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문제 정의
- 특히 대장균군이 검줄되는 지하수의 경우 그 오염원을 구체적으로 확인하는 것이 효율적인 지하수 관리를 위해서도 매우 필요하다. 따라서 본 연구에서는 생활용수 및 음용수로 이용되는 영남지역의 지하수에서 대장균군의 분포 및 이에 영향을 주는 환경요인을 살펴보고, 지하수로부터 대장균군 세균을 분리하여 그 특성을 알아보고자 하였다.
- 본 연구에서는 배양에 기초한 방법으로 지하수에서 일반 세균과 대장균군의 분포를 조사하고 대장균군 세균을 동정하였다. 지하수에서 전체 세균의 농도 수준을 파악하고자 형광염색을 통한 총 세균수 측정을 행하였으나, 시료에 존재하는 무기성 입자 물질로 인해 유효한 결과를 얻지 못하였다.
제안 방법
- 계대배양하여 순수분리하였다. EMB 한천배지에서 금속성 광택을 보이는 세균은 API 20E kit (bioMerieux, France)를 사용하여 잠정적으로 동정하였으며, 동정확률(% id)이 90% 이상인 균종을 선택하였고, 90% 미만일 경우 동정하지 못한 것(unidentified)으로 간주하였다.
- 대장균군 추정시험의 경우 보통 24시간 배양 후 판정하는 것으로 되어 있으나(9-11), 본 연구에서는 48시간까지 배양 시간을 연장하여 금속성 광택을 띠는 집락을 계수하였다. 24시간 배양 후 대장균군 추정시험 양성을 나타낸 지점은 여름 49개 지점(40 %), 겨울 23개 지점(20%)이었다.
- 대장균군에 대한 추정시험에서 금속성 광택을 나타내는 모든 집락을 대상으로, 1개 지점에서 최대 5개 집락까지 임의로 선정하여 EMB 한천배지(12)에 최초 접종하였으며, 이를 동일 배지에 계대배양하여 순수분리하였다. EMB 한천배지에서 금속성 광택을 보이는 세균은 API 20E kit (bioMerieux, France)를 사용하여 잠정적으로 동정하였으며, 동정확률(% id)이 90% 이상인 균종을 선택하였고, 90% 미만일 경우 동정하지 못한 것(unidentified)으로 간주하였다.
- 일반세균(종속영양평판계수)은 채수한 시료를 표준한천배지 (plate count agar)에 도말평판법으로 접종하여 35℃에서 48시간 배양한 후 계수하였다(6, 8). 대장균군의 수는 막여과법(추정시험)으로 측정하였으며, 지하수 시료 50 ml을 여과하여 m-Endo LES 한천배지에 접종한 다음, 35℃에서 48시간 배양하여 금속성 광택을 띠는 붉은 색 집락을 계수하였다(9, 11).
- 질산성 질소와 암모니아성 질소의 농도 사이에는 유의성이 있는 상관관계가 없었다(Table 3). 미생물 분포와의 상관성을 살펴보기 위해 인산염 인(PQj-P)과 COD/도 측정하였다. 인산염인 (PQj-P)과 COD/의 농도는, 조사지점 전체 평균이 각각 0.
- 행정구역(시, 군, 구)별로 1-4개 지점을 선정하였으며, 임의의 수도꼭지나 펌프 출구로부터 10분 이상 지하수를 흘려보낸 후, 물리·화학적 분석과 미생물 수 측정을 위한 시료의. 보관 용기를 서로 달리하여 채수하였다. 비가 오는 날은 채수를 하지 않았으며, 채수한 지하수 시료는 4℃의 냉장상태를 유지하면서 실험실로 운반하였다.
- 수온과 pH는 각각 온도계와 pH metei를 사용하여 채수 현장에서 측정하였다. 질산성 질소(NO3-N), 암모니아성 질소(NH4+- N), 인산염 인 (POf-P), 화학적 산소요구량(COD) 등의 항목은 여름에 채수한 시료를 대상으로 채수 후 48시간 이내에 측정하였다.
- 분리한 이들 세균은 모두 EMB 한천배지에서 금속성 광택을 띠는 것으로, 여름 57개 집락은 26개 서로 다른 조사지점의 지하수로부터 유래하였으며, 겨울 25개 집락은 14개 조사지점으로부터 유래하였다(Table 4). 이들 집락을 대상으로, API 20E kit를 이용하여 생리적, 생화학적 특징에 따른 동정시험을 행하였으며, 이 중 여름 31개 집락(6속 11종)과 겨울 15개 집락(5속 6종)을 .잠정적으로 동정할 수 있었다(Table 4).
