrome azurol S) blue agar에서 siderophore의 생산을 확인 후 auxin과 siderohroe를 동시에 생산하는 AH18을 최종 선발하였다. AH18의 mung-bean adventitious root induction test를 통해 식물생장 촉진 능이 대조구에 비해 1.5배나 뛰어남을 알 수 있었고, 토마토 pot test에서 토마토 시들음병의 윈인균인 F. oxysporum에 대해서 길항력도 나타내었다. 선발된 AHl8 균주는 16S rDNA와 Biolog system을 통해 Bacillus subtilis 동정되었다. B. subtilis AH18은 Sucrose-asparagine-MgsO$_4$(SAM) medium (pH 6.0)에 접종하여 30$^{\circ}C$에서 3일간 배양 시 siderophore를 가장 많이 생산하는 것을 알 수 있었다.
식물생장 촉진 호르몬인 auxin을 생산하는 균주를 선발하기 위해 경산지역 경작지 토양에서 29종의 세균을 분리하였으며 Salkowsky test를 통해 auxin을 생산하는 14종을 선발하였다. 이 중 CAS(chrome azurol S) blue agar에서 siderophore의 생산을 확인 후 auxin과 siderohroe를 동시에 생산하는 AH18을 최종 선발하였다. AH18의 mung-bean adventitious root induction test를 통해 식물생장 촉진 능이 대조구에 비해 1.5배나 뛰어남을 알 수 있었고, 토마토 pot test에서 토마토 시들음병의 윈인균인 F. oxysporum에 대해서 길항력도 나타내었다. 선발된 AHl8 균주는 16S rDNA와 Biolog system을 통해 Bacillus subtilis 동정되었다. B. subtilis AH18은 Sucrose-asparagine-MgsO$_4$(SAM) medium (pH 6.0)에 접종하여 30$^{\circ}C$에서 3일간 배양 시 siderophore를 가장 많이 생산하는 것을 알 수 있었다.
To isolate a bacterium that produces plant growth promoting hormone, a total of 29 bacteria were obtained from the soil in Gyeongsan, Korea. Among these, 14 strains were selected by their positive reaction on Salkowski to produce auxin. All of these were then tested for their property to produce sid...
To isolate a bacterium that produces plant growth promoting hormone, a total of 29 bacteria were obtained from the soil in Gyeongsan, Korea. Among these, 14 strains were selected by their positive reaction on Salkowski to produce auxin. All of these were then tested for their property to produce siderophore using CAS (chrome azurol S) blue agar, and one was chosen for its ability to produce both, auxin and siderophore. This strain, denoted, AHl8, showed 1.5 times higher adventitious root induction rates than controls, using mung-beans. The strain also showed efficient biocontrol properties towards Fusarium-wilt of tomatoes in artificial pot assays. The strain was identified as Bacillus subtilis by 16s rDNA comparison and Biolog analyses. Growth and media conditions for Bacillus subtilis AH1 8 to highly produce siderophore were also investigated.
To isolate a bacterium that produces plant growth promoting hormone, a total of 29 bacteria were obtained from the soil in Gyeongsan, Korea. Among these, 14 strains were selected by their positive reaction on Salkowski to produce auxin. All of these were then tested for their property to produce siderophore using CAS (chrome azurol S) blue agar, and one was chosen for its ability to produce both, auxin and siderophore. This strain, denoted, AHl8, showed 1.5 times higher adventitious root induction rates than controls, using mung-beans. The strain also showed efficient biocontrol properties towards Fusarium-wilt of tomatoes in artificial pot assays. The strain was identified as Bacillus subtilis by 16s rDNA comparison and Biolog analyses. Growth and media conditions for Bacillus subtilis AH1 8 to highly produce siderophore were also investigated.
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문제 정의
따라서 본 연구는 토양전염성 식물병해의 방제를 위한 현재 시중에 유통되는 미생물제제의 낮은 효과를 보완하고자 식물 병원균의 길항작용과 함께 식물의 생장을 촉진시킬 수 있는 auxin 및 siderophore 동시 생산성의 다기능적 생물방제 균주를 선발하고, 선발된 유용 균주의 산업적 이용을 위하여 siderophore 생산성에 미치는 배지 조성 및 온도, pH 에 대한 영향을 조사하여 보고하는 바이다.
