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문제 정의
- 이에 대하여 기질 분해효소인 MMPs와 그 길항체인 TIMPs의 과발현이 이러한 병태생리의 한 요인으로 설명되고 있다. 본 연구에서는 특발성 폐섬유화증/통상형 간질성 폐렴을 비롯, 비특이성 간질성 폐렴에서 MMPs와 TIMPs의 발현 양상을 살펴보고자 하였다.
- 이에 저자들은 단백 분해 효소의 일종으로 폐 간질의 섬유화 과정에서 나타나는 교원질의 과다 침착과 폐포 기저막 파괴에 관여하는 것으로 알려져 있는 MMP-1, TIMP-1, TIMP-2, MMP-2 및 MMP-9의 발현 양상을 이들 질환군에서 알아보고 그 차이를 비교해 보고자 하였다.
제안 방법
- MMP-2와 MMP-9의 발현을 보기 위해 gelatin zymography를 시행하였다. Gelatinases인 MMP-2와 MMP-9이 gelatin을 분해하는 특성을 이용하여, 폐 조직에서 추출한 단백 성분을 10% gelatin을 기질로 하여 60볼트에서 5시간 동안 내려서 zymography를 시행하였다. 이 후 분리한 gel을 2.
- Figure 1. Immunohistochemical detection of MMP-1 in lung tissue with UIP (A), MMP-1 with NSIP (B), TIMP-1 with UIP (C), TIMP-1 with NSIP (D), TIMP-2 with UIP (E), TIMP-2 with NSIP (F). Immunoreactive MMP-1(collagenase-1) for UIP (A) and MMP-1 for NSIP (B) is noticed in reactive alveolar and bronchiolar epithelial cells and in clusters of alveolar macrophages (x 400).
- MMP-2와 MMP-9의 발현을 보기 위해 gelatin zymography를 시행하였다. Gelatinases인 MMP-2와 MMP-9이 gelatin을 분해하는 특성을 이용하여, 폐 조직에서 추출한 단백 성분을 10% gelatin을 기질로 하여 60볼트에서 5시간 동안 내려서 zymography를 시행하였다.
- 5% coomassie blue로 염색하였고 밤 새 methanol, acetic acid, 증류수로 조성된 용액으로 탈염색하였다. 그리고 gelatin 가수분해에 의하여 나타나는 band를 관찰하였는데, active MMP-2는 66 kD, pro MMP-2는 72 kD, active MMP-9은 85 kD, pro MMP-9은 92 kD의 분자량에 해당하는 band를 찾아 분석하였고, 정량분석을 위해 densitometry를 시행하였다. 각 측정치는 평균 ± 표준오차로 표시하였고 독립표본 t검정을 실시하였다.
- 2M NaCl, 5mM CaCl2, 1% Triton X-100 조성의 완충제에서 밤 새 37℃에서 배양하였다. 배양 후 gel은 0.5% coomassie blue로 염색하였고 밤 새 methanol, acetic acid, 증류수로 조성된 용액으로 탈염색하였다. 그리고 gelatin 가수분해에 의하여 나타나는 band를 관찰하였는데, active MMP-2는 66 kD, pro MMP-2는 72 kD, active MMP-9은 85 kD, pro MMP-9은 92 kD의 분자량에 해당하는 band를 찾아 분석하였고, 정량분석을 위해 densitometry를 시행하였다.
- 가열 후 15분간 식힌 다음 Tris 완충액으로 15분간 수세 하였다. 비특이적 인 단백과의 결합을 방지하기 위하여 정상 염소혈청으로 10분간 반응시킨 후 일차항체로는 MMP-1(IM35L), MMP-2(Fuji), MMP9(Fuji), TIMP-1(IM41L), TIMP-2 (IM56L) (Fiji chemical industries)를 사용하여 각각 4℃에서 12시간 동안 반응시켰다. Tris 완충용 액으로 5분간 수세하고 바이오틴이 부착된 이차 항체를 30분간 작용시키고 다시 Tris완충액으로 수세하였다.
