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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 미세먼지(PM)가 폐포대식세포의 TNF-α와 IL-β의 생성에 직접적으로 영향을 주는지 실험해 보았다. 그리고 TNF-α와 IL-1β 생성을 자극하는 또 다른 물질인 LPS에 PM을 투여했을 때 어떠한 영향을 미치는지를 평가하고자 하였다.
- . 따라서 본 연구에서는 미세먼지(PM)가 폐포대식세포의 TNF-α와 IL-β의 생성에 직접적으로 영향을 주는지 실험해 보았다. 그리고 TNF-α와 IL-1β 생성을 자극하는 또 다른 물질인 LPS에 PM을 투여했을 때 어떠한 영향을 미치는지를 평가하고자 하였다.
- 연구 배경: 대도시의 대기오염은 점차 악화되어 시민의 건강을 위협하고, 심·폐 질환의 발병률과 이로 인한 사망률을 증가시키고 있다. 서울시 도로가의 PM이 TNF-α와 IL-1β의 생성에 직접적으로 어떠한 영향을 미치는지와 PM의 노출이 LPS의 TNF-α와 IL-1β의 생성효과에는 어떠한 영향을 미치는지를 평가하고자 하였다.
제안 방법
- 그 후 1%의 BSA (bovine serum albumin)에 30분간 담가 항체의 비특이반응을 방지하였고, TNF-α antibody (10㎍/ml)와 IL-1β antibody (10㎍/ml)를 별도의 시료에 각각 2시간동안 상온에서 처리하였다. 2차 항체는 DAKO LSBA® 2 kit anti-rabbit Ig를 30분간 처리하고, DAKO LSBA® 2 kit HRP에서 30분간 처리한 후 DAB를 사용하여 발색시켰다. 슬라이드를 완전히 건조시킨 후 Harris's hematoxylin으로 대조염색을 실시하였다.
- 흰 쥐가 완전히 마취된 후 고정판에 앙와자세로 고정한다. 70% 알콜로 흰쥐의 복․흉부 피부를 소독하고 복부를 절개하여 배대동맥을 노출시키고 10ml의 일회용 주사기(21G needle)를 사용하여 배대동맥을 통하여 완전히 사혈하였다. 이어서 경부기도를 1/2가량 절개하고 18-gauge cannula를 넣고 기관지 폐포세척술 (bronchoalveolar lavage, BAL; with 37℃ Ca2+& Ma2+ free PBS, 6ml × 5회)을 시행하여 폐포대식세포를 채취하였다.
- AL (bronchoalveolar lavage)를 실시 후 DiffQuik® 염색을 실시하여 염증성 소견이 없는 폐포대식세포를 12 wells tissue culture plate에 seeding (0.5 x 105/well/ml)하고, 2시간 동안 전배양(37℃, 5% CO2 with 95% air)을 실시하였다. 전배양을 마친 세포들은 상층액을 제거한 후 실험설계에 따라 준비된 처치용액을 투여하고, 각각 정해진 시간동안 세포배양을 실시하였다.
- Lab-Tek® chamber 슬라이드에서 배양된 폐포대식세포에 각 처치에 따른 세포배양 후 세포면역화학 염색을 실시하였고, 그 결과를 Fig. 5 및 Fig. 6과 Table 4에 각각 나타내었다. 광학현미경하에서 TNF-α의 발현정도를 관찰한 결과 대조군 Fig.
- PM시료 (total precipitated particles)는 서울시 광진구 화양동의 전철 2호선 건대입구역으로부터 구의역 사이의 도로변 주위 건축물(창틀, 공중전화박스, 교통신호등제어기 등)에 쌓여있는 것을 수시로 채취하였다. PM의 대표성을 위하여 30곳 이상의 장소에서 균일한 양을 채취하였고, 미세한 모래입자 등의 오염방지를 위하여 지상 1.2m 이상의 높이에 자연적으로 낙하된 미세먼지만을 선별적으로 모았다. 채취된 분진은 균일하게 혼합한 후 가열 및 건조시켜 수분과 기타 오염 가능한 물질을 완전히 제거하였다.
