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문제 정의
- 본 연구에서는 생마의 장기 저장 및 저온 유통 연구의 일환으로, 생마 부패에 관련되는 저온부패균을 분리, 동정하고, 균학적 특성을 검토하였다. 그 결과 저온성 Pseudomonas sp.
제안 방법
- 13종의 분리세균들의 효소활성과 생마부패 활성과의 관련성을 검토하였다. 1% 마 분말을 포함하는 최소배지를 이용하여 , 20℃에서 5일간 배양 결과 전반적인 세균 성장은 양호하였으며, YAM-10, 및 YAM-12균주 배양의 경우에는 예상대로 불용성 마 분말이 분해되어, 배양기간이 길어질수록 배양액 이 투명화되는 현상을 나타내었다.
- 다양한 부패 생마의 부패 부위를 멸균 칼로 도려내어, 이를 멸균수에 적당히 현탁한 후, 0.1 mL를 Nutrient agar 배지(Difco Co., U.S.A.)에 도말하고, 35℃에서 2일간 배양하였다. 성장된 세균의 콜로니 중 육안판정으로 서로 다른 세균 13종을 분리하였으며, 이들은 건전 생마를 대상으로 다양한 조건에서 부패력을 평가하였다.
- 부패된 생마로부터 13 종류의 세균을 순수분리 하였다. 곰팡이 오염에 의한 생마부패는 주로 수확시 절단부위에 한정되어 나타나며, 단독감염이 우세하였다(결과 미제시), 그러나, 세균에 의한 생마부패는 생마 전체적으로 무름현상이 나타나며, 다양한 세균이 혼재하는 상태였다.
- 부패생마에서 순수 분리된 13종의 세균을, 600 nm에서의 흡광도가 0.1 이 되도록 멸균수로 조정한 후, 세균 현탁액 0.1 mL를 생마 절편(3.5 cm x 3.5 cm x 4 mm)에 도포하였다. 사용한 생마 절편은 건전한 생마절편을 멸균 칼로 절단한 것 (무처리구), 생마절편을 NaOCl(100 ppm) 용액에 S분동안 침지하여 살균하고, 이를 멸균수로 5분간 헹굼하고 물기를 제거한 것(락스 살균), 및 생마절편을 121。。에서 5분동안 고압증기 멸균한 것(고압멸균)을 각각 사용하였다.
- )에 도말하고, 35℃에서 2일간 배양하였다. 성장된 세균의 콜로니 중 육안판정으로 서로 다른 세균 13종을 분리하였으며, 이들은 건전 생마를 대상으로 다양한 조건에서 부패력을 평가하였다. 분리된 세균들은 BBL crystal 동정시스.
- 사용한 생마 절편은 건전한 생마절편을 멸균 칼로 절단한 것 (무처리구), 생마절편을 NaOCl(100 ppm) 용액에 S분동안 침지하여 살균하고, 이를 멸균수로 5분간 헹굼하고 물기를 제거한 것(락스 살균), 및 생마절편을 121。。에서 5분동안 고압증기 멸균한 것(고압멸균)을 각각 사용하였다. 세균 현탁액을 도포한 생마절편들은 멸균 페트리디시 (55 X 12 mm, 녹십자의료공업, 한국)에 넣어 수분증발을 억제한 후 각각 4, 12, 20, 30, 371의 배양기에 넣어 배양하면서 7일 동안 부패 진행도를 관찰하였다. 이때 세균 현탁액 대신 멸균수를 0.
- 세균 현탁액을 도포한 생마절편들은 멸균 페트리디시 (55 X 12 mm, 녹십자의료공업, 한국)에 넣어 수분증발을 억제한 후 각각 4, 12, 20, 30, 371의 배양기에 넣어 배양하면서 7일 동안 부패 진행도를 관찰하였다. 이때 세균 현탁액 대신 멸균수를 0.1 mL 도포한 경우와, 부패활성이 없는 E. coll KCTC 1682 현탁액을 0.1 mL 도포한 경우를 대조구로 설정하였다. 한편 부패세균이 생마부패에만 특이적으로 관련하는지 확인하기 위해 양파 절편을 무처리구, 락스살균, 고압멸균 처리후 동일한 방법으로 부패세균 현탁액을 도포하여 각각 부패력을 측정하였다.