- 연구대상에서 얻어진 조직은 10% 완충 포르말린 용액으로 고정시키고 파라핀 처리 후 hematoxylin과 eosin (H&E) 염색과 Masson trichrome 염색을 시행하여 병리조직학적 진단을 얻었고 면역조직화학 염색을 하였다.
- 연구방법: 특발성 폐섬유화증/통상형 간질성 폐렴, 비특이성 간질성 폐렴의 폐 조직을 이용하여 MMP-1,-2,-9, TIMP-1, -2에 대한 면역조직화학염색 검사와 MMP-2, MMP-9에 대한 gelatin zymography를 시행하였다. 면역조직화학염색 검사는 통상형 간질성 폐렴 22, 비특이성 간질성 폐렴 13례 였으며, gelatin zymography는 통상형 간질성 폐렴 9, 비특이성 간질성 폐렴 4례, 정상 대조군5례였다.
- 정상 대조군으로 폐암으로 진단받고 폐 부분절제술을 시행받은 환자 5명에서 정상 부위의 폐 조직을 얻었다. 이들 폐조직에서 단백 성분을 추출하여 gelatin zymography를 시행하였다.
대상 데이터
- 1999년 3월부터 2003년 3월까지 가천의대 길병원에서 개흉 폐 생검을 통해 특발성 간질성 폐렴으로 진단받은 환자 35명을 대상으로 하였고 병리 조직학적 진단으로 22례가 특발성 폐섬유화증/통상형 간질성 폐렴이었고, 13례가 비특이성 간질성 폐렴이었다.
- 1999년 3월부터 2003년 3월까지 개흉 폐 생검에 의해서 진단받은 특발성 간질성 폐렴 환자 13명을 대상으로 하였다. 그 중 9례가 특발성 폐섬유화증/통상형 간질성 폐렴, 4 례가 비특이성 간질성 폐렴이었다.
- 그 중 9례가 특발성 폐섬유화증/통상형 간질성 폐렴, 4 례가 비특이성 간질성 폐렴이었다. 정상 대조군으로 폐암으로 진단받고 폐 부분절제술을 시행받은 환자 5명에서 정상 부위의 폐 조직을 얻었다. 이들 폐조직에서 단백 성분을 추출하여 gelatin zymography를 시행하였다.
데이터처리
- 그리고 gelatin 가수분해에 의하여 나타나는 band를 관찰하였는데, active MMP-2는 66 kD, pro MMP-2는 72 kD, active MMP-9은 85 kD, pro MMP-9은 92 kD의 분자량에 해당하는 band를 찾아 분석하였고, 정량분석을 위해 densitometry를 시행하였다. 각 측정치는 평균 ± 표준오차로 표시하였고 독립표본 t검정을 실시하였다. p값은 0.
성능/효과
- Active MMP-9은 통상형 간질성 폐렴 151.6 ± 14.6 AU, 비특이성 간질성 폐렴 111.0 ± 16.4 AU, 정상 대조군 149.7 ± 1.1 AU의 결과를 보였고, 통상형 간질성 폐렴의 경우 비특이성 간질성 폐렴보다 유의하게 높았으나, 정상 대조군과는 유의한 차이를 보이지 않았다. Pro MMP-9의 경우도 통상형 간질성 폐렴 141.
- 연구결과: 면역조직화학 염색 검사 결과 섬유모세포/근섬유모세포 부위에서 TIMP-1, -2, MMP-2,9이 관찰 되었고, 특히 통상형 간질성 폐렴에서 비특이성 간질성 폐렴보다 TIMP-2가 강하게 발현되었다. Gelatin zymography 결과는 MMP-2, MMP-9 모두 통상형 간질성 폐렴에서 비특이성 간질성 폐렴보다 유의하게 높은 소견을 보여 주었다.
- MMP-1은 기관지 상피세포와 폐포 대식세포에서 grade 3으로 강하게 염색되는 소견을 보였고, 폐포 상피세포에서도 중등도 (grade 2)의 염색 소견을 보였다. TIMP-1은 폐포 상피세포와 섬유모세포/근섬유모 세포에서 경도 (grade 1)로 관찰 되었고 TIMP-2의 경우, 섬유모세포/근섬유모세포에서 만 중등도 (grade 2)의 염색정도를 보였다.