제안 방법
Auxin 및 siderophore 생산능을 가지는 다기능 식물 생장촉진 균이 실제로 in vivo pot상에서 토양전염성병에 대한 방제 효과 있는지는 조사하기 위하여 121°C, 20분간 멸균된 실험토양(밭 흙 : 모래 : 퇴비 =2 : 1 : 1)에 심은 툐卜토를 기주식물로 하여 조사하였다.
Auxin 및 siderophore 생산능을 가지는 다기능 식물생장족진균의 in 打O상에 서 방제력 은 Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani, Phytophthora capsici를 대상 식물 병원균의 시험 균주로 하여 발육저지대 측정법 (pairing plate culture)을 통하여 조사하였다. 즉, PDA(Potato dextrose broth, agar 1.
Auxin 생산성 균주의 선발을 위하여 L-Tryptophan을 0.02% 첨가한 King's B broth 비]지 (Peptone NO.3 2%, K2PO4 0.15%, MgSO4 - 7H2O 0.15%, glycerol 1.5%) 5 ml에 토양으로부터 분리한 균주를 접종하고 3(TC에서 24시간 배양하였다. 그 후 8, 000 rpm에서 10분간 원심분리하여 배양 원침상둥액을 Salkowski 시약(5% perchoric acid 100 ml, 0.
Auxin 생산성의 길항균주의 분리를 위해 경북 경산시 일대의 경작지 근권 토양 과 대구 달성군 가창댐 근처의 미 경작지 근권 토양 0.1 g을 멸균된 증류수 0.9 ml에 첨가하여 단계적으로 희석한 후 Nutrient agar(Nutrient broth 0.8%, agar 1.5%)에 0.1 ml씩 도말하여 30°C에서 24〜4泌]간 배양하여 독립된 colony를 분리하였다.
3%. MgSO4-7H2O 0.02%, (NH4)2SO4 0.1%) medium에 선발균주의 전배양액을 0.1%되게 접종하고 5일 동안 매일 배양액을 회수하여 spectrophotometer를 이용해 600nm에서 흡광도를 측정하여 균주생육을 조사하였고 siderophore 생산성은 CAS liquid assay[ll]방법을 통해 탈색율로 나타내었다.
접종하여 28。。에 배양시키면서 orange halo zone의 생성 유무를 관찰하여 siderophore 생산균을 일차적으로 분리하고 CAS liquid assay에 의 해 siderophore 활성 에 따른 CAS의 탈색율을 이용하여 siderophore 생산능이 우수한 균주를 선발하였다[11].
선발된 다기능 길항균주의 온도와 pH에 따른 siderophore 생산성 조사를 위하여 Kin임s B 배지에 선발균주 전 배양액을 0.1% 되게 접종하고 이를 10°C, 20°C, 30°C, 40°C, 50°C 에서 각각 3일 배양한 후 온도변화에 따른 siderophore 생산능을 CAS liquid assay방법을 이용해 조사하였으며, p니에 따른 선발균주의 siderophroe생산능은 pH 3-pH 11까지로 적정 한 King's B 배지에 선발균주의 전배양액을 접종하고 3일 배양 후 역시 CAS liquid assay방법으로 siderophore 생산성을 조사하였다.
식물생장 촉진 호르몬인 auxin을 생산하는 균주를 선발하기 위해 경산지역 경작지 토양^서 29종의 세균을 분리하였으며 Salkowsky test를 통해 auxin을 생산하는 14종을 선발하였다. 이 중 CAS(chrome azun)l S) 미ue agai에서 siderophore의 생산을 확인 후 auxin과 siderohroe를 동시에 생산하는 AH18을 최종 선발하였다.
0xl06 CFU/ml의 균수로 5 ml 처리하여 이를 28。(言 70% 항온항습실에서 키우면서 주기적으로 발병을 확인하였다[13]. 이때 대조구로 방제균만을 처리하거나 무처리한 pot와 비교하여 토마토 시들음병의 발병억제력을 확인하였다.