- 지하수의 미생물 수 측정을 위한 접종은 채수 후 24시간 이내에 실험실에서 행하는 것을 원칙으로 하였고, 실제적으로 24시간 이내에 실험실로 가져올 수 없는 일부 조사지점의 경우에는 48 시간 이내에 접종하였다. 일반세균(종속영양평판계수)은 채수한 시료를 표준한천배지 (plate count agar)에 도말평판법으로 접종하여 35℃에서 48시간 배양한 후 계수하였다(6, 8).
- 측정하였다. 질산성 질소(NO3-N), 암모니아성 질소(NH4+- N), 인산염 인 (POf-P), 화학적 산소요구량(COD) 등의 항목은 여름에 채수한 시료를 대상으로 채수 후 48시간 이내에 측정하였다. 모든 측정항목은 환경부 먹는물수질공정시험방법과 수질오염 공정시험 방법, 그리고 American public health association의 Standard methods에 의거하여 분석하였다(9-11).
대상 데이터
- 영남지역(경남, 경북, 대구, 부산, 울산)에 위치한 생활용수 및 음용수로 사용하고 있는 지하관정을 대상으로, 여름(2003년 7-8 월)에 123개 지점, 겨울(2003년 12월-2004년 1월)에 117개 지점에서 지하수 시료를 채수하였다(Table 1). 행정구역(시, 군, 구)별로 1-4개 지점을 선정하였으며, 임의의 수도꼭지나 펌프 출구로부터 10분 이상 지하수를 흘려보낸 후, 물리·화학적 분석과 미생물 수 측정을 위한 시료의.
- 추정시험에서 대장균군 양성으로 확인된 290개 집락을 EMB 한천배지에 최초 접종하였으며, 금속성 광택을 띠는 82개(28%)의 집락만을 분리하여 동정시험을 행할 수 있었다. 분리하지 못한 대부분의 집락은 EMB 한천배지에서 충분한 성장을 하지 않았으며, 일부 집락의 경우 EMB 한천배지에서 금속성 광택을 보이지 않아 계대하여 배양하지 않았다.
- 지하수 시료를 채수하였다(Table 1). 행정구역(시, 군, 구)별로 1-4개 지점을 선정하였으며, 임의의 수도꼭지나 펌프 출구로부터 10분 이상 지하수를 흘려보낸 후, 물리·화학적 분석과 미생물 수 측정을 위한 시료의. 보관 용기를 서로 달리하여 채수하였다.
데이터처리
- 지하수 시료에서 물리·화학적 환경요인과 미생물 분포 사이의 상호 관계를 파악하기 위해 Windows용 SPSS v.10.0을 사용하여 Spearman의 순위상관계수(r吗)를 구하였다.
이론/모형
- 질산성 질소(NO3-N), 암모니아성 질소(NH4+- N), 인산염 인 (POf-P), 화학적 산소요구량(COD) 등의 항목은 여름에 채수한 시료를 대상으로 채수 후 48시간 이내에 측정하였다. 모든 측정항목은 환경부 먹는물수질공정시험방법과 수질오염 공정시험 방법, 그리고 American public health association의 Standard methods에 의거하여 분석하였다(9-11).
- 이내에 접종하였다. 일반세균(종속영양평판계수)은 채수한 시료를 표준한천배지 (plate count agar)에 도말평판법으로 접종하여 35℃에서 48시간 배양한 후 계수하였다(6, 8). 대장균군의 수는 막여과법(추정시험)으로 측정하였으며, 지하수 시료 50 ml을 여과하여 m-Endo LES 한천배지에 접종한 다음, 35℃에서 48시간 배양하여 금속성 광택을 띠는 붉은 색 집락을 계수하였다(9, 11).
성능/효과
- 가 각각 1 개였다(Table 4). Enterobacter 속의 경우, 종별로는 E. cloacae 10개, E. amnigenus 9개, E. sakazakii 1개의 분포를 보였다. Klebsiella 속은 K.
- sakazakii 1개의 분포를 보였다. Klebsiella 속은 K. terrigena 2개, K. pneumoniae 1개였고, Serratia 속은 S. liquefaciens 2개, S. ficaria 1개였으며, Citrobacter 속은 C. freundii와 C. youngae가 각 1개씩이 었다 (Table 4). 겨울 25개 중 동정한 15개 집락의 경우, Klebsiella pneumoniaee\ 8개로 가장 많았고, Citrobacter 속의 C.
- youngae가 각 1개씩이 었다 (Table 4). 겨울 25개 중 동정한 15개 집락의 경우, Klebsiella pneumoniaee\ 8개로 가장 많았고, Citrobacter 속의 C. youngae 와 C. braakiie] 각각 2개와 1개, Enterobacter aerogenes 2개, 그리고 Rahnella aquatilis와 Serratia rubidaeae가 각각 1개씩이었다(Table 4). 여름과 겨울을 합쳐 모두 7속 15종의 대장균군 세균을 확인할 수 있었다.
