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문제 정의
- 그러나, 미세먼지에 관한 기관지염의 발생에 대한 뚜렷한 대책이 없는 상황이기 때문에 미세먼지를 흡입했을 때 호흡기를 보호할 수 있는 천연물질에 대해 관심이 높아지고 있다. 따라서 본 연구에서는 기관지 염증 치료효과에 관한 연구가 아직까지 보고된 바가 없는 천연물 자원인 배암차즈기 추출물을 대상으로 호흡기 염증 개선 효과를 확인하고자 하였다. 이를 위해 마우스 MH-S 대식세포주에 미세먼지 (APM)로 산화적 스트레스를 유도하였고 배암차즈기 추출물에 의한 활성산소종 (ROS) 및 염증사이토카인 발현 억제효과를 관찰하였고, 또한 미세먼지로 유도된 호흡기 손상 마우스모델을 통하여 호흡기 염증개선효과도 검증하였다.
- , 2008), 그러나 아직까지 특정 물질의 미세먼지에 대한 특이적 효능에 대하여 보고된 바는 없다. 이러한 가운데 본 연구는 배암차즈기가 미세먼지에 의해 유도된 염증반응에 미치는 효능에 대하여 탐색하였다.
가설 설정
- (SP_R) in MH-S alveolar macrophage cells. A; the cell survival of MH-S cells was measured by MTS assay after treatment of SP_R extracts indicated concentration. The 50 ㎍/㎖ of SP_R extracts was suitable concentration for in vitro.
제안 방법
- 10 일간 미세먼지의 기관지 주입과 함께 배암차즈기 추출물을 매일 경구 투여하여 미세먼지에 의해 유도된 호흡기 질환 마우스 모델에서 배암차즈기 추출물의 호흡기 염증 증상의 개선 효과를 관찰하였다. H&E 염색법을 통하여 폐조직의 단면을 검사함으로써 호흡기 염증 증상을 확인하고 M-T 염색법을통하여 교원 섬유의 양을 측정하였다.
- cell을 FACS tube에 분주하고 FACS buffer로 2 회 세척한 다음, DCF-DA 용액을 각 tube당 10 µM의 농도로 분주하여 세포를 현탁하였다. 37℃ 암실에서 30 분간 staining한 후 FACSCaliburTM flow cytometry system (Becton, Dickinson and Co., Franklin Lakes, NJ, USA)를 이용하여 분석하였다.
- H&E 염색법을 통하여 폐조직의 단면을 검사함으로써 호흡기 염증 증상을 확인하고 M-T 염색법을통하여 교원 섬유의 양을 측정하였다.
- Louis, MO, USA)에서, 또한 nepetin (ASB-00005380-005)은 ChromaDex (Irvine, CA, USA)사에서 구입하여 사용하였다. HPLC 분석은 waters 2695 및 996 photodiode array detector에 의하여 수행하였다.
- IL-17A (M17AFO), TNF-α (MTA00B), Mip-2 (MM200), 그리고 Cxcl-1 (MKC00B) 단백질량을 BAL fluid에서 ELISA kit (R&D system, Minneapolis, MN, USA)를사용하여 제조사의 지시에 따라 시행하였다.
- MH-S murine alveolar macrophage cell line (ATCC, Rockville, MD, USA)는 RPMI 1640 medium (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA)에 10% fetal bovine serum (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA)과 1% antibiotics (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA)를 첨가하여 사용하였고, 항온 (37℃)과 항습을 유지하는 5% CO2 incubator에서 배양하였다.
- 각 세포와 조직들로부터 유전자의 발현을 분석하기 위해 TRIzol reagent 용액 (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA USA)을 이용하여 RNA를 분리하였다. 추출한 RNA를 RTase, dNTP, buffer, oligo-dT를 넣은 후 42℃ water bath에서 2 시간 동안 반응시켜 cDNA를 합성하였다.
- 합성된 cDNA에 2 x SYBR green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster, CA, USA), 200 nM primers, Rox dye를 넣은 후 각 cycle은 95℃ 15 sec, 55℃ 15 sec, 72℃ 15 sec의 조건으로 Applied Biosystems 7500 real-time PCR system (Applied Biosystems, Foster, CA, USA)를 이용하여 PCR을 수행하였다. 각 유전자의 발현은 housekeeping 유전자 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) 를 internal control로 사용하여 상대적 정량값을 비교분석하였다 (Table 1).
- , Franklin Lakes, NJ, USA)를 이용하여 유세포 분석을 하였다. 결과는 CellQuest software (Becton, Dickinson and Co., Franklin Lakes, NJ, USA)를 사용하여 세포를 분석하였고, 분석한 세포 수와 백분율을 이용해 총 세포 수를 구하였다. 유세포 분석을 위한 antibody는 BD Pharmingen (Becton, Dickinson and Co.
