다기능성 농업용 미생물 제제를 개발하기 위하여 생물방제 및 생물비료 활성을 가지는 미생물을 탐색하였다. 본 연구실에서 분리 및 동정된 균주가운데 Pantoea agglomerans 및 Bacillus megaterium을 실험군주로 선정하였으며, 경남 밀양에 위치하는 양계장 부근 부엽토로부터 새로운 다목적 세균 MF12를 분리하였다. 형태학적, 배양적, 생화학적 특성 및 16S rDNA 염기서열을 분석한 결과, MF12는 Bacillus pumilis로 동정되었다. 이 균주들의 불용성 인산 가용능, IAA 및 siderophore 생성능, ammonification ability, 식물병원성 진균 세포성분 분해효소 생성능 및 항진균능을 조사하였다. P. agglomerans는 고체배지에서 불용성 인산을 가용화할 수 없었으나 액체배지에서는 가용성 인산을 생성하였다. 상기 모든 균주들은 배양시간에 따라 $3{\sim}639{\mu}g/ml$의 IAA를 생성하였으며, P. agglomerans만이 siderophore를 생성하였다. 이 균주는 pectinase와 lipase를 생성하였다. B. megaterium은 amylase, pretense 및 lipase를 생성한 반면 B. pumilisr는 protease와 lipase를 생성하였다. P. agglomerans는 Fusarium oxysporum과 Colletotrichum gloeosporioides의 생육을 억제하였으며, B. pumilis는 Botrytis cinerea, Sclerotinia sclerotiorum 및 Phythium ultimum의 생육을 억제하였다.
다기능성 농업용 미생물 제제를 개발하기 위하여 생물방제 및 생물비료 활성을 가지는 미생물을 탐색하였다. 본 연구실에서 분리 및 동정된 균주가운데 Pantoea agglomerans 및 Bacillus megaterium을 실험군주로 선정하였으며, 경남 밀양에 위치하는 양계장 부근 부엽토로부터 새로운 다목적 세균 MF12를 분리하였다. 형태학적, 배양적, 생화학적 특성 및 16S rDNA 염기서열을 분석한 결과, MF12는 Bacillus pumilis로 동정되었다. 이 균주들의 불용성 인산 가용능, IAA 및 siderophore 생성능, ammonification ability, 식물병원성 진균 세포성분 분해효소 생성능 및 항진균능을 조사하였다. P. agglomerans는 고체배지에서 불용성 인산을 가용화할 수 없었으나 액체배지에서는 가용성 인산을 생성하였다. 상기 모든 균주들은 배양시간에 따라 $3{\sim}639{\mu}g/ml$의 IAA를 생성하였으며, P. agglomerans만이 siderophore를 생성하였다. 이 균주는 pectinase와 lipase를 생성하였다. B. megaterium은 amylase, pretense 및 lipase를 생성한 반면 B. pumilisr는 protease와 lipase를 생성하였다. P. agglomerans는 Fusarium oxysporum과 Colletotrichum gloeosporioides의 생육을 억제하였으며, B. pumilis는 Botrytis cinerea, Sclerotinia sclerotiorum 및 Phythium ultimum의 생육을 억제하였다.
To develop multifunctional microbial inoculant, microorganisms with antagonistic activity and biofertilizing activity were screened. Pantoea agglomerans and Bacillus megaterium from our laboratory culture collection, and strain MF12 from soil near poultry farm in Miryang were selected. On the basis ...