- 저온 장기저장시 주요 생마 부패 균으로 고려되는 YAM-10 및 YAM-12의 생육특성을 검토하였다. 대조구로 사용된 E.
- 저온저장, 저온 유专중 생마부패에 직접 관련되는 YAM-10 및 YAM-12 균주의 최적 생육온도 및 최적 생육 pH를 검토하였다. 사용배지는 Nutrient broth(Difco Co.
- , USA)를 사용하였으며, 4, 12, 20, 25, 30, 37。。에서 48시간 정치배양 후 생육도를 즉정 하였다. 최적 생육 pH의 경우에는 Nutrient broth(Difco Co., USA)의 초기 pH를 0.1 N HCl, 또는 0.1 NaOH를 사용하여 각각 pH 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 103 조정 후, 2CTC에서 48시간 배양 후 생육도를 측정하였다. 세균의 생육도는 600 nm에서 흡광도로 측정하여 상대 생육도(%)로 나타내었으며, 대조구로는 E.
- 분리된 세균들은 BBL crystal 동정시스.템(BD BBL CrystalTM, U.S.A.)과 세포막 지방산 조성분석 (Gas Chromatography HP 5890, U.S.A.), 16S rDNA 염기서열 분석 및 Bergey's manual 기준에 의거하여 각각 동정하였다[2].
- 1 mL 도포한 경우를 대조구로 설정하였다. 한편 부패세균이 생마부패에만 특이적으로 관련하는지 확인하기 위해 양파 절편을 무처리구, 락스살균, 고압멸균 처리후 동일한 방법으로 부패세균 현탁액을 도포하여 각각 부패력을 측정하였다.
- 5 mL를 혼합 후 40℃에서 60분간 반응 후, 유리되는 환원당을 DNS법으로 정량하였다[17]. 효소 빈응의 대조구는 10(TC에서 10분간 가열한 효소를 사용하였으며, 효소의 상대활성은 흡광도 값으로 비교하였다[15].
대상 데이터
- 생마는 2005년 경북 안동 및 고령에서 수확한 마 (Dioscorea opposita Thunb.)를 이용하였으며, 4개월간 4℃ 냉장창고에서 보관중인 마를 구입하여 부패 부위로부터 세균을 분리하였다. 분리된 세균을 대상으로 한 생마 부패실험의 경우, 생마 표면의 이물질을 제거한 후, 음용수로 세척하고, 시판 1종 세척제에 5분 동안 침지한 후 다시 음용수로 세척제를 제거하였으며, 음건후 사용하였다.
- 1 NaOH를 사용하여 각각 pH 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 103 조정 후, 2CTC에서 48시간 배양 후 생육도를 측정하였다. 세균의 생육도는 600 nm에서 흡광도로 측정하여 상대 생육도(%)로 나타내었으며, 대조구로는 E. coli KCTC 1682를 사용하였다.
- 시판 생마 분말(마분말 100%, 북후농협, 안동)을 l%(w/ w) 되게 포함시킨 최소배지 [0.5% glucose, 0.2% (NHeSCM, 0.1% KH2PO4, 0.1% K2HPO4, 0.05% MgSO4, 0.05% CaCl2, 0.05% NaCl]에 분리세균을 각각 접종하여 20℃에서 5일간 진탕배양(120 rpm, VS-8480SF, Vision Co., Korea) 후 배양액을 원심분리하여 균체를 제거한 상등액을 효소원으로 사용하였다. 균의 성장은 배양 종료 후, 배양액 0.
- 1 mL 를 Nutrient agar 배지에 도말하고 배양하여 콜로니를 계수하여 나타내었다. 최종 amylase 활성은 1% starch 용액을 기질로, carboxy methyl cellulase(CMCase) 활성은 1% CMC 를 기질로, polygalacturonase(PGase) 활성은 1% sodium polygalacturonic acid를 기질로, xylanase 활성은 1% xylan 을 기질로 사용하였다. 효소 활성은 각각의 기질 0.