- 채취된 분진은 균일하게 혼합한 후 가열 및 건조시켜 수분과 기타 오염 가능한 물질을 완전히 제거하였다. PM의 성분검사는 수의과학검역원(특수독성부)에 의뢰하여 중금속 성분의 함유량을 중심으로 분석하였다. 채취된 PM은 -20℃에서 보관하였고, 실험에 필요한 경우 소량씩 꺼내어 녹인 후 30초간 3번씩 초음파분쇄기로 분쇄하였다(in 0.
- 1차항체로는 anti-TNF-α 및 anti-IL-1β antibody를 nitrocellulose transfer membrane에 처리 하였고, 10분씩 3번 수세 buffer로 세척하였다. horseradish peroxidase와 2차항체가 결합된 용액으로 처리 하여 ECL detection system (Amersham Pharmacia Biotech)를 이용하여 단백질의 band를 확인하였다.
- 각 처치에 따른 폐포대식세포에서 TNF-α 및 IL-1b의 발현정도를 세포 면역화학염색법을 통하여 확인하기 위하여 순수 분리된 세포들을 Lab-Tek® chamber slides (0.3×106 cells/well/ml)에서 배양하였다. 실험을 위한 각 chamber는 세포배양기내에서 6시간 배양하였고, 세포배양 후 chamber내의 상층 액은 버리고 즉시 10% 포르말린용액에 세포가 부착된 슬라이드를 담가 5분간 고정하여 건조시켰고, 세포면역 화학염색 실험시까지 냉장 보관하였다.
- 대략적인 면역염색의 절차는 아래와 같다. 고정시킨 chamber 슬라이드를 TBS에 5분간 수세하고, endogenous peroxidase activity를 억제하기 위하여 3%의 과산화 수소 용액에 15분간 처리하였다. 그 후 1%의 BSA (bovine serum albumin)에 30분간 담가 항체의 비특이반응을 방지하였고, TNF-α antibody (10㎍/ml)와 IL-1β antibody (10㎍/ml)를 별도의 시료에 각각 2시간동안 상온에서 처리하였다.
- 고정시킨 chamber 슬라이드를 TBS에 5분간 수세하고, endogenous peroxidase activity를 억제하기 위하여 3%의 과산화 수소 용액에 15분간 처리하였다. 그 후 1%의 BSA (bovine serum albumin)에 30분간 담가 항체의 비특이반응을 방지하였고, TNF-α antibody (10㎍/ml)와 IL-1β antibody (10㎍/ml)를 별도의 시료에 각각 2시간동안 상온에서 처리하였다. 2차 항체는 DAKO LSBA® 2 kit anti-rabbit Ig를 30분간 처리하고, DAKO LSBA® 2 kit HRP에서 30분간 처리한 후 DAB를 사용하여 발색시켰다.
- 본 연구진은 PM의 흡입이 기존의 염증성 폐질환에 미치는 영향을 간접적으로 알아보기 위하여 배양된 일차 폐포대식세포(SPF 동물에서 분리)에 LPS를 전처리(감작)한 후 PM을 농도 및 세포배양시간별로 노출시키고, TNF-α 및 IL-1β의 형성에 미치는 효과를 측정하였다. 또한 PM의 흡입이 기존의 염증성 폐질환에 미치는 영향을 보다 실증적으로 알아보기 위하여 폐렴증상이 있는 것으로 확인된 흰쥐들에서 폐 내의 세포들을 분리한 후 위와 동일한 실험을 실시하였다.
- 반복된 기초실험(PM의 농도 10～50㎍/㎠, 폐포대식세포의 배양 6～72h)을 통하여 가장 이상적인 실험 조건으로 PM의 노출농도는 5～20㎍/㎠의 범위에서, 세포의 배양시간은 24～48시간으로 정하였다.
- 방법: 폐렴이 있는 흰쥐와 SPF 흰쥐의 폐포대식 세포 각각에 PM을 농도별로 처리하여 분비되는 TNF-α와 IL-1β의 농도를 측정하였다. 측정 방법으로는 western blot, ELISA 및 세포면역화학염색법을 이용하였다.