To develop multifunctional microbial inoculant, microorganisms with antagonistic activity and biofertilizing activity were screened. Pantoea agglomerans and Bacillus megaterium from our laboratory culture collection, and strain MF12 from soil near poultry farm in Miryang were selected. On the basis of morphological, physiological studies and 16S rDNA sequence analysis, isolate MF12 was identified as the Bacillus pumilis. Three strains were studied for insoluble phosphate solubilization, indole-3-acetic acid (IAA) and siderophore production, ammonification ability, hydrolytic enzyme production and antifungal activity against phytopathogenic fungi. P. agglomerans did not produce any visible clear zone on agar plate containing 0.5% $Ca_3(PO_4){_2}$ as a sole phosphorus source. However, this strain could solubilize insoluble phosphate in liquid medium. All strains produced IAA ranged from $3{\sim}639{\mu}g/ml$ depending on culture time and had ammonification ability. Among three strains, only P. agglomerans produced siderophore. P. agglomerans produced pectinase and lipase, B. megaterium produced amylase, protease and lipase while B. pumilis produced protease and lipase. P. agglomerans showed antifungal activities against phytopathogenic fungi, Fusarium oxysporum and Colletotrichum gloeosporioides. B. pumilis showed antifungal activities against Botrytis cinerea, Sclerotinia sclerotiorum and Phythium ultimum.
To develop multifunctional microbial inoculant, microorganisms with antagonistic activity and biofertilizing activity were screened. Pantoea agglomerans and Bacillus megaterium from our laboratory culture collection, and strain MF12 from soil near poultry farm in Miryang were selected. On the basis of morphological, physiological studies and 16S rDNA sequence analysis, isolate MF12 was identified as the Bacillus pumilis. Three strains were studied for insoluble phosphate solubilization, indole-3-acetic acid (IAA) and siderophore production, ammonification ability, hydrolytic enzyme production and antifungal activity against phytopathogenic fungi. P. agglomerans did not produce any visible clear zone on agar plate containing 0.5% $Ca_3(PO_4){_2}$ as a sole phosphorus source. However, this strain could solubilize insoluble phosphate in liquid medium. All strains produced IAA ranged from $3{\sim}639{\mu}g/ml$ depending on culture time and had ammonification ability. Among three strains, only P. agglomerans produced siderophore. P. agglomerans produced pectinase and lipase, B. megaterium produced amylase, protease and lipase while B. pumilis produced protease and lipase. P. agglomerans showed antifungal activities against phytopathogenic fungi, Fusarium oxysporum and Colletotrichum gloeosporioides. B. pumilis showed antifungal activities against Botrytis cinerea, Sclerotinia sclerotiorum and Phythium ultimum.
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문제 정의
. 본 연구는 생물비료 활성(불용성 인산 가용능, 식물생장호르몬 생성 능), 생물방제 활성 (siderophore 생성 능, ammonification, 식물병원성 진균 세포성분 분해효소 생성능) 등식물에 대한 다양한 생리활성을 동시에 가지면서 야외에 적용이 가능한 미생물 제제 개발을 최종목적으로 설계되었으며, 이에 따라 먼저 상기 목적에 부합하는 다목적 미생물을 분리한 후, 각종 생리활성을 조사함으로서 새로운 생물자원을 확보하고자 하였다.
다기능성 농업용 미생물 제제를 개발하기 위하여 생물방제 및 생물비료 활성을 가지는 미생물을 탐색하였다. 본 연구실에서 분리 및 동정된 균주 가운데 Pantoem agglomerans 및 Bacillus을 실험균주로 선정하였으며, 경남 밀양에 위치하는 양계장 부근 부엽토로부터 새로운 다목적 세균를 분리하였다.
다목적 미생물의 탐색을 위하여 일차적으로 본 연구실에서 분리 및 동정되어 보존중인 각 세균을 대상으로 다양한 생리활성을 조사하였다. 동시에 경남 일원의 경작지에서 재배되고 있는 농작물의 근권 토양 및 양계장 부근 부엽토를 채취하여 다목적 미생물을 분리하였다.
제안 방법
확인하였다. 각종 식물병원성 진균인 Botrytis ciner-ea, Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum, Phythium ulti- mum, Sclerotinia sclerotiorum, Colletotrichum gloeosporioides를 대상으로 potato dextrose agar plate에서 대치배양을 실시하여 생육저지대 생성 유무를 조사하였다. 순수분리된 미생물의 siderophore 생성능은 Chrome azurol S assay[l기에 의하여, ammonificatione Dey 등[5]의 방법에 의하여, 식물 병원성 진균 세포성분 분해효소(chitinase, cellulase, pectinase, protease, amylase, lipase)의 활성은 표준방법[6]에 의하여 정성분석하였다.