- 제조된 석탄연소물은 KT&G 중앙연구원에서 공급하였고, 플라이애쉬 (fly ash)는 일본 JIS type-II fly ash (Yoshitaka, 2007)를 제공받아 사용하였으며, 각각을 디젤연소분진 (DEP) (Lim and Kim, 2009)과 혼합하여 미세먼지 혼합물을 제조하였다. 구체적으로는 디메틸설폭사이드 (DMSO) 에 녹인 석탄연소물 (5 ㎎/㎖), 플라이애쉬 (10 ㎎/㎖), 디젤연소분진 (5 ㎎/㎖) 을 각각 최종농도가 석탄연소물 (0.25 ㎎/㎖), 플라이애쉬 (0.5 ㎎/㎖), 디젤연소분진 (0.75 ㎎/㎖)로 희석하여 혼합하고, 명반 (aluminium hydroxide) gel adjuvant를 8%로 희석되게 하여 최종적으로 미세먼지 혼합물 (ambient particulate matter, APM)을 제조하였다.
- 즉, 미세먼지 처리에 의한 세포생존율은 농도 의존적으로 감소하였으며 100, 200 ㎍/㎖ 의 농도에서는 95% 이상의 감소 수준을 보였다. 그러므로 약 50%의 세포생존율을 보이면서 ROS 생산량이 가장 높은 50 ㎍/㎖의 농도를 다음 실험을 위한 미세먼지의 처리 농도 값으로 선정하였다.
- 기관지 삽입에 의한 기도세척 (airway lamina washing)을 통해 마우스의 기도세척액 (airway lavage)으로부터 기관지폐 포세척액 (bronchoalveolar lavage fluid, BAL fluid)을 분리한 다음, 분리한 BAL fluid를 cytospin에 넣어 슬라이드 도말한 후 Diff-quick 용액으로 염색하여 neutrophils의 감별을 실시하였다. 동물로부터 분리한 폐 조직은 10% 포르말린 용액에 고정하여 sucrose를 이용해 탈수과정을 거친 후 hematoxylin과 eosin 용액을 이용하여 염색한 다음 조직병리학적 검사를 실시하였다.
- 기관지 삽입에 의한 기도세척 (airway lamina washing)을 통해 마우스의 기도세척액 (airway lavage)으로부터 기관지폐 포세척액 (bronchoalveolar lavage fluid, BAL fluid)을 분리한 다음, 분리한 BAL fluid를 cytospin에 넣어 슬라이드 도말한 후 Diff-quick 용액으로 염색하여 neutrophils의 감별을 실시하였다. 동물로부터 분리한 폐 조직은 10% 포르말린 용액에 고정하여 sucrose를 이용해 탈수과정을 거친 후 hematoxylin과 eosin 용액을 이용하여 염색한 다음 조직병리학적 검사를 실시하였다. 다른 section은 Masson’s trichrome 용액 (SigmaAldrich Co.
- 마우스의 BAL과 폐 조직에서 flow cytometry 분석을 통해 세포빈도를 CD11b+/Gr-1+ 백분율(%)로 분석한 후 총 세포수를 적용하여 각 조직에서의 절대 총 세포 수를 산출하였다. 그 결과 미세먼지를 주입한 대조군의 BAL과 폐에서 CD11b+/ Gr-1+ 면역 세포 수가 유의성 있게 증가함을 확인하였다.
- cell이 되도록 분주하여 배양하였다. 미세먼지 (25, 50, 100, 200 ㎍/㎖)와 배암차즈기 추출물 (25, 50, 100, 200, 400 ㎍/㎖)을 농도별로 처리하여 24 시간 배양한 다음 MTS tetrazolium salt와 electron coupling reagent (phenazine methosulfate, PMS)를 20 : 1의 비율로 섞어 각 well당 MTS + PMS 용액 50 ㎕ 와 RPMI 1640 media 50 ㎕ 를 혼합하여 100 ㎕ 씩 분주하였다. 37℃에서 4 시간 배양한 후 차광반응으로 plate reader를 이용하여 490 ㎚ 에서 흡광도를 측정하였다.
- 배암차즈기 추출물 (식품으로 안전한 농도인 100 ㎎/㎏, 200 ㎎/㎏, 400 ㎎/㎏) (Choi et al., 2016; Kim et al., 2016)과 양성대조군 montelukast (10 ㎎/㎏)를 각각 10 일간 투여하였고 투여시작일로부터 3 일 후, 6 일 후에 미세먼지혼합물을 주입하였다.
- 배암차즈기 추출물을 20 ㎎/㎖ 로 70% 메탄올에 용해한 후, PVDF syringe filter를 사용하여 여과한 후 분석에 사용하였다. Optima pak C18 column (5 ㎛, 4.