3% sodium hypochlorite 용액에 3분간 침지 소독 후 흐르는 수돗물에 24시간 침종하고 무균토양에 파종하여 28。(2, 5, 000 lux 광원하의 식물배양실에서 6〜7일간 배양하였다. 제 1본엽이 전개되고 첫 3 소엽의 엽아가 약간 부풀어 있는 상태에서 녹두묘를 캐내어 균일한 크기로 선별된 녹두묘로부터 자엽을 제거하고 자엽 밑으로 하배축을 3 cm 님기고 칼로 절단한 후, 선발한 균주의 상등액 50 贝와 멸균증류수 5 ml가 채워진 test tube에 절단한 유묘를 1개씩 넣고 24시간마다 용액의 수준을 증류수로 일정 수준까지 보충하여 2NC의 5, 000 lux의 연속조명으로 6 일간 발근 시킨 후 길이 1 mm 이상의 발근수를 계수하였다.
통하여 조사하였다. 즉, PDA(Potato dextrose broth, agar 1.5%)배지에서 중간에 식물병원균을 3 mm disc 크기로 접종한 후 선발균을 백금이로 획선 접종하여 2*에서 배양하여 식물병원성 진균의 균사체 성장 억제 거리를 측정하였다.
대상 데이터
경작지 토양으로부터 분리한 29균주들을 배양 후 상등액에 Salkowski 시약과 1 : 2(v/v)로 반응시킨 후 분광광도계를 이용하여 535 nm 파장에서 측정한 후 auxin 생산성을 나타내는 14 균주를 1차 선발하였고, 그 중에서 옥신 생산성이 가장 높은 AH18 균주를 최종 선발하였다(Table 1). 추후녹두발근 bioassay에서도 타 분리균주에 비해 AH18균주가가장 큰 식물성장 촉진능을 보였다.
이 중 CAS(chrome azun)l S) 미ue agai에서 siderophore의 생산을 확인 후 auxin과 siderohroe를 동시에 생산하는 AH18을 최종 선발하였다. AH18의 mung-bean adventitious root induction te마를 통해 식물생장 촉진 능이 대조 구에 비해 1.
이론/모형
길항균주의 auxin생산성의 in vivo 조사는 실용면에서 가장 많이 사용하는 녹두발근생검 법 (Mung-bean adventitious root induction method)尖로 수행하였다[5]. 즉, 녹두품종 중식용으로 이용되는 녹두 종자를 0.
선발된 auxin 및 siderophroe 생스卜 균주의 동정은 형태 및 생화학적 특성을 시험한 후 Biolog시의 동정시스템 (MicrologW 4.0)과 16s rDNA의 분석을 통해 Bergey's manual에 의해 동정하였다 [기.
성능/효과
이 중 CAS(chrome azun)l S) 미ue agai에서 siderophore의 생산을 확인 후 auxin과 siderohroe를 동시에 생산하는 AH18을 최종 선발하였다. AH18의 mung-bean adventitious root induction te마를 통해 식물생장 촉진 능이 대조 구에 비해 1.5배나 뛰어남을 알 수 있었고, 토마토 pot test에서 토마토 시들음병의 윈인균인 F. c冲"omm에 대해서 길항력도 나타내었다. 선발된 AH18 균주는 16S rDNA 와 Biolog system을 통해 Bacillus subtilis로 동정되었다.
Auxin과 siderophore 생산성이 높게 나타나는 다기능 생물방제 균주 AH18을 동정을 위해 각종 생화학적 시험 후 Biolog사의 동정시스템 및 16s rDNA 염기서열을 분석한 후 NCBI의 BLAST를 이용한 기존세균과 유사성을 비교분석한결과, Bacillus sz社"〃Zs에 98% 상동성을 나타내어 Bacillus subtilis AH1&로 동정, 명명하였다(Fig、3, 4).
옥신생산성 길항균주인 AH!8을 대상으로 토마토 시들음병에 대한 식물방제실험을 실제 토양내에서 실시한 결과 in vivo pot tes㈣서도 충분히 시들음병에 대한 방제능을 나타내었다(Fig. 2). 따라서 선발된 균주 AH18은 식물 생장촉진 능은 물론이고 식물질병 방제력도 동시에 가지는 다기능 생물 방 제균임을 다시 한번 확인할 수 있었다.