- . 본 연구진은 PM의 흡입이 기존의 염증성 폐질환에 미치는 영향을 간접적으로 알아보기 위하여 배양된 일차 폐포대식세포(SPF 동물에서 분리)에 LPS를 전처리(감작)한 후 PM을 농도 및 세포배양시간별로 노출시키고, TNF-α 및 IL-1β의 형성에 미치는 효과를 측정하였다. 또한 PM의 흡입이 기존의 염증성 폐질환에 미치는 영향을 보다 실증적으로 알아보기 위하여 폐렴증상이 있는 것으로 확인된 흰쥐들에서 폐 내의 세포들을 분리한 후 위와 동일한 실험을 실시하였다.
- 그 후 세포추출 용액을 4℃ 12,000rpm에서 20분간 원심분리하여 단백질을 분리하였고, Bradford methods를 이용하여 정량하였다. 분리된 단백질은 15% SDS-PAGE gel 을 사용하여 전기영동을 실시하였고, nitrocellulose transfer membrane으로 옮긴 후 비특이적인 반응을 억제하기 위하여 5% skim milk로 blocking을 실시하였다. 1차항체로는 anti-TNF-α 및 anti-IL-1β antibody를 nitrocellulose transfer membrane에 처리 하였고, 10분씩 3번 수세 buffer로 세척하였다.
- 분석기기로는 Inductively coupled plasma atomic emission spectrometry (ICP-AES, Labtab Co., Austrailia)를 사용하여 아래의 조건으로 Al, Fe, Cu 등을 분석하였다(Table 2).
- 전배양을 마친 세포들은 상층액을 제거한 후 실험설계에 따라 준비된 처치용액을 투여하고, 각각 정해진 시간동안 세포배양을 실시하였다. 세포배양 후 상층액을 분리하여 즉시 -80℃ 냉동고에 보관하였고, 각 시료 에서 ELISA 기법으로 TNF-α와 IL-1β의 생성을 정량적으로 측정하였다. 구체적인 실험방법은 ELISA plate 제조사에서 제공한 실험방법을 따랐으며, 대략적인 절차는 아래와 같았다.
- 2차 항체는 DAKO LSBA® 2 kit anti-rabbit Ig를 30분간 처리하고, DAKO LSBA® 2 kit HRP에서 30분간 처리한 후 DAB를 사용하여 발색시켰다. 슬라이드를 완전히 건조시킨 후 Harris's hematoxylin으로 대조염색을 실시하였다. 각 군의 항체의 발현정도는 임의로 선정된세 곳에서 각각 100개의 세포를 세었을 때 발색되는 세포수를 백분율로 나타내었다.
- 70% 알콜로 흰쥐의 복․흉부 피부를 소독하고 복부를 절개하여 배대동맥을 노출시키고 10ml의 일회용 주사기(21G needle)를 사용하여 배대동맥을 통하여 완전히 사혈하였다. 이어서 경부기도를 1/2가량 절개하고 18-gauge cannula를 넣고 기관지 폐포세척술 (bronchoalveolar lavage, BAL; with 37℃ Ca2+& Ma2+ free PBS, 6ml × 5회)을 시행하여 폐포대식세포를 채취하였다. 채취한 폐포대식세포를 원심분리 (600rpm ×5min)하여 회수하였다.
- 5×106/well/ ml)에 loading한 후 2시간 동안 전배양 (37℃, 5% CO2 with 95% air)을 실시하였다. 전배양을 마친 세포들에서 상층액을 제거한 후 실험설계에 따라 준비된 처치용액을 투여하였다.
- 5 x 105/well/ml)하고, 2시간 동안 전배양(37℃, 5% CO2 with 95% air)을 실시하였다. 전배양을 마친 세포들은 상층액을 제거한 후 실험설계에 따라 준비된 처치용액을 투여하고, 각각 정해진 시간동안 세포배양을 실시하였다. 세포배양 후 상층액을 분리하여 즉시 -80℃ 냉동고에 보관하였고, 각 시료 에서 ELISA 기법으로 TNF-α와 IL-1β의 생성을 정량적으로 측정하였다.
- 이어서 경부기도를 1/2가량 절개하고 18-gauge cannula를 넣고 기관지 폐포세척술 (bronchoalveolar lavage, BAL; with 37℃ Ca2+& Ma2+ free PBS, 6ml × 5회)을 시행하여 폐포대식세포를 채취하였다. 채취한 폐포대식세포를 원심분리 (600rpm ×5min)하여 회수하였다. 폐포세척술로 얻어진 폐포 세척액은 Cytospin® 기계를 사용하여 세포를 슬라이드에 부착시킨 후 Diff-Quik® 염색을 실시하였다.