- 세포의 차이를 분석하기 위하여 각 샘플은 staining solution (PBS containing 1% FBS and 0.01% NaN3)에서 정해진 antibody를 이용하여 10 분간 염색한 다음 FACScalibur flow cytometry system (Becton, Dickinson and Co., Franklin Lakes, NJ, USA)를 이용하여 유세포 분석을 하였다. 결과는 CellQuest software (Becton, Dickinson and Co.
- 이동상은 acetonitrile (A) 및 0.1% TFA 함유 water (B)를 이용한 gradient system (0 min, 10% A; 10 min, 10% A; 50 min, 50% A; 52 min, 100% A; 62 min, 100% A; 65 min, 10% A; 75 min, 10% A)으로 최적화하였고, 유속은 1.0 ㎖/min, 주입량은 20 ㎕ 로 하였다.
- ) 추출물의 효과를 보았을 때, 염증을 일으키는 매개체 중 하나인 ROS의 생성량을 줄였고 염증 사이토카인의 발현을 정상군의 수준으로 회복하는 것을 볼 수 있었다. 이러한 효능을 토대로 동물모델에 대기오염물질을 INT injection을 시켜 호흡기 손상 모델을 만들고 배암차즈기 추출물을 경구투여하여 염증 억제 효과를 살펴보았다. 실험결과 미세먼지의 유도에 의해 폐포의 벽이 두꺼워지고 교원 섬유의 양이 증가했으며 이러한 증가된 염증 반응을 배암차즈기 추출물이 다시 정상군 수준으로 회복시키는 것을 확인하였다.
- 따라서 본 연구에서는 기관지 염증 치료효과에 관한 연구가 아직까지 보고된 바가 없는 천연물 자원인 배암차즈기 추출물을 대상으로 호흡기 염증 개선 효과를 확인하고자 하였다. 이를 위해 마우스 MH-S 대식세포주에 미세먼지 (APM)로 산화적 스트레스를 유도하였고 배암차즈기 추출물에 의한 활성산소종 (ROS) 및 염증사이토카인 발현 억제효과를 관찰하였고, 또한 미세먼지로 유도된 호흡기 손상 마우스모델을 통하여 호흡기 염증개선효과도 검증하였다.
- 폐의 대식세포인 MH-S 세포주을 통하여 배암차즈기 추출물의 항염증 효능을 분석하고 in vitro 실험의 적정 투여량을 설정하기 위하여 우선 미세먼지의 처리 농도를 결정하였다. 미세먼지 (APM)를 농도별 (25, 50, 100, 200 ㎍/㎖) 로 처리한후 MTS assay를 통해 세포생존율을 관찰한 결과, 미세먼지 100, 200 ㎍/㎖ 처리농도에서는 세포독성에 의해 거의 모든 세포가 death되었고 50 ㎍/㎖ 처리농도 이하에서 50% 이상 세포생존율이 관찰되었다 (Fig.
- 추출한 RNA를 RTase, dNTP, buffer, oligo-dT를 넣은 후 42℃ water bath에서 2 시간 동안 반응시켜 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA에 2 x SYBR green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster, CA, USA), 200 nM primers, Rox dye를 넣은 후 각 cycle은 95℃ 15 sec, 55℃ 15 sec, 72℃ 15 sec의 조건으로 Applied Biosystems 7500 real-time PCR system (Applied Biosystems, Foster, CA, USA)를 이용하여 PCR을 수행하였다. 각 유전자의 발현은 housekeeping 유전자 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) 를 internal control로 사용하여 상대적 정량값을 비교분석하였다 (Table 1).
- 실험 기간 동안 물과 고형사료는 자유롭게 섭취할 수 있도록 제공하였다. 호흡기 손상 미세먼지는 석탄연소물인 coal과 fly ash, diesel exhaust particles (DEP)를 섞은 4 ㎎/㎏ 미세먼지혼합물 (APM)을 aluminium hydroxide (alum)에 희석시켜 intra- nazal-trachea (INT) injection 방법을 이용하여 기도를 통해 폐로 직접 주입하는 동물모델을 제작하였다.
대상 데이터
- HPLC 분석을 위한 acetonitrile과 water는 HPLC용 특급용 매로, trifluoroacetic acid (TFA)는 분석용 등급의 용매로 Merck Millipore (Billerica, MA, USA)에서 구입하였다. Hispidulin (SML0582), luteolin (L9283), 그리고 rosmarinic acid (536954)등 표준품들은 Sigma-Aldrich (St.