1%의 L-tryptophane이 각각 첨가된 King's B medium에 접종하여 배양하면서 생성된 IAA/를 530 nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다[20]. 균주를 접종하지 않은 배지를 대조구로 사용하였으며, 표준곡선은 IAA(Sigma) 를 이용하여 작성하였다.
또한 순수분리 된 미생물을 NBRIP broth에 접종한 후, 30℃ 및 200 rpm에서 배양하면서 생성된 가용성 인산을 va- nadomolybdophosphoric acid colorimetric method[4] 에 의하여 정량하였다. 균주를 접종하지 않은 배지를 대조구로 사용하였으며, 표준곡선은 KH2PO4를 이용하여 작성하였다.
0)에 접종한 후, 30℃ 및 200 rpm에서 일정시간동안 배양하였다. 균체를 제거한 배양 상등액을 Salkowsky reagent와 혼합하여 30 분간 반응시킨 후, 반응액의 색상이 분홍색으로 전환된 것을 IAA 생성능이 있는 것으로 결정하였다. 또한 순수분리된 미생물을 0.
75% NaCl 용액에 첨가하여 200 rpm에서 1 시간 동안 진탕하였다[14]. 단계적으로 희석한 상등액을 nutrient agar plate에 접종하여 30℃에서 배양함으로서 각 미생물을 순수분리한 후, 다양한 생리활성을 조사하였다.
조사하였다. 동시에 경남 일원의 경작지에서 재배되고 있는 농작물의 근권 토양 및 양계장 부근 부엽토를 채취하여 다목적 미생물을 분리하였다. 근권 토양 채취를 위하여 각종 농작물의 뿌리를 수집한 후, 손으로 강하게 진탕하여 부착된 대부분의 토양을 제거하였다.
Bergey's manual of determinative bacteriology[8]를참조하여 일차 동정하였다. 또한 분리균주의 16S rDNA의염기서열을 Ausubel 등[1]의 방법에 준하여 분석한 후, Blast network service를 이용하여 GenBank, EMBL, DDBJ에 등록된 다른 균주의 염기서열과 비교함으로써 최종 동정하였다.
균체를 제거한 배양 상등액을 Salkowsky reagent와 혼합하여 30 분간 반응시킨 후, 반응액의 색상이 분홍색으로 전환된 것을 IAA 생성능이 있는 것으로 결정하였다. 또한 순수분리된 미생물을 0.02%, 0.1%의 L-tryptophane이 각각 첨가된 King's B medium에 접종하여 배양하면서 생성된 IAA/를 530 nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다[20]. 균주를 접종하지 않은 배지를 대조구로 사용하였으며, 표준곡선은 IAA(Sigma) 를 이용하여 작성하였다.
본 연구에서는 식물병원성 진균에 대한 길항능, IAA 및siderophore 생성능, ammonification ability, 진균 세포성분분해효소 생성능, 불용성 인산 가용능을 나타내는 3 균주를 분리하였다. 현재, 이들 균주들의 구체적인 배양적 특성 및 항진균 기작에 대한 실험이 진행되고 있다.
0)를 사용한 plate assay method로 확인하였다[14]. 순수분리 된 미생물을 NBRIP agar plate에 획선 도말한 후, 30℃에서 일정 시간 배양하면서 콜로니 주위에 투명대를 생성하는 것을 불용성 인산 가용능이 있는 것으로 결정하였다. 투명대는 미생물에 의해 불용성 인산이 가용화되었음을 나타내는 지표이다[7].
형태학적, 배양적, 생화학적 특성 및 16S rDNA 염기서열을 분석한 결과, MF12는 Bacillus pumilis로 동정 되 었다. 이 균주들의 불용성 인산 가용능, IAA 및 siderophore 생성능, ammonification ability, 식물병원성 진균 세포성분 분해효소 생성능 및 항진균능을 조사하였다. P.