- 대장균군 추정시험 결과 양성으로 나타난 여름 199개, 겨울 91개 집락을 EMB 한천배지에 최초 접종하였으며, 동일한 배지에 연속으로 계대하여 여름 57개(29%), 겨울 25개(27%)의 순수배양을 얻을 수 있었다. 분리한 이들 세균은 모두 EMB 한천배지에서 금속성 광택을 띠는 것으로, 여름 57개 집락은 26개 서로 다른 조사지점의 지하수로부터 유래하였으며, 겨울 25개 집락은 14개 조사지점으로부터 유래하였다(Table 4).
- 대장균군에 대한 추정시험 결과를 살펴보면, 여름에는 123개 조사지점 중 57개 지점(46%)에서 1개 이상의 대장균군 집락이 검출되었고, 겨울에는 117개 조사지점 중 39개 지점(33%)에서 대장균군 집락이 검출되어 여름의 검출지점.수가 더 많았다(Fig.
- 확인할 수 있었다. 동정한 세균을 속별로 살펴보면, Enterobacter 속이 48%를 차지하여 가장 많았고, 다음으로 Klebsiella 속 26%, Citrobacter 속 11%, Serratia 속 9%, 그리고 Escherichia 속, Pantoea 속, Rahnella 속이 각각 2%였다. 종별로는 E.
- 잠정적으로 동정할 수 있었다(Table 4). 동정한 여름 31개 대장균군 세균 집락은 123개 조사지점의 15%인 19개 지점으로부터 유래하였고, 겨울 15개 집락은 117개 조사지점의 9%인 10개 지점으로부터 유래하였으며, 이 중 2개 지점으로부터는 여름과 겨울 모두 대장균군 세균을 분리하여 동정할 수 있었다.
- 05)를 나타내었다(Table 2, Table 3). 또한 인산염 인은 질산성 질소와, C* OD 은 pH와도 약한 양의 상관관계(P<0.05)가 있었다. C* OD 의 경우 군에 위치한 조사지점에서의 평균과 중앙값이 각각 0.
- fonticola 6% 등의 순서로 많았다(20). 본 연구에서 분원성 오염의 가장 직접적인 증거가 될 수 있는 E. coli는 동정한 대장균군 세균의 2% 였고, 1개 조사지점에서만 분리되었다. 미국 Wisconsin 주에서의 조사에서도 대장균군은 지하수 50개소 중 14개소에서 검출된 반면, E.
- 본 연구의 전체 조사지점을 도시와 농(어)촌으로 나누는 것은 쉽지 않으며, 관정이 위치한 주소지에 따라 시(혹은 구)와 군으로 구분하여 살펴보면, 질산성 질소, COD/의 농도, 일반 세균 등의 항목에서 군지역의 평균과 중앙값이 시(혹은 구)보다 높았다. 질산성 질소의 경우 여름 123개 조사지점 중 5개 지점(4%) 은 국내 먹는물 수질기준의 기준치보다 높은 농도를 보였다.
- 여름 57개 증 동정한 31개 집락을 살펴보면, Enterobacter 속이 20개로 가장 많아 동정한 집락의 65%를 차지하였고, Klebsiella 속이 4개(13%), Serratia 속이 3개(10%), Citrobacter 속이 2개(6%), 그리고 Escherichia cdi와 Pantoea spp.가 각각 1 개였다(Table 4).
- 여름과 겨울을 합쳐 모두 7속 15종의 대장균군 세균을 확인할 수 있었다. 여름 57개 집락 중 46%인 26개 집락과 겨울 25개 집락 중 40%인 10개 집락은 동정확률(% id)이 90% 미만이어서 사용한 kit로 확인되지 않았다(Table 4).
- 한편, 시(혹은 구)에 위치한 조사지점에서 일반세균 수의 중앙값은 여름 28 CFU/ml, 겨울 35 CFU/ml, 군에 위치한 조사지점에서의 중앙값은 여름 40 CFU/ml, 겨울 70 CFU/ml로 나타나, 여름과 겨울 모두 시(혹은 구)보다 군에 위치한 지점에서 더 높은 중앙값을 보였다(자료 미제시). 여름과 겨울에 측정한 일반세균 수 사이에는 유의성이 있는 상관관계가 없었으며, 여름의 경우 지하수의 일반세균 수는 수온과 양의 상관관계(P<0.01)를 나타내었다(Table 3).
- braakiie] 각각 2개와 1개, Enterobacter aerogenes 2개, 그리고 Rahnella aquatilis와 Serratia rubidaeae가 각각 1개씩이었다(Table 4). 여름과 겨울을 합쳐 모두 7속 15종의 대장균군 세균을 확인할 수 있었다. 여름 57개 집락 중 46%인 26개 집락과 겨울 25개 집락 중 40%인 10개 집락은 동정확률(% id)이 90% 미만이어서 사용한 kit로 확인되지 않았다(Table 4).