- HPLC 분석을 위한 acetonitrile과 water는 HPLC용 특급용 매로, trifluoroacetic acid (TFA)는 분석용 등급의 용매로 Merck Millipore (Billerica, MA, USA)에서 구입하였다. Hispidulin (SML0582), luteolin (L9283), 그리고 rosmarinic acid (536954)등 표준품들은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서, 또한 nepetin (ASB-00005380-005)은 ChromaDex (Irvine, CA, USA)사에서 구입하여 사용하였다. HPLC 분석은 waters 2695 및 996 photodiode array detector에 의하여 수행하였다.
- 미세먼지는 여러 가지 복합한 성분을 가진 대기 중 부유 물질인데, 그 중 미세먼지의 구성성분인 석탄연소물 (coal)은 5 g 의 석탄을 700℃의 가열로 (ULVAC-RIKO TPC5000, ULVAC Technologies Inc., Methuen, MA, USA)에서 10 분간 연소시키면서 발생되는 연소물을 glass fiber filter pad에 포집하였고, 포집된 TPM (total particulate matter)은 DMSO 용액을 사용해서 10 ㎎ TPM/㎖ 로 농도로 추출해서 석탄 연소물실험에 사용하였다. 제조된 석탄연소물은 KT&G 중앙연구원에서 공급하였고, 플라이애쉬 (fly ash)는 일본 JIS type-II fly ash (Yoshitaka, 2007)를 제공받아 사용하였으며, 각각을 디젤연소분진 (DEP) (Lim and Kim, 2009)과 혼합하여 미세먼지 혼합물을 제조하였다.
- 본 연구는 수컷 C57BL/6J 마우스 (20 - 22 g, 대한바이오, 음성)를 실험 기간 동안 평균 온도 23 ± 2℃, 습도 50 ± 2%로 유지하였으며, 밤낮 주기 (12 시간 light/12 시간 dark, light turn on 9 am)가 조절되는 환경에 수용하였다.
- 실험에 사용한 acetonitrile, ethyl alcohol, methyl alcohol은 Merck Millipore (Billerica, MA, USA)에서, dimethyl sulfoxide (DMSO), formalin solution, phosphate buffered saline (PBS), hispidulin, luteolin, rosmarinic acid, nepetin montelukast, 2-7-dicholordihydrofluorescein diacetate (DCFDA), aluminium hydroxide는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서, Dulbecco’s modified Eagle's medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), penicillin-streptomycinamphotericin B (antibotics), 0.25% trypsin-EDTA (TE)는 Gibco BRL (Gaithersburg, MD, USA)에서 구매하여 사용하였고 FACS 분석용 항체는 R-phycoerythrin (PE) anti-mouse CD11b (aM, rat IgG2b)과 FITC anti-mouse Gr-1 (RB6-8C5, rat IgG2b)는 Biosciences (Becton, Dickinson and Co., Franklin Lakes, NJ, USA)에서 구매하였고, Mip-2 (DY452-05)와 Cxcl-1 (DY453-05)는 R&D system (Minneapolis, MN, USA)에서 구매하여 사용하였다.
- 우리가 사용한 배암차즈기 (Salvia plebeia R. Br.)는 추출물 및 유효성분 분석을 위해 2014 또는 2015년 4월에 수확해서 지상부를 세척 및 건조한 시료를 부안동진농장 (전라북도 부안군 동진면 지비길 38-1)으로부터 구입하여 지상부 500 g을고루 섞은 후 3 차 증류수에 희석하여 제조한 30% 주정 (식품추출원료 사용 시 안전성검사를 하지 않아도 되는 추출법) 10 ℓ이용해서 80℃에서 2.5 시간동안 열탕 추출하였다. 여액을 모은 후 잔사는 동일한 방법으로 재추출하여 그 여액을 합하여 45℃에서 배암차즈기 추출물이 건조될 때까지 감압 농축하였다.
- , Franklin Lakes, NJ, USA)를 사용하여 세포를 분석하였고, 분석한 세포 수와 백분율을 이용해 총 세포 수를 구하였다. 유세포 분석을 위한 antibody는 BD Pharmingen (Becton, Dickinson and Co., Franklin Lakes, NJ, USA)에서 구입하였다.
- 제조된 석탄연소물은 KT&G 중앙연구원에서 공급하였고, 플라이애쉬 (fly ash)는 일본 JIS type-II fly ash (Yoshitaka, 2007)를 제공받아 사용하였으며, 각각을 디젤연소분진 (DEP) (Lim and Kim, 2009)과 혼합하여 미세먼지 혼합물을 제조하였다.
데이터처리
- 실험 집단 간 수치 데이터는 각 실험군 결과값 mean ± standard error (SEM)로 나타내었으며, 동물실험에서는 SPSS 11.0 software (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하여 일원배치 분산분석 (One-way analysis of variance, ANOVA) 후에 Duncan’s Multiple Comparison Tests (DMRT)로 유의성을 검증하였고, 세포실험에서는 독립표본 T-검정 (independent samples t-test)을 이용하여 유의성을 검증하였다.