선발된 AH18 균주는 16S rDNA 와 Biolog system을 통해 Bacillus subtilis로 동정되었다. B. subtilis AH 18은 Sucrose-asparagine-MgSOXSAM) medium (pH 6.0)에 접종하여 3이에서 3일간 배양 시 siderophore 를 가장 많이 생산하는 것을 알 수 있었다.
5%의 병원균이 생육 저해 능을 나타내었다. 따라서 선발된 AH18균주는 식물 성장 촉진 물질인 auxin과 주요 식물병원균의 생육을 길항하는 다기능 PGPR(식물 성장촉진 근권미생물)임을 확인할 수 있었다.
2). 따라서 선발된 균주 AH18은 식물 생장촉진 능은 물론이고 식물질병 방제력도 동시에 가지는 다기능 생물 방 제균임을 다시 한번 확인할 수 있었다.
1), 좀더 정확한 assay를 위하여 King's B broth배지에서 키운 AH18균주의 상등액을 회수하여 CAS liquid assay시 AH 18이 생산한 siderophore에 의해 철 이온을 흡착하여 CAS liquid assay용액 이 탈색됨을 확인할 수 있었다. 또한 그 탈색율은 84.93%를 나태내어 옥신생산성 길항균의 AH18균주가 고 siderophore 생산성 균주임을 다시 확인할 수 있었다.
선발균주 AH18 균주는 CAS 배지상에 toothpicking접종 시 분명한 오렌지 환을 생성하여 siderophore를 생산함을 확인하였으며 (Fig. 1), 좀더 정확한 assay를 위하여 King's B broth배지에서 키운 AH18균주의 상등액을 회수하여 CAS liquid assay시 AH 18이 생산한 siderophore에 의해 철 이온을 흡착하여 CAS liquid assay용액 이 탈색됨을 확인할 수 있었다. 또한 그 탈색율은 84.
c冲"omm에 대해서 길항력도 나타내었다. 선발된 AH18 균주는 16S rDNA 와 Biolog system을 통해 Bacillus subtilis로 동정되었다. B.
선발된 AH18 균주의 식물병원성 진균에 대한 길항능조사를 위해 발육저지대 측정법 (pairing plate culture)을 실시한 결과 토마토 등 각종 작물의 시들음병균인 F. oxysporum 에 대해 30.5%, 역병균인 P. cops血에 대해 48% 저해능, 근부병균인 R- solanin 에 대해35.5%의 병원균이 생육 저해 능을 나타내었다. 따라서 선발된 AH18균주는 식물 성장 촉진 물질인 auxin과 주요 식물병원균의 생육을 길항하는 다기능 PGPR(식물 성장촉진 근권미생물)임을 확인할 수 있었다.
선발된 AH18균주의 배양 상등액과 control을 멸균 medium을 사용하여 녹두 발근 생검법을 3회 반복 실시하여 평균 발근수와 뿌리 길이를 bioassay 측정한 결과 AH18균주가 생산한 옥신에 의해 부정근의 생성이 멸균 medium만 첨가한 대조구와 비교하여 본 발근수와 길이가 약 1.5배 증가되어 선발된 AH18균주는 매우 큰 식물 생장촉진능이 있음을 확인하였다(Table 2).
선발된 다기능 PGPR 균주 B. subtilis AH18의 siderophore 생산성에 미치는 최적 배지조건을 검토한 결과 B. subtilis AH 18는 Sucrose-asparagine-MgSO4(SAM) medium(pH 6.0) 에 전배양액을 접종하여 3이에서 3일간 진탕배양시에 siderophore 생산성 이 최대임을 알 수 있었다(Fig. 5, 6, 7).
추후녹두발근 bioassay에서도 타 분리균주에 비해 AH18균주가가장 큰 식물성장 촉진능을 보였다. 따라서 Salkowski test 와 bioassay의 결과가 동일하게 비례하는 것을 알았다.
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