대상 데이터
및 생물비료 활성을 가지는 미생물을 탐색하였다. 본 연구실에서 분리 및 동정된 균주 가운데 Pantoem agglomerans 및 Bacillus을 실험균주로 선정하였으며, 경남 밀양에 위치하는 양계장 부근 부엽토로부터 새로운 다목적 세균를 분리하였다. 형태학적, 배양적, 생화학적 특성 및 16S rDNA 염기서열을 분석한 결과, MF12는 Bacillus pumilis로 동정 되 었다.
이론/모형
대표적인 식물생장 호르몬인 IAA의 생성능은 Tang과 Bonner의 방법[20]에 의하여 확인하였다. 순수분리된 미생물을 King's B medium(proteose peptone No.
투명대는 미생물에 의해 불용성 인산이 가용화되었음을 나타내는 지표이다[7]. 또한 순수분리 된 미생물을 NBRIP broth에 접종한 후, 30℃ 및 200 rpm에서 배양하면서 생성된 가용성 인산을 va- nadomolybdophosphoric acid colorimetric method[4] 에 의하여 정량하였다. 균주를 접종하지 않은 배지를 대조구로 사용하였으며, 표준곡선은 KH2PO4를 이용하여 작성하였다.
분리균주의 형태학적, 배양적 특성은 Manual of methods for general bacteriology[6]에 준하여, 생화학적 특성은 API kit(Biomerieux, France)를 이용하여 검토하였으며, 도출된 결과를 Bergey's manual of determinative bacteriology[8]를참조하여 일차 동정하였다. 또한 분리균주의 16S rDNA의염기서열을 Ausubel 등[1]의 방법에 준하여 분석한 후, Blast network service를 이용하여 GenBank, EMBL, DDBJ에 등록된 다른 균주의 염기서열과 비교함으로써 최종 동정하였다.
불용성 인산 가용능은 NBRIP agar plate(glucose 1%, (NH4)2SO4 0.01%, MgSO4 - 7H2O 0.025%, MgCl2 - 6H2O 0.5%, KC1 0.02% 및 불용성 인산원으로 Ca3(PO4)2 0.5%, pH 7.0)를 사용한 plate assay method로 확인하였다[14]. 순수분리 된 미생물을 NBRIP agar plate에 획선 도말한 후, 30℃에서 일정 시간 배양하면서 콜로니 주위에 투명대를 생성하는 것을 불용성 인산 가용능이 있는 것으로 결정하였다.
각종 식물병원성 진균인 Botrytis ciner-ea, Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum, Phythium ulti- mum, Sclerotinia sclerotiorum, Colletotrichum gloeosporioides를 대상으로 potato dextrose agar plate에서 대치배양을 실시하여 생육저지대 생성 유무를 조사하였다. 순수분리된 미생물의 siderophore 생성능은 Chrome azurol S assay[l기에 의하여, ammonificatione Dey 등[5]의 방법에 의하여, 식물 병원성 진균 세포성분 분해효소(chitinase, cellulase, pectinase, protease, amylase, lipase)의 활성은 표준방법[6]에 의하여 정성분석하였다.
항진균능은 potato dextrose agar plate를 이용한 대치배양법으로 확인하였다. 각종 식물병원성 진균인 Botrytis ciner-ea, Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum, Phythium ulti- mum, Sclerotinia sclerotiorum, Colletotrichum gloeosporioides를 대상으로 potato dextrose agar plate에서 대치배양을 실시하여 생육저지대 생성 유무를 조사하였다.
성능/효과
B. megateriume IAA 생성능 및 ammonification activity 는 가지고 있었으나 siderophore 생성능은 없었으며/ NBRIP agar plate에서 불용성 인산 가용눙은 관찰되지 않았다. 또한 amylase, protease, lipase 생성능은 있었으나 조사된 모든 식물 병원성 진균에 대해서 길항능은 없었다.