이론/모형
- 단백질의 생성정도를 측정하기 위해 ELISA를 이용하여 분석하였다. IL-17A (M17AFO), TNF-α (MTA00B), Mip-2 (MM200), 그리고 Cxcl-1 (MKC00B) 단백질량을 BAL fluid에서 ELISA kit (R&D system, Minneapolis, MN, USA)를사용하여 제조사의 지시에 따라 시행하였다.
성능/효과
- 그 결과 미세먼지를 주입한 대조군의 BAL과 폐에서 CD11b+/ Gr-1+ 면역 세포 수가 유의성 있게 증가함을 확인하였다.
- BALF에서 미세먼지에 의해 증가되었던 ROS의 생성 수준이 배암차즈기 추출물에 의해 감소되는 것을 확인하였고 또한 폐 조직에서 기관지의 면역 반응을 높이는 케모카인과 염증 사이토카인 (IL- 17A, TNF-α, Mip-2, Cxcl-1)의 유전자 발현 수준을 보았을때 배암차즈기 추출물의 경구 투여에 의한 회복효과가 큰 것으로 보인다.
- 2A). In vitro에서 미세먼지(APM)에 의한 MH-S 세포주의 산화적 스트레스 (oxidative stress) 유도는 DCF-DA staining법으로 측정한 ROS의 생산량이 극대화되는 미세먼지 농도를 관찰하였고, 그 결과 50 ㎍/㎖ 처리농도에서 25 ㎍/㎖ 이하 처리농도 보다도 2 배 이상 ROS 생산량이 증가되는 것을 관찰하였다 (Fig. 2B와 2C). 즉, 미세먼지 처리에 의한 세포생존율은 농도 의존적으로 감소하였으며 100, 200 ㎍/㎖ 의 농도에서는 95% 이상의 감소 수준을 보였다.
- 그러나 배암차즈기 투여군에서 투여한 배암차즈기의 농도 의존적으로 IL-17A, TNF-α, Mip-2, 그리고 Cxcl-1의 생산량이 감소함을 확인하였다.
- 또한 양성대조군인 montelukast을 투여한 그룹의 BAL fluid에서도 미세먼지에 의해 증가된 ROS 생성량을 감소시킴을 확인하였다. 따라서 배암차즈기 추출물이 미세먼지에 의해 유도된 호흡기 질환에서 미세먼지에 의해 증가된 염증 수준을 회복시킴을 알 수 있었다 (Fig. 5).
- 또한 BAL fluid에서 ELISA를 통해 염증유발인자 IL-17A, TNF-α, Mip-2, 그리고 Cxcl-1의 생산량을 측정한 결과 대조군의 BAL fluid에서 IL-17A, TNF-α, Mip-2, 그리고 Cxcl-1의 생산량이 모두 통계학적 유의성 있게 증가하였다.
- 마우스의 BAL 세포와 폐 세포의 총 세포 수를 관찰한 결과 미세먼지에 의해 유도된 호흡기 질환 마우스 그룹에서 BAL 및 폐의 전체 세포 수가 증가하였으며, 증가된 BAL 및 폐의 전체 세포 수가 배암차즈기 추출물을 경구 투여한 마우스 그룹에서 농도별로 감소됨을 확인 할 수 있었다. 또한 BAL 세포에서 호중구 수를 확인하기 위해 Diff-Quik 염색을 한 결과, 미세먼지에 의해 유도된 호흡기 질환 마우스 그룹에서 호중구의 수가 증가하였으며, 이는 폐의 염증 수치가 증가함을 의미한다. 미세먼지에 의해 증가된 호중구의 수가 배암 차즈기 추출물을 경구 투여한 그룹에서 감소됨을 확인하였으며 따라서 미세먼지에 의해 유도된 호흡기 질환에서 배암차즈기 추출물이 주요 염증 세포인 호중구 수의 감소를 통해 폐의 염증 반응을 감소시킬 수 있음을 알 수 있었다 (Fig.
- 미세먼지에 의해 유도된 호흡기 질환 마우스 모델의 기관지 폐포세척액에서 ROS 생성량을 관찰하기 위해, DCF-DA로 염색한 BAL fluid를 유세포 분석기를 이용하여 분석한 결과, 미세먼지에 의해 유도된 호흡기 질환 마우스 그룹의 BAL fluid 에서 ROS의 생성량이 증가됨을 확인하였으며, 증가된 ROS의생성량은 100, 200, 400 ㎎/㎏의 농도에서 배암차즈기 추출물의 경구 투여에 의해 농도 의존적으로 감소됨을 확인하였다. 또한 양성대조군인 montelukast을 투여한 그룹의 BAL fluid에서도 미세먼지에 의해 증가된 ROS 생성량을 감소시킴을 확인하였다. 따라서 배암차즈기 추출물이 미세먼지에 의해 유도된 호흡기 질환에서 미세먼지에 의해 증가된 염증 수준을 회복시킴을 알 수 있었다 (Fig.