- 통상형 간질성 폐렴은 비특이성 간질성 폐렴 그리고 정상 대조군 보다 active MMP-2의 농도가 높았다. Pro MMP-2 또한 통상형 간질성 폐렴 140.0 ± 7.2 AU, 비특이성 간질성 폐렴 113.4 ± 4.1 AU, 정상 대조군 99.9± 13 AU으로 나타났고, 통상형 간질성 폐렴은 비특이성 간질성 폐렴, 정상 대조군 보다 유의하게 높은 소견을 보였다 (Figure 4).
- 1 AU의 결과를 보였고, 통상형 간질성 폐렴의 경우 비특이성 간질성 폐렴보다 유의하게 높았으나, 정상 대조군과는 유의한 차이를 보이지 않았다. Pro MMP-9의 경우도 통상형 간질성 폐렴 141.2 ± 15.0 AU, 비특이성 간질성 폐렴 104.9 ± 3.4 AU, 정상 대조군 133.7 ± 0.06 AU였고, 통상형 간질성 폐렴은 active MMP-9과 마찬가지로 비특이성 간질성 폐렴보다 유의하게 높은 소견을 보였으나, 정상 대조군과는 유의한 차이를 보이지 않았다 (Figure 5).
- 이를 기반으로 하여 본 연구에서 특발성 폐섬유화증/통상형 간질성 폐렴, 비특이성 간질성 폐렴 환자들의 폐 조직에서 MMP-1, TIMP-1, TIMP-2의 발현에 대하여 알아보았는데, MMP-1은 두 질환 모두 기관지 상피세포, 폐포 상피세포 및 대식세포에서 발견되었으며, 섬유 모세포/근섬유모세포 부위에서는 발견되지 않았고, 통상형 간질성 폐렴 조직의 폐포 상피세포 및 대식세포에서 비특이성 간질성 폐렴에 비해 강하게 발현 되었다. TIMP-1은 통상형 간질성 폐렴에서 폐포상피세포와 폐섬유모세포/근섬유모세포에서 경도의 염색소견을 보였고, 비특이성 간질성 폐렴에서는 기관지 상피세포, 폐포상피세포 및 대식세포에서 경도의 염색 소견만을 보였으나, TIMP-2의 경우 두 질환의 섬유 모세포/근섬유모세포 부위에서만 발현되었으며 특히 통상형 간질성 폐렴에서 비특이성 간질성 폐렴보다 강하게 발현되었다.
- MMP-1에 대한 면역조직화학 염색은 기관지 상피세포에서 grade 3으로 매우 강하게 나타나는 경우가 많았고 그 외 폐포 상피세포에서 경도(grade 1), 폐포 대식세포에서 중등도 (grade 2)의 염색 정도를 관찰할 수 있었다. TIMP-1의 경우, 기관지 및 폐포 상피세포와 폐포 대식세포에서 경도 (grade 1)로 염색되는 소견을 보였고, TIMP-2는 섬유모세포/근섬유모세포에서 경도 (grade 1)의 염색 정도를 보였다. MMP-2는 폐포 상피세포, 섬유모세포 /근섬유세포에서 중등도(grade 2)로 기관지 상피세포와 폐포 대식 세포에서 경도로 관찰되었고, MMP-9의 경우 중성구에서 중등도(grade 2) 로 림프구 에서 경도(grade 1)로 보였고, 기관지 및 폐포 상피세포와 폐포 대식세포에 서도 경도(grade 1)로 관찰되었다(Figure 1 /Figure 2).
- 본 연구의 면역화학염색 결과 중 MMP-2는 통상형 간질성 폐렴, 비특이성 간질성 폐렴사이에서 큰 차이를 보이지 않았으나 두 질환 모두 섬유모세포/근섬유 모세포에서 비교적 강한 염색을 보였고, MMP-9의 경우 섬유모세포/근섬유 모세포뿐 아니라 중성구에서 더욱 강한 염색을 보였다. Zymograpy결과는 MMP-2, -9 모두 비특이성 간질성 폐렴 보다 유의하게 특발성 폐섬유화증에서 증가되어있었다. 다만 MMP-9은 정상조직과 특발성 폐섬유화증 조직 사이에서 유의한 차이를 보이지 않았다.