대상 데이터
- 전기영동은 미국 Biorad사에서 구입한 기기를 사용하였고, TNF α및 IL-1β antibody 그리고 Rat TNF-α 및 Rat IL-1β ELISA kit는 미국 Biosource사에서 구입하였다. LPS (E.Coli serotype O55 B5), RPMI-1640 medium, 세포면역화학염색법의 발색을 위한 3, 3'-diamino benzidine(DAB) 등의 일반 시약은 모두 Sigma사 제품을 사용하였다.
- PM 시료는 Modified EPA method 3052로 전처리 하였고 전처리장비는 초고압초음파분해장치 (Microwave Digestion System; MDS, Questron Co., USA), 분해용매는 HNO3 과 HF mixture sol(3:1 v/v)을 사용하였다. 분해조건은 다음과 같다(Table 1).
- PM시료 (total precipitated particles)는 서울시 광진구 화양동의 전철 2호선 건대입구역으로부터 구의역 사이의 도로변 주위 건축물(창틀, 공중전화박스, 교통신호등제어기 등)에 쌓여있는 것을 수시로 채취하였다. PM의 대표성을 위하여 30곳 이상의 장소에서 균일한 양을 채취하였고, 미세한 모래입자 등의 오염방지를 위하여 지상 1.
- SPF Sprague-Dawley계 흰쥐(300g, ♂) 40마리를 (주)샘타코에서 구입하였고, (주)중앙실험동물에서 제조한 사료를 물과 함께 자유급식 시키는 상태에서 실험동물전용 사육실에서 사육하였다.
- ELISA reader기는 미국 Molecularal Devices사에서 구입한 VERSA maxTM를 사용하였다. 전기영동은 미국 Biorad사에서 구입한 기기를 사용하였고, TNF α및 IL-1β antibody 그리고 Rat TNF-α 및 Rat IL-1β ELISA kit는 미국 Biosource사에서 구입하였다. LPS (E.
데이터처리
- 0을 사용하여 실험설계에 대한 분산분석은 ANOVA로, 각 처치 군들과의 비교는 student t-test를 실시하여 검정하였다. 각 자료는 4번 이상의 반복된 실험을 통하여 얻어진 결과를 Mean ± SEM로 표시하였고, p＜0.05인 경우 통계적 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
- 통계 프로그램인 SPSS 10.0을 사용하여 실험설계에 대한 분산분석은 ANOVA로, 각 처치 군들과의 비교는 student t-test를 실시하여 검정하였다. 각 자료는 4번 이상의 반복된 실험을 통하여 얻어진 결과를 Mean ± SEM로 표시하였고, p＜0.
이론/모형
- 세포배양 후 상층액을 분리하여 즉시 -80℃ 냉동고에 보관하였고, 각 시료 에서 ELISA 기법으로 TNF-α와 IL-1β의 생성을 정량적으로 측정하였다. 구체적인 실험방법은 ELISA plate 제조사에서 제공한 실험방법을 따랐으며, 대략적인 절차는 아래와 같았다. 50㎕의 standard dileunt buffer를 zero well에 넣고, 50㎕의 농도 별 표준용액과 시료용액을 각 well에 넣은 다음 anti-TNF-α (biotin conjugate) 및 anti-IL-1β (biotin conjugate) 용액 50㎕를 각 well에 넣어 혼합하고 상온에서 1시간 30분반응시켰다.
- 0, 50mM NaCl, 50mM NaF, 100uM Na3VO4, 1mM DTT, 50㎍/ml PMSF)를 투여하고 4℃에서 30분간 보관하였다. 그 후 세포추출 용액을 4℃ 12,000rpm에서 20분간 원심분리하여 단백질을 분리하였고, Bradford methods를 이용하여 정량하였다. 분리된 단백질은 15% SDS-PAGE gel 을 사용하여 전기영동을 실시하였고, nitrocellulose transfer membrane으로 옮긴 후 비특이적인 반응을 억제하기 위하여 5% skim milk로 blocking을 실시하였다.