- 3B). 또한 염증 사이토카인으로 알려진 IL-4, IL-15, IL-17A와함께 호중구에서 분비되는 IL-10 (Tosello et al., 2012)의 유전자 발현 변화를 확인한 결과, 미세먼지에 의해 염증 사이토 카인들의 발현이 증가됨을 확인할 수 있었으며, 배암차즈기 추출물의 농도별 처리에 의해 염증 사이토카인들의 발현이 유의적으로 감소됨을 관찰 할 수 있었다 (Fig. 3C).
- 또한 염증반응에 대항하여 기관지의 면역반응을 높이는 염증성 사이토카인 IL-15, TNF-α, IL-4의 유전자 발현이 미세먼지에 의해 유도된 대조군에서 증가함을 확인하였으며, 증가된 사이토 카인 발현은 배암차즈기 투여군에서 농도 의존적으로 회복하는 경향을 관찰 할 수 있었다 (Fig. 8).
- 마우스의 BAL 세포와 폐 세포의 총 세포 수를 관찰한 결과 미세먼지에 의해 유도된 호흡기 질환 마우스 그룹에서 BAL 및 폐의 전체 세포 수가 증가하였으며, 증가된 BAL 및 폐의 전체 세포 수가 배암차즈기 추출물을 경구 투여한 마우스 그룹에서 농도별로 감소됨을 확인 할 수 있었다. 또한 BAL 세포에서 호중구 수를 확인하기 위해 Diff-Quik 염색을 한 결과, 미세먼지에 의해 유도된 호흡기 질환 마우스 그룹에서 호중구의 수가 증가하였으며, 이는 폐의 염증 수치가 증가함을 의미한다.
- 폐의 대식세포인 MH-S 세포주을 통하여 배암차즈기 추출물의 항염증 효능을 분석하고 in vitro 실험의 적정 투여량을 설정하기 위하여 우선 미세먼지의 처리 농도를 결정하였다. 미세먼지 (APM)를 농도별 (25, 50, 100, 200 ㎍/㎖) 로 처리한후 MTS assay를 통해 세포생존율을 관찰한 결과, 미세먼지 100, 200 ㎍/㎖ 처리농도에서는 세포독성에 의해 거의 모든 세포가 death되었고 50 ㎍/㎖ 처리농도 이하에서 50% 이상 세포생존율이 관찰되었다 (Fig. 2A). In vitro에서 미세먼지(APM)에 의한 MH-S 세포주의 산화적 스트레스 (oxidative stress) 유도는 DCF-DA staining법으로 측정한 ROS의 생산량이 극대화되는 미세먼지 농도를 관찰하였고, 그 결과 50 ㎍/㎖ 처리농도에서 25 ㎍/㎖ 이하 처리농도 보다도 2 배 이상 ROS 생산량이 증가되는 것을 관찰하였다 (Fig.
- 미세먼지에 의해 유도된 호흡기 질환 마우스 모델의 기관지 폐포세척액에서 ROS 생성량을 관찰하기 위해, DCF-DA로 염색한 BAL fluid를 유세포 분석기를 이용하여 분석한 결과, 미세먼지에 의해 유도된 호흡기 질환 마우스 그룹의 BAL fluid 에서 ROS의 생성량이 증가됨을 확인하였으며, 증가된 ROS의생성량은 100, 200, 400 ㎎/㎏의 농도에서 배암차즈기 추출물의 경구 투여에 의해 농도 의존적으로 감소됨을 확인하였다. 또한 양성대조군인 montelukast을 투여한 그룹의 BAL fluid에서도 미세먼지에 의해 증가된 ROS 생성량을 감소시킴을 확인하였다.
- H&E 염색법을 통하여 폐조직의 단면을 검사함으로써 호흡기 염증 증상을 확인하고 M-T 염색법을통하여 교원 섬유의 양을 측정하였다. 미세먼지에 의해 유도된 호흡기 질환 마우스 모델의 폐 세포 조직을 관찰한 결과폐 세포의 벽이 두꺼워지는 것을 확인하였으며, 교원 섬유가 증가함을 확인하였다. 이러한 염증 증상은 배암차즈기 추출물을 경구 투여한 마우스 그룹에서 폐 세포의 벽 및 교원 섬유가 정상군 수준으로 회복되는 것을 관찰할 수 있었다 (Fig.