- 영남지역의 지하수로부터 모두 7속 15종의 대장균군 세균을 분리하여 확인할 수 있었다. 동정한 세균을 속별로 살펴보면, Enterobacter 속이 48%를 차지하여 가장 많았고, 다음으로 Klebsiella 속 26%, Citrobacter 속 11%, Serratia 속 9%, 그리고 Escherichia 속, Pantoea 속, Rahnella 속이 각각 2%였다.
- 여름 8개 지점과 겨울 16개 지점의 경우 24시간 배양 후에는 대장균군 추정시험 양성의 집락이 나타나지 않았으나 48시간 배양에서 관찰되었다. 이들 지점에서 분리한 대장균군 세균은 여름 E. amnigenus, 겨울 E. aerogenes와 K. pneumoniae로 확인되었다. 한편 미생물 시험용 시료는 채수 후 즉시 시험하여야 하고, 불가능할 경우 일반 세균은 24시간, 대장균군은 30시간 이내에 시험하여야 하지만(9), 채수 당일 실험실로 가져올 수 없었던 일부 조사지점의 지하수는 채수 후 24/8시간에 미생물 수 측정을 위한 접종을 하였다.
- 미생물 분포와의 상관성을 살펴보기 위해 인산염 인(PQj-P)과 COD/도 측정하였다. 인산염인 (PQj-P)과 COD/의 농도는, 조사지점 전체 평균이 각각 0.06 mg/L과 0.42 mg/L이 었고, 최대 값이 2.06 mg/L과 2.70 mg/L 이었으며, 서로 약한 양의 상관관계(P<0.05)를 나타내었다(Table 2, Table 3). 또한 인산염 인은 질산성 질소와, C* OD 은 pH와도 약한 양의 상관관계(P<0.
- 전체 조사지점 중 여름 46%, 겨울 33%의 지하수는 대장균군 추정시험 결과 양성으로 판정되었으며, 여름 15%, 겨울 9%의 지하수로부터 대장균군 세균을 분리하여 확인할 수 있었다. 또한 여름 12%, 겨울 18%의 조사지점에서는, .
- 5℃로 여름이 겨울보다 높았으며, 광역 행정구역에 따른 지하수의 수온 차이는 미미하였다. 조사지점 전체 지하수의 pH 평균과 최대값은 여름이 각각 7.0과 8.5, 겨울이 6.9와 19였고, 계절 및 행정구역에 따른 뚜렷한 차이는 없었다. 질산성 질소(NO3--N)의 조사지점 전체 평균과 중앙값은 각각 3.
- 1). 조사지점 전체의 중앙값은 여름 30 CFU/ml, 겨울 40 CFU/m로 겨울이 여름보다 높았으며, 행정구역별 중앙값의 경우 여름은 경남 45 CFU/ml, 경북 30 CFU/ml, 울산 18 CFU/ml, 부산 15 CFU/ml, 대구 13 CFU/ml의 순으로 높았고, 겨울은 경북 70 CFU/ml, 부산 35 CFU/ml, 경남 27.5 CFU/ml, 대구 23 CFU/ml, 울산 18 CFU/ml의 순서였다(Fig. 1). 조사지점 전체의 삼사분위값(3rd quartile)은 여름 105 CFU/ml, 겨울 300 CFU/ml로 나타나 적어도 조사지점의 25% 이상에서 먹는물 수질기준인 100 CFU/ml을 초과하였다.
- 동정한 세균을 속별로 살펴보면, Enterobacter 속이 48%를 차지하여 가장 많았고, 다음으로 Klebsiella 속 26%, Citrobacter 속 11%, Serratia 속 9%, 그리고 Escherichia 속, Pantoea 속, Rahnella 속이 각각 2%였다. 종별로는 E. cloacae 22%, E. a/migems와 K. pneumoniae7\ 각각 20%, C. yoimgae와 K. terrigena가 각각 7%, E. aerogenesef S. liquefaciens가 각각 4%, 그리고 C. braakii, C. freundii, E. coli, E. sakazakii, R. aquatilis, S. ficaria, S. rubidaea 등이 2%를 차지하였다. 외국의 예를 보면, 미국 Oregon주 시골지역의 78개 지하수에 서는 C.
- iquefaciens 1% 등의 순서였다(24). 지표수의 경우, 정수 처리한 음용수에서는 E. agglomerans 33%, K. pneumoniae 27%, E. aerogenes 24%, E. cloacae, 7%, K. oxytoca 5%, C. freundii 4% 등의 빈도로 확인되었고(26), 원수에서는 K. pneumoniae 