- 면역염색을 통한 TNF-α 및 IL-1β의 발현정도를 단백질의 양적인 수준에서 검증하기 위하여 western blot을 실시하였다. 그 결과 대조군의 시료에서는 TNF-α 및 IL-1β가 거의 검출되지 않았고, PM을 단독으로 투여한 처치군에서는 미약하게 발현되었으며, LPS 및 LPS와 PM이 함께 처치된 투여군에서는 아주 강하게 발현되었다(Fig.
- 방법: 폐렴이 있는 흰쥐와 SPF 흰쥐의 폐포대식 세포 각각에 PM을 농도별로 처리하여 분비되는 TNF-α와 IL-1β의 농도를 측정하였다. 측정 방법으로는 western blot, ELISA 및 세포면역화학염색법을 이용하였다. 또한 동일 PM 농도에서 배양시간을 달리하여 위와 같이 측정하였다.
성능/효과
- SPF 흰쥐에서 분리한 세포들에 PM을 단독으로 투여(5～20㎍/㎠)한 후 IL-1β를 측정한 결과 모든 처치군에서 생성이 확인되었으나, PM 투여농도의 증가에 따른 상승효과는 통계학적으로 유의하지 않았다. LPS와 PM을 병용하여 투여하였을 때에는 LPS 단독 투여에 비해 PM 고농도의 처치군(10～20㎍/㎠)에서만 유의하게 증가하였다(Fig. 4). 세포를 48시간 배양하고 측정한 실험에서는 24시간에서의 결과와 유사한 경향을 보였다.
- LPS와 PM을 병용하여 투여하였을 때에는 모든 처치군에서 LPS를 단독으로 투여하였을 때보다 유의하게 증가하였으나, 투여용량의 증가에 따른 효과는 없었다(Fig. 3). 세포 배양 시간(24h, 48h)을 달리한 실험의 결과는 서로 유사한 경향을 보였으나, 이 역시 시간에 비례하지 않았다(Fig.
- PM 단독투여(5～20㎍/㎠)한 SPF 흰쥐에서 생성된 TNF-α를 측정한 결과 모든 처치군에서 TNF-α의 생성이 확인되었고, 투여용량의 증가에 따른 TNF-α생성도가 유의하게 증가하였다.
- 그러나 두 인자 모두 배양시간의 증가에 따른 생성효과는 확인되지 않았다. PM과 LPS를 병용하여 투여하였을 때에는 TNF-α의 경우 LPS 단독투여에 의한 효과에 상승적으로 유의하게 증가하였으나 PM 의 투여용량 증가에 따른 효과는 확인되지 않았다. IL-1b의 경우에는 고농도에서만 LPS와 PM 병용투여에 따른 상승적 생성효과가 확인되었다.
- SPF 흰쥐에서 분리한 세포들에 PM을 단독으로 투여(5～20㎍/㎠)한 후 IL-1β를 측정한 결과 모든 처치군에서 생성이 확인되었으나, PM 투여농도의 증가에 따른 상승효과는 통계학적으로 유의하지 않았다. LPS와 PM을 병용하여 투여하였을 때에는 LPS 단독 투여에 비해 PM 고농도의 처치군(10～20㎍/㎠)에서만 유의하게 증가하였다(Fig.
- 5-(f)는 각각 LPS 처리군과 LPS와 PM 병용처리군의 ×1,000 확대사진이다. 각 처치군에 따른 TNF-α의 발현은 PM과 LPS 를 각각 단독으로 처리한 처치군에서도 TNF-α 단백질의 발현이 확인되었고, LPS와 PM을 함께 처리한 실험군에서는 TNF-α의 발현율이 가장 높아 LPS를 단독으로 처리한 실험군보다 높은 양성반응을 보였다. 각 처치군에 따른 IL-1β의 발현정도는 Fig.
- 결과: SPF인 흰쥐에서 분리된 페포대식세포에 PM을 단독으로 투여하였을 때 대조군에 비해서 TNF-α와 IL-1β의 생성도가 모든 투여군에서 유의 하게 증가하였으나, 투여용량의 증가에 따른 유의성은 없었다. 그러나 염증성인 쥐에서 분리된 폐포대식세포에서는 모든 투여군에서 대조군에 비하여 통계학적으로 유의하게 증가하였으며, PM 투여농도의 증가에 따른 생성량도 유의하게 증가하였다.