7에서 보는 바와 같이 배양 2일 후 578 ug/ml의 가용성 인산을 생성할 수 있었다. B. megateriume NBRIP agar plate에서 불용성 인산 가용능을 관찰할 수 없었으나 NBRIP broth에서는 배양 3 일 후, 159 ㎍/ml의 가용성 인산을 생성할 수 있었다(Fig. 7). Gupta 등[7]은 고체 평판배지에서 불용성 인산 가용능의 지표인 육안 관찰 가능한 투명대를 형성하지 못하는 많은 미 생물이 액체배지에서 불용성 인산을 가용화시킬 수 있다고 보고하였으며, 이것은 미생물에 의하여 생산된 유기산의 확산속도가 너무 느리기 때문인 것으로 추정하였다.
또한 미생물은 ammonification action을 통하여 농작물의 성장에 유해한진 균의 생육을 억제하는 것으로 알려져 있다[5]. P. agglomer- ms는 pectinase, lipase 등 식물병원성 진균의 세포성분을 분해할 수 있는 효소를 생성할 수 있었으며, 시들음병균인 Fusarium oxysporum과 고추탄저균인 Colletotrichum gloeospor-oides에 대해서 길항능이 있었다.
1, 2, 3에 나타내었다. P. agglomerans 는 NBRIP agar plate에서 불용성 인산을 가용화시킴으로서 콜로니 주위에 투명대를 형성하였으며, Chrome azurol S agar plate에서 콜로니 주위에 orange zone을 형성함에 따라 siderophore 생성능이 있음을 알 수 있었다. 경작지 토양에 식물이 흡수하기 어려운 불용성 형태로 다량 축적되어 있는 인산염을 가용화시킬 수 있는 미생물은 합성인산 비료의 사용을 경감시키면서 지력의 소실없이 작물의 생산성을 향상시킬 수 있는 것으로 보고되어 있다[이.
pumilis는 protease와 li- pase를 생성하였다. P. agglomerans는 Fusarium oxysporum과 Colletotrichum gloeosporioides의 생육을 억제하였으며, B. pum- ilis는 Botrytis cinerea, Sclemtinia sclerotiorum 및 Phythium ulti~의 생육을 억제하였다.
4에서 보는 바와 같다. 균체 생육은 L-tryptophanee 농도에 관계없이 비슷하였으나 IAA 최대생성량은 0.1% L-tryptophane이 첨가된 배지에서 높았으며 (46 μg/ml), 정지기부터 IAA 생성량이 크게 증가하였다. 분리 균주 MF12 역시 정지기부터 IAA 생성량이 증가하기 시작하였으며, 최대 생성량(156 ng/ml)은 P.
megaterium과 마찬가지로 siderophore 생성능 및 불용성 인산 가용능은 없었다. 또한 cellulase, protease, lipase 생성능이 있었으며, 잿빛곰팡이균인 Botrytis cinerea, 균핵균인 Sclerotinia sderothmml의 균사 생육을 억제할 수 있었다. 특히 모잘록병균인 Pythium ulti-mum에 대해서는 강력한 길항능이 있음을 알 수 있었다.
것으로 조사되었다. 또한 양계장 주변의 부엽토 시료 30점으로부터 콜로니의 성상이 다른 15 균주를 순수분리하였으며, 그 중 MF12가 다양한 생리활성을 가진 것으로 확인되었다.
이상의 데이터를 Bergey's manual of determinative bacteriology-J 참조하여 동정한 결과, 분리 균주는 Bacillus 속에 포함됨을 알 수 있었다. 분리균주의 보다 정확한 동정을 위하여 16S rDNA의 염기서열 분석을 실시하였으며, 16S rDNA 부분 염기서열을 NCBI GenBank에등록된 유사 균주와 비교분석하여 유전자간의 상관성을 알아본 결과, 본 분리균주는 Bacillus pumilis와 99%의 상동성을 가지고 있었다(Fig. 8).
새로이 분리된 균주 MF12의 형태학적, 배양적 및 생화학적 특성을 조사한 결과, 본 균주는 그람양성의 호기성 간균으로서 포자를 형성할 수 있었으며, citrate 이용능과 젤라틴액화능을 가지고 있었으나 H2S 생성능 및 urease 등은 가지고 있지 않았다(미제시). 이상의 데이터를 Bergey's manual of determinative bacteriology-J 참조하여 동정한 결과, 분리 균주는 Bacillus 속에 포함됨을 알 수 있었다.