이론/모형
- 최종 amylase 활성은 1% starch 용액을 기질로, carboxy methyl cellulase(CMCase) 활성은 1% CMC 를 기질로, polygalacturonase(PGase) 활성은 1% sodium polygalacturonic acid를 기질로, xylanase 활성은 1% xylan 을 기질로 사용하였다. 효소 활성은 각각의 기질 0.5 mL와 Mcllvain buffer(pH 5.0) 0.5 mL, 효소 0.5 mL를 혼합 후 40℃에서 60분간 반응 후, 유리되는 환원당을 DNS법으로 정량하였다[17]. 효소 빈응의 대조구는 10(TC에서 10분간 가열한 효소를 사용하였으며, 효소의 상대활성은 흡광도 값으로 비교하였다[15].
성능/효과
- 1). 2VC와 30。(2의 3일간 배양시에 고압멸균 처리한 경우에는 가장 빨리 부패가 진행되었으며, 무처리구 및 락스처리구에서도 부패가 나타났다. 대조구로 사용된 멸균수 도포의 경우 시간경과에 따라 부패는 나타나지 않았으나, 고압멸균 처리경우를 제외하고는 갈변현상이 나타났으며, 이는 20。<2보다 30。(3에서 강하게 나타났다.
- 13종의 분리세균들의 효소활성과 생마부패 활성과의 관련성을 검토하였다. 1% 마 분말을 포함하는 최소배지를 이용하여 , 20℃에서 5일간 배양 결과 전반적인 세균 성장은 양호하였으며, YAM-10, 및 YAM-12균주 배양의 경우에는 예상대로 불용성 마 분말이 분해되어, 배양기간이 길어질수록 배양액 이 투명화되는 현상을 나타내었다. 최종 배양 pH는 균주마다 다르게 나타났으며, YAM-1, -4, -6, -9, -10, -11, -12의 경우에는 3~4.
- 또한 두 균주의 경우 37℃에서는 생육이 오히려 감소하였으며, 특히 YAM-12 의 경우 심각한 생육저해가 나타나 전형적인 저온균의 특성을 나타내었다. 20℃에서 최적 생육 pH를 검토한 결과 초기 pH 6~9 사이에서 정상적인 생육을 나타내었으나, pH 5 이하에서는 거의 성장이 나타나지 않았다. 따라서 생마의 저온 장기저장시 20도 이하의 저온에서도 중성 pH의 생마에서는 지속적인 세균성 부패가 일어날 수 있음을 추측케 하며, 이러한 결과는 식초 및 구연산 처리에 의한 생마 가공식품 개발과 장기보존 연구에 기초자료로 활용될 수 있을 것이다.
- 그 결과 저온성 Pseudomonas sp. 가 저온부패에 밀접히 관련되어 있으며, 생마 부패에는 2VC 이하에서의 amylase와 cellulase 활성이 중요함을 확인하였다. 이러한 결과는 저온성 부패세균의 생육제어 및 효소 활성 제어를 통해 생마의 장기저장 및 저온유통 기술개발에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
- 5로 감소한 반면, 나머지 균주들은 초기 pH를 유지하였다. 각 균주의 배양상등액을 이용하여 생마 조직파괴 및 부패에 직접 관련될 것으로 예상되는 amylase, CMCase, PGase, 및 xylanase활성을 측정한 결과(Table 2), amylase 활성은 YAM-10, YAM-12에서 우수하였으며, CMCase 활성은 YAM-7, -10, -11, -12, 및 -13에서, PGase 활성은 YAM-4, YAM-5에서, xylanase 활성은 YAM-1, -5, 및 -12에서 각각 우수하였다. 생마부패력이 강력한 YAM-12 균주는 amylase, CMCase, xylanase 활성이 전반적으로 우수하였으며, 이러한 강력한 다당류 분해능은 생마부패와 밀접한 관계가 있는 것으로 판단된다.
- 및 YAM-12의 생육특성을 검토하였다. 대조구로 사용된 E. coli의 경우 4~12℃의 범위에서 생육이 나타나지 않은 반면 YAM-10, YAM-12균주는 최적 생육온도인 25~30℃에비해 약 20~46%의 성장을 나타내었다. 또한 두 균주의 경우 37℃에서는 생육이 오히려 감소하였으며, 특히 YAM-12 의 경우 심각한 생육저해가 나타나 전형적인 저온균의 특성을 나타내었다.