- 결론: PM을 장기간 혹은 일정 농도 이상으로 흡입할 경우 폐포대식세포의 TNF-α와 IL-1β의 분비에 영향을 미쳐 새로운 폐질환을 유발할 수 있다. 그러므로 기존에 염증성 폐질환이나 기관지천식이 있는 환자가 미세먼지를 흡입할 경우에는 TNF-α와 IL-1β의 생성에 커다란 영향을 미쳐 호흡기 질환을 더욱 악화시킬 가능성이 있을 것으로 추정된다.
- 면역염색을 통한 TNF-α 및 IL-1β의 발현정도를 단백질의 양적인 수준에서 검증하기 위하여 western blot을 실시하였다. 그 결과 대조군의 시료에서는 TNF-α 및 IL-1β가 거의 검출되지 않았고, PM을 단독으로 투여한 처치군에서는 미약하게 발현되었으며, LPS 및 LPS와 PM이 함께 처치된 투여군에서는 아주 강하게 발현되었다(Fig. 7). 이러한 결과는 면역염색 ELISA의 결과와도 유사한 것이다.
- 결과: SPF인 흰쥐에서 분리된 페포대식세포에 PM을 단독으로 투여하였을 때 대조군에 비해서 TNF-α와 IL-1β의 생성도가 모든 투여군에서 유의 하게 증가하였으나, 투여용량의 증가에 따른 유의성은 없었다. 그러나 염증성인 쥐에서 분리된 폐포대식세포에서는 모든 투여군에서 대조군에 비하여 통계학적으로 유의하게 증가하였으며, PM 투여농도의 증가에 따른 생성량도 유의하게 증가하였다.
- 본 실험에 사용된 PM의 화학적구성에 관하여 12종류의 중금속을 중심으로 분석한 결과 카드뮴을 제외한 11종의 주요 중금속이 검출되었으며, 특히 알루미늄, 철, 아연의 비중의 높게 차지하고 있는 것으로 나타났다(Table 3).
- 실험결과 SPF 흰쥐에서 분리한 폐포대식세포에 PM을 단독으로 처리한 결과 모든 투여군에서 투여용량의 증가에 비례하여 TNF-α(5～200pg/ml)의 형성이 확인되었다. IL-1β의 경우 모든 투여군에서 형성이 증가하였으나 아주 낮은 농도로 (＜15pg/ml) 형성되었다.
- IL-1b의 경우에는 고농도에서만 LPS와 PM 병용투여에 따른 상승적 생성효과가 확인되었다. 염증이 있는 것으로 판별된 흰쥐에서 분리된 폐포대식세포에서는 PM 노출 농도의 증가에 따른 TNF-α의 생성효과가 뚜렷하게 증가하여 대조군에 비하여 최고 2,000%이상 높게 형성되었다. IL-1β의 경우에는 대조군에 비하여 최고 300%이상 높게 생성되는 것으로 확인되었다.
- 폐렴증상이 있는 흰쥐에서 분리된 페포대식세포에 PM을 단독으로 투여한(5～20㎍/㎠) 후 각각 24시간및 48시간 동안 세포를 배양하고, 배양된 배지에서 TNF-α를 측정한 결과 모든 처치군에서 TNF-α의 생성이 확인되었다. 투여된 미세분진의 농도(5～20㎍/㎠)가 증가할수록 TNF-α의 생성도 확연히 증가되었다. 그러나 세포 배양 시간에 비례한 증가는 유의하지 않았다(Fig.
- 폐렴증상이 있는 흰쥐에서 분리된 페포대식세포에 PM을 단독으로 투여한(5～20㎍/㎠) 후 각각 24시간및 48시간 동안 세포를 배양하고, 배양된 배지에서 TNF-α를 측정한 결과 모든 처치군에서 TNF-α의 생성이 확인되었다. 투여된 미세분진의 농도(5～20㎍/㎠)가 증가할수록 TNF-α의 생성도 확연히 증가되었다.
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