- 결 론: 통상형 간질성 폐렴 에서 비특이성 간질성 폐렴보다 TIMP-2, MMP-2, MMP-9의 과발현을 관찰할 수 있었으며, 이는 통상형 간질성 폐렴의 비가역적인 섬유화 진행에 관여할 가능성이 있음을 추측해 볼 수 있다.
- 결론적으로 특발성 폐섬유화증/통상형 간질성 폐렴은 섬유모세포 /근섬유모세포에 의해 활발히 섬유화가 진행하는 fibroblast foci에서 TIMP-2, gelatinases, 특히 MMP-2가 증가되어 있었고, 비특이성 간질성 폐렴은 특발성 폐섬유화증/통상형 간질성 폐렴에 비해 TIMP-2, gelatinases의 발현이 감소되어있었다. 이러한 차이가 특발성 폐섬유화증/통상형 간질성 폐렴에서 gelatinases에 의한 기저막 파괴와 TIMP-2에 의한 세포외 기질의 콜라겐 침착을 유발하여, 비특이성 간질성 폐렴과는 다른 비가역적인 섬유화를 유발시키는 한 요인으로 작용할 가능성이 있음을 시사한다고 하겠다.
- 또한 본 연구에서는 폐포 기저막의 주 성분인 gelatin을 분해하는 gelatinases 즉 MMP-2와 MMP-9의 발현 정도를 분석하였는데 gelatin zymography를 통한 densitometric analysis에서 MMP-2, -9 모두 특발성 폐섬유화증에서 비특이성 간질성 폐렴보다 유의하게 높았다.
- 저자들 또한 2003 년에 통상형 간질성 폐렴, 비특이성 간질성 폐렴, 정상 대조군에서 TIMP-2의 발현이 통상형 간질성 폐렴에서 비특이성 간질성 폐렴과 정상 대조군에 비해 특히 fibroblast foci 내의 섬유모세포/근섬유 모세 포에서 증가되어 있음을 보고한 바 있다14. 본 연구에서는MMP-1은 특발성 폐섬유화증, 비특이성 간질성 폐렴 모두에서 섬유화 병변에서는 발현이 관찰되지 않았고, TIMP-1 역시 염색 강도가 비교적 약하면서 염색부위가 특발성 폐섬유화증과 비특이성 간질성 폐렴 사이에 뚜렷한 차이를 보이지 않았으나, TIMP-2의 경우 특발성 폐섬유화증 에서 비특이성 간질성 폐렴보다 과다하게 발현됨을 확인할 수 있었다. 이로써 특발성 폐섬유화증에서의 TIMP-2의 과발현은 정상 대조군 뿐만 아니라, 비특이성 간질성 폐렴과도 구별되는 특징으로, 비가역적인 폐 섬유화의 진행과도 연관이 있을 것으로 생각해 볼 수 있다.
- 이와 반해서 MMP-2는 주로 간질조직을 이루는 섬유모세포(fibroblast)등이 주요한 source가 되어 폐섬유화 조직에서 zymography로 직접 측정할 경우 섬유화의 진행 정도에 따라 증가된 것으로 사료된다8,12. 본 연구의 결과대로라면, gelatinases에 의해 폐포 기저막이 파괴되고 이를 통해 섬유모세포의 폐포강 내로의 이동이 촉진된다고 생각해 볼 때, 특발성 폐섬유화증에서 gelatinases의 증가가 fibroblast foci 형성에 중요한 역할을 한다고 유추해 볼 수 있다. 또한 gelatinases의 발현이 상대적으로 약한 비특이성 간질성 폐렴에서 fibroblast foci의 형성이 거의 없는 것으로 추측해 볼 수 있다.