- 또한 대장균을 각각의 생마절편에 도포한 경우에는, 고압멸균후 30℃ 에서 배양한 경우에만 성장이 확인되었다. 따라서 YAM-10 및 YAM-12> 제외한 일반세균들은 생마의 조직과 효소계를 고압멸균하여 파괴하지 않는 경우, 부패에 직접 관련하지는 않을 것으로 판단되었다.
- 부패부분을 멸균 칼로 제거한 경우에도 부패 인접 조직내에서 세균이 검출되어 부패세균의 경우 생마조직 파괴 및 침투력이 우수할 것으로 예측되었다. 따라서 초기 세균오염을 효율적으로 제어하지 못하는 경우, 제거해야 할 부패부위(생마 폐기율)가 급격히 증가될 것으로 예상되며, 특히 저온성 세균의 경우 생마 저온 장기저장의 위협인자로 판단되었다.
- 대조구로 사용된 멸균수 도포의 경우 시간경과에 따라 부패는 나타나지 않았으나, 고압멸균 처리경우를 제외하고는 갈변현상이 나타났으며, 이는 20。<2보다 30。(3에서 강하게 나타났다. 또한 대장균을 각각의 생마절편에 도포한 경우에는, 고압멸균후 30℃ 에서 배양한 경우에만 성장이 확인되었다. 따라서 YAM-10 및 YAM-12> 제외한 일반세균들은 생마의 조직과 효소계를 고압멸균하여 파괴하지 않는 경우, 부패에 직접 관련하지는 않을 것으로 판단되었다.
- 13종의 세균 중 YAM-1, -2, -10, -12균주는 Pseudomonas sp.로 확인되었으며, YAM-8, -9는 Stenotrophomonas sp로 동정 되었다. 그 외 Corynebacterium sp.
- 부가적으로 YAM-10 및 YAM-12 균주의 16S rDNA 염기서열을 분석한 결과 YAM-10 균주는 Pseudomonas cepaciaS- 확인되었으며(460/460, 100% 일치), YAM-12 균주는 Pseudomonas rhodesiae로 동정되었다(472/476, 99% 일치). 그러나 최근 양파 부패균으로 보고된 Pseudomonas sp.
- 곰팡이 오염에 의한 생마부패는 주로 수확시 절단부위에 한정되어 나타나며, 단독감염이 우세하였다(결과 미제시), 그러나, 세균에 의한 생마부패는 생마 전체적으로 무름현상이 나타나며, 다양한 세균이 혼재하는 상태였다. 부패부분을 멸균 칼로 제거한 경우에도 부패 인접 조직내에서 세균이 검출되어 부패세균의 경우 생마조직 파괴 및 침투력이 우수할 것으로 예측되었다. 따라서 초기 세균오염을 효율적으로 제어하지 못하는 경우, 제거해야 할 부패부위(생마 폐기율)가 급격히 증가될 것으로 예상되며, 특히 저온성 세균의 경우 생마 저온 장기저장의 위협인자로 판단되었다.
- 각 균주의 배양상등액을 이용하여 생마 조직파괴 및 부패에 직접 관련될 것으로 예상되는 amylase, CMCase, PGase, 및 xylanase활성을 측정한 결과(Table 2), amylase 활성은 YAM-10, YAM-12에서 우수하였으며, CMCase 활성은 YAM-7, -10, -11, -12, 및 -13에서, PGase 활성은 YAM-4, YAM-5에서, xylanase 활성은 YAM-1, -5, 및 -12에서 각각 우수하였다. 생마부패력이 강력한 YAM-12 균주는 amylase, CMCase, xylanase 활성이 전반적으로 우수하였으며, 이러한 강력한 다당류 분해능은 생마부패와 밀접한 관계가 있는 것으로 판단된다. 한편 생마 부패력이 약한 YAM-5 및 YAM-7의 경우 각각 PGase 및 CMCase 활성은 우수하나, amylase 활성이 미약함을 알 수 있으며, 이러한 결과는 생마의 주 성분이 전분질임을 감안할 때 , 저온에서 강력한 amylase 활성을 나타내는 균이 생마 저온 장기저장 시 부패원인균으로 작용함을 제시한다.