- 또한 BAL 세포에서 호중구 수를 확인하기 위해 Diff-Quik 염색을 한 결과, 미세먼지에 의해 유도된 호흡기 질환 마우스 그룹에서 호중구의 수가 증가하였으며, 이는 폐의 염증 수치가 증가함을 의미한다. 미세먼지에 의해 증가된 호중구의 수가 배암 차즈기 추출물을 경구 투여한 그룹에서 감소됨을 확인하였으며 따라서 미세먼지에 의해 유도된 호흡기 질환에서 배암차즈기 추출물이 주요 염증 세포인 호중구 수의 감소를 통해 폐의 염증 반응을 감소시킬 수 있음을 알 수 있었다 (Fig. 6).
- 배암차즈기 추출물의 적절한 처리 농도를 관찰하기 위하여 MTS assay를 통해 세포의 증식에 영향을 끼치는지 관찰한 결과 배암차즈기 추출물을 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖ 의 농도로 처리하였을 때 MH-S 세포의 세포 증식능력이 증가함을 확인할 수 있었고, 400 ㎍/㎖ 의 처리농도에 서는 세포독성이 관찰되었다 (Fig. 3A). 이를 토대로, 50 ㎍/㎖ 의 미세먼지를 처리한 MH-S 세포에 배암차즈기 추출물 50 ㎍/㎖ 의 농도로 처리한 결과, 미세먼지에 의해 증가된 ROS의 생성량이 감소되는 것을 관찰할 수 있었다 (Fig.
- 배암차즈기 투여군의 BAL과 폐에서는 배암차즈기 추출물의 농도별 투여에 따라 CD11b+/Gr-1+ 면역 세포 수가 유의성 있는 수준으로 감소함을 확인하였다. 또한 BAL fluid에서 ELISA를 통해 염증유발인자 IL-17A, TNF-α, Mip-2, 그리고 Cxcl-1의 생산량을 측정한 결과 대조군의 BAL fluid에서 IL-17A, TNF-α, Mip-2, 그리고 Cxcl-1의 생산량이 모두 통계학적 유의성 있게 증가하였다.
- 본 연구에서 이용한 배암차즈기(Salvia plebeia R. Br.) 추출물의 지표성분 분석을 위해 표준품과 함께 배암차즈기 추출물을 HPLC로 분석한 결과, 배암차즈기 추출물에서 rosmarinic acid (69.86 ㎎/g), luteolin (1.72 ㎎/g), nepetin (8.26 ㎎/g), hispidulin (7.56 ㎎/g)의 성분함량을 확인할 수 있었다 (Fig. 1).
- 이러한 효능을 토대로 동물모델에 대기오염물질을 INT injection을 시켜 호흡기 손상 모델을 만들고 배암차즈기 추출물을 경구투여하여 염증 억제 효과를 살펴보았다. 실험결과 미세먼지의 유도에 의해 폐포의 벽이 두꺼워지고 교원 섬유의 양이 증가했으며 이러한 증가된 염증 반응을 배암차즈기 추출물이 다시 정상군 수준으로 회복시키는 것을 확인하였다. 염증세포 중 미세먼지에 의해 기관지폐포 세척액으로 infiltration 되었던 과립구들이 배암차즈기 추출물의 투여에 의해 억제 되는 것을 확인하였다.
- 실험결과 미세먼지의 유도에 의해 폐포의 벽이 두꺼워지고 교원 섬유의 양이 증가했으며 이러한 증가된 염증 반응을 배암차즈기 추출물이 다시 정상군 수준으로 회복시키는 것을 확인하였다. 염증세포 중 미세먼지에 의해 기관지폐포 세척액으로 infiltration 되었던 과립구들이 배암차즈기 추출물의 투여에 의해 억제 되는 것을 확인하였다. BALF에서 미세먼지에 의해 증가되었던 ROS의 생성 수준이 배암차즈기 추출물에 의해 감소되는 것을 확인하였고 또한 폐 조직에서 기관지의 면역 반응을 높이는 케모카인과 염증 사이토카인 (IL- 17A, TNF-α, Mip-2, Cxcl-1)의 유전자 발현 수준을 보았을때 배암차즈기 추출물의 경구 투여에 의한 회복효과가 큰 것으로 보인다.
- 미세먼지에 의해 유도된 호흡기 질환 마우스 모델의 폐 세포 조직을 관찰한 결과폐 세포의 벽이 두꺼워지는 것을 확인하였으며, 교원 섬유가 증가함을 확인하였다. 이러한 염증 증상은 배암차즈기 추출물을 경구 투여한 마우스 그룹에서 폐 세포의 벽 및 교원 섬유가 정상군 수준으로 회복되는 것을 관찰할 수 있었다 (Fig. 4).