식물 생육에 긍정적인 영향을 미치는 다목적 미생물을 확보하기 위하여 본 연구실에서 보존중인 32 균주를 대상으로 각종 생리활성을 검토한 결과, 콩의 근권 토양 및 가금 폐기물로부터 각각 분리, 동정되었던 Pantoea agglomerans 및 Bacillus megaterium이 생물비료 및 생물방제 활성을 가지고 있는 것으로 조사되었다. 또한 양계장 주변의 부엽토 시료 30점으로부터 콜로니의 성상이 다른 15 균주를 순수분리하였으며, 그 중 MF12가 다양한 생리활성을 가진 것으로 확인되었다.
있지 않았다(미제시). 이상의 데이터를 Bergey's manual of determinative bacteriology-J 참조하여 동정한 결과, 분리 균주는 Bacillus 속에 포함됨을 알 수 있었다. 분리균주의 보다 정확한 동정을 위하여 16S rDNA의 염기서열 분석을 실시하였으며, 16S rDNA 부분 염기서열을 NCBI GenBank에등록된 유사 균주와 비교분석하여 유전자간의 상관성을 알아본 결과, 본 분리균주는 Bacillus pumilis와 99%의 상동성을 가지고 있었다(Fig.
또한 cellulase, protease, lipase 생성능이 있었으며, 잿빛곰팡이균인 Botrytis cinerea, 균핵균인 Sclerotinia sderothmml의 균사 생육을 억제할 수 있었다. 특히 모잘록병균인 Pythium ulti-mum에 대해서는 강력한 길항능이 있음을 알 수 있었다.
Siderophore는 철이온 특이 결합물질로서, 식물병원균의 생육을 저해하는 경쟁적 길항작용을 함과 동시에 식물이 이용할 수 없는 철을 가용화시킴으로서 식물 성장에 도움이 되는 것으로 알려져 있다[16]. 한편, 균체를 제거한 배양 상등액이 Salkowsky reagent 및 Nessler reagent 에 의하여 각각 분홍색 및 노란색으로 변화됨에 따라 P. ag- glomerans는 IAA 생성능과 ammonification activity가 있음을 알 수 있었다. IAA는 대표적인 식물생장 호르몬으로서, 식물의 신장을 촉진시키는 작용 외에 뿌리 신장, 과실 형성 등을 촉진하는 것으로 알려져 있으며, Azospirillum, Pseudomonas, BhizMum, Bacillus 속 등에서 보고되어져 있다[11].
본 연구실에서 분리 및 동정된 균주 가운데 Pantoem agglomerans 및 Bacillus을 실험균주로 선정하였으며, 경남 밀양에 위치하는 양계장 부근 부엽토로부터 새로운 다목적 세균를 분리하였다. 형태학적, 배양적, 생화학적 특성 및 16S rDNA 염기서열을 분석한 결과, MF12는 Bacillus pumilis로 동정 되 었다. 이 균주들의 불용성 인산 가용능, IAA 및 siderophore 생성능, ammonification ability, 식물병원성 진균 세포성분 분해효소 생성능 및 항진균능을 조사하였다.
후속연구
megaterium의 경우, 균체 생육도 및 IAA 생성량(639 μg/ml)이 상기 두 균주보다 월등히 많았으며, 두 균주와 달리 균체 생육과 비례하여 IAA를 생성하였다. 이것은 2차 대사산물 생산의 일반적인 패턴과 다른 양상이므로 이에 대한 추가적인 연구가 필요함을 알 수 있었다(Fig. 6).
현재, 이들 균주들의 구체적인 배양적 특성 및 항진균 기작에 대한 실험이 진행되고 있다. 이들을 적절하게 조합 및 병용 적용한다면 식물병원성 진균의 생육을 억제함과 동시에 각종 농작물의 성장도 촉진할 수 있을 것으로 예상되며, 이에 따라 환경오염 감소, 농작물의 품질 향상 및 수확량을 증가시킬 수 있을 것이다.
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