- , 및 Acinetobacter sp도 확인되었다. 이들의 최적 생육온도를 4, 12, 20, 25, 30 및 37℃에서 48시간 배양 후 측정결과 YAM-3, -5, -8, -9, =11균주의 경우에는 37也에서 최대생육을 나타내었으나, YAM-1, -2, -6, -7, -12균주의 경우에는 30℃에서 최대생육을 나타내었다. 또한 YAM-4, -10, -13균주는 30℃ 및 37℃보다 오히려 25℃에서 최대생육을 나타내었다.
- 1% 마 분말을 포함하는 최소배지를 이용하여 , 20℃에서 5일간 배양 결과 전반적인 세균 성장은 양호하였으며, YAM-10, 및 YAM-12균주 배양의 경우에는 예상대로 불용성 마 분말이 분해되어, 배양기간이 길어질수록 배양액 이 투명화되는 현상을 나타내었다. 최종 배양 pH는 균주마다 다르게 나타났으며, YAM-1, -4, -6, -9, -10, -11, -12의 경우에는 3~4.5로 감소한 반면, 나머지 균주들은 초기 pH를 유지하였다. 각 균주의 배양상등액을 이용하여 생마 조직파괴 및 부패에 직접 관련될 것으로 예상되는 amylase, CMCase, PGase, 및 xylanase활성을 측정한 결과(Table 2), amylase 활성은 YAM-10, YAM-12에서 우수하였으며, CMCase 활성은 YAM-7, -10, -11, -12, 및 -13에서, PGase 활성은 YAM-4, YAM-5에서, xylanase 활성은 YAM-1, -5, 및 -12에서 각각 우수하였다.
- 생마부패력이 강력한 YAM-12 균주는 amylase, CMCase, xylanase 활성이 전반적으로 우수하였으며, 이러한 강력한 다당류 분해능은 생마부패와 밀접한 관계가 있는 것으로 판단된다. 한편 생마 부패력이 약한 YAM-5 및 YAM-7의 경우 각각 PGase 및 CMCase 활성은 우수하나, amylase 활성이 미약함을 알 수 있으며, 이러한 결과는 생마의 주 성분이 전분질임을 감안할 때 , 저온에서 강력한 amylase 활성을 나타내는 균이 생마 저온 장기저장 시 부패원인균으로 작용함을 제시한다. 한편 양파부패에 관련된 Pseudomonas sp.
후속연구
- 20℃에서 최적 생육 pH를 검토한 결과 초기 pH 6~9 사이에서 정상적인 생육을 나타내었으나, pH 5 이하에서는 거의 성장이 나타나지 않았다. 따라서 생마의 저온 장기저장시 20도 이하의 저온에서도 중성 pH의 생마에서는 지속적인 세균성 부패가 일어날 수 있음을 추측케 하며, 이러한 결과는 식초 및 구연산 처리에 의한 생마 가공식품 개발과 장기보존 연구에 기초자료로 활용될 수 있을 것이다. 현재 저온부패성 Pseudomonas sp의 제어 및 저온 활성의 amylase, CMCase의 특성규명 및 효소저해에 대한 연구가 진행중이며, 향후 산장, 당장, 염장 생마 가공식품 개발연구도 필요하리라 판단된다.
- 가 저온부패에 밀접히 관련되어 있으며, 생마 부패에는 2VC 이하에서의 amylase와 cellulase 활성이 중요함을 확인하였다. 이러한 결과는 저온성 부패세균의 생육제어 및 효소 활성 제어를 통해 생마의 장기저장 및 저온유통 기술개발에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
- 따라서 생마의 저온 장기저장시 20도 이하의 저온에서도 중성 pH의 생마에서는 지속적인 세균성 부패가 일어날 수 있음을 추측케 하며, 이러한 결과는 식초 및 구연산 처리에 의한 생마 가공식품 개발과 장기보존 연구에 기초자료로 활용될 수 있을 것이다. 현재 저온부패성 Pseudomonas sp의 제어 및 저온 활성의 amylase, CMCase의 특성규명 및 효소저해에 대한 연구가 진행중이며, 향후 산장, 당장, 염장 생마 가공식품 개발연구도 필요하리라 판단된다.
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