- 3A). 이를 토대로, 50 ㎍/㎖ 의 미세먼지를 처리한 MH-S 세포에 배암차즈기 추출물 50 ㎍/㎖ 의 농도로 처리한 결과, 미세먼지에 의해 증가된 ROS의 생성량이 감소되는 것을 관찰할 수 있었다 (Fig. 3B). 또한 염증 사이토카인으로 알려진 IL-4, IL-15, IL-17A와함께 호중구에서 분비되는 IL-10 (Tosello et al.
- CC 케모카인 수용체 Ccr9과 Ccr3, 케모카인 ligand인 Ccl5는 기도의 염증에 반응하여 과립구의 염증을 증가시키고 기관지의 면역반응을 높이는 것으로 알려져 있다. 이에 미세먼지에 의해 유도된 호흡기 질환 마우스 모델의 폐 조직에서 염증 관련 케모카인 수용체와 케모카인 ligand의 유전자 발현을 측정한 결과, 미세머지에 의해 이들 염증유발인자들의 발현이 증가하였으며 배암차즈기 추출물 투여에 의해 감소하였다. 또한 염증반응에 대항하여 기관지의 면역반응을 높이는 염증성 사이토카인 IL-15, TNF-α, IL-4의 유전자 발현이 미세먼지에 의해 유도된 대조군에서 증가함을 확인하였으며, 증가된 사이토 카인 발현은 배암차즈기 투여군에서 농도 의존적으로 회복하는 경향을 관찰 할 수 있었다 (Fig.
- 종합하여 볼 때, 미세먼지에 의해 염증반응이 유도된 모델에서 배암차즈기 추출물이 시중에 있는 약제와 비슷한 회복효과를 보였고, 또한 염증 사이토카인과 케모카인의 회복을 관찰 할 수 있었다. 이는 미세먼지에 의해 유도된 염증을 배암차즈기 천연물질에 의해 회복되는 것으로 보인다.
- 2B와 2C). 즉, 미세먼지 처리에 의한 세포생존율은 농도 의존적으로 감소하였으며 100, 200 ㎍/㎖ 의 농도에서는 95% 이상의 감소 수준을 보였다. 그러므로 약 50%의 세포생존율을 보이면서 ROS 생산량이 가장 높은 50 ㎍/㎖의 농도를 다음 실험을 위한 미세먼지의 처리 농도 값으로 선정하였다.
- montelukast를 포함한 기존 허가 의약품들에 대하여 외국기술에 높은 의존도 및 그에 따른 부작용 등이 우려되므로, 목적에 맞는 배암차즈기 추출물 같은 천연물질이 효과를 보이는 것은 안전성 등 부작용을 크게 줄일 수 있기 때문에 큰 기대를 얻을 수 있을 것으로 생각된다. 추가적으로 배암차즈기 추출물 내에서 지표성분 분석을 통하여 rosmarinic acid, luteolin, nepetin, hispidulin이 함유되어 있음을 확인하였다. 배암차즈기 추출물의 구성성분으로 알려진 이들 화합물은앞서 in vitro 연구 결과에서 염증유발인자인 nitric oxide와 prostaglandin E2 및 leukotriene의 발현 억제 활성을 통해 탁월한 항염증 효과를 보임으로써 (Akram et al.
- 호흡기관의 대식세포 세포주인 MH-S 세포에서 미세먼지로 자극을 시켜 배암차즈기(Salvia plebeia R. Br.) 추출물의 효과를 보았을 때, 염증을 일으키는 매개체 중 하나인 ROS의 생성량을 줄였고 염증 사이토카인의 발현을 정상군의 수준으로 회복하는 것을 볼 수 있었다. 이러한 효능을 토대로 동물모델에 대기오염물질을 INT injection을 시켜 호흡기 손상 모델을 만들고 배암차즈기 추출물을 경구투여하여 염증 억제 효과를 살펴보았다.
후속연구
- 이는 미세먼지에 의해 유도된 염증을 배암차즈기 천연물질에 의해 회복되는 것으로 보인다. 따라서 배암차즈기 추출물이 호흡기의 염증을 개선하고 호흡기 관련 질병의 치료에 도움을 줄 수 있을 것으로 보인다.
- 추가적으로 배암차즈기 추출물 내에서 지표성분 분석을 통하여 rosmarinic acid, luteolin, nepetin, hispidulin이 함유되어 있음을 확인하였다. 배암차즈기 추출물의 구성성분으로 알려진 이들 화합물은앞서 in vitro 연구 결과에서 염증유발인자인 nitric oxide와 prostaglandin E2 및 leukotriene의 발현 억제 활성을 통해 탁월한 항염증 효과를 보임으로써 (Akram et al., 2015; Shin et al., 2016), 본 연구에서 항염 효과를 나타내는 배암차즈기추출물의 표준화를 위한 지표성분 및 항염 효과를 유도하는 주요 유효성분으로 사용할 수 있을 것으로 사료된다.
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