- 그러나 Suga 등12은 특발성 폐섬유화증에서는 MMP-9이, 비특이성 간질성 폐렴에서는 MMP-2가 기관지폐포세척액에서 증가되었다고 보고하여 이를 특발성 폐섬유화증의 비가역적인 섬유화의 한 요인으로 제시하였다. 본 연구의 면역화학염색 결과 중 MMP-2는 통상형 간질성 폐렴, 비특이성 간질성 폐렴사이에서 큰 차이를 보이지 않았으나 두 질환 모두 섬유모세포/근섬유 모세포에서 비교적 강한 염색을 보였고, MMP-9의 경우 섬유모세포/근섬유 모세포뿐 아니라 중성구에서 더욱 강한 염색을 보였다. Zymograpy결과는 MMP-2, -9 모두 비특이성 간질성 폐렴 보다 유의하게 특발성 폐섬유화증에서 증가되어있었다.
- 세포에서 중등도(grade 2), 폐포상피세포 및 대식세포에서 경도(grade 1)의 염색 정도를 보였으며, MMP-9 은 중성구에서 강하게(grade 3), 림프구에서 경도(grade 1)로 염색되었고, 그 외 섬유모세포/근섬유모세포에서 중등도 (grade 2), 기관지 및 폐포 상피세포와 폐포 대식세포에서 경도(grade 1)의 염색 소견을 보였다. (Figure 1 /Figure 2).
- 연구결과: 면역조직화학 염색 검사 결과 섬유모세포/근섬유모세포 부위에서 TIMP-1, -2, MMP-2,9이 관찰 되었고, 특히 통상형 간질성 폐렴에서 비특이성 간질성 폐렴보다 TIMP-2가 강하게 발현되었다. Gelatin zymography 결과는 MMP-2, MMP-9 모두 통상형 간질성 폐렴에서 비특이성 간질성 폐렴보다 유의하게 높은 소견을 보여 주었다.
- . 이를 기반으로 하여 본 연구에서 특발성 폐섬유화증/통상형 간질성 폐렴, 비특이성 간질성 폐렴 환자들의 폐 조직에서 MMP-1, TIMP-1, TIMP-2의 발현에 대하여 알아보았는데, MMP-1은 두 질환 모두 기관지 상피세포, 폐포 상피세포 및 대식세포에서 발견되었으며, 섬유 모세포/근섬유모세포 부위에서는 발견되지 않았고, 통상형 간질성 폐렴 조직의 폐포 상피세포 및 대식세포에서 비특이성 간질성 폐렴에 비해 강하게 발현 되었다. TIMP-1은 통상형 간질성 폐렴에서 폐포상피세포와 폐섬유모세포/근섬유모세포에서 경도의 염색소견을 보였고, 비특이성 간질성 폐렴에서는 기관지 상피세포, 폐포상피세포 및 대식세포에서 경도의 염색 소견만을 보였으나, TIMP-2의 경우 두 질환의 섬유 모세포/근섬유모세포 부위에서만 발현되었으며 특히 통상형 간질성 폐렴에서 비특이성 간질성 폐렴보다 강하게 발현되었다.
- 4 AU이었다. 통상형 간질성 폐렴은 비특이성 간질성 폐렴 그리고 정상 대조군 보다 active MMP-2의 농도가 높았다. Pro MMP-2 또한 통상형 간질성 폐렴 140.
후속연구
- 이는 MMP-9을 생성하는 주 세포가 중성구등의 염증성 세포임을 고려해 볼 때 기존의 연구들에서는 연구의 대상이 주로 기관지폐포세척액으로 상대적으로 폐조직보다 염증성 세포가 많이 포함되어 있으므로 MMP-9이 증가되었을 가능성이 있다. 반면 본 연구에서는 상대적으로 염증성 세포가 적은 폐조직(lung parenchyme)에서 측정하였으므로 MMP-9의 증가가 확연히 규명되지 않았을 가능성도 있다고 생각된다. 이와 반해서 MMP-2는 주로 간질조직을 이루는 섬유모세포(fibroblast)등이 주요한 source가 되어 폐섬유화 조직에서 zymography로 직접 측정할 경우 섬유화의 진행 정도에 따라 증가된 것으로 사료된다8,12.
- 아울러 특발성 간질성 폐렴중에서 특발성 폐섬유화증/통상형 간질성 폐렴, 비특이성 간질성 폐렴에서 MMPs, TIMPs의 서로 다른 발현을 유도하는 원인 및 기전에 대한 추가적 연구가 행해져야 할 것으로 생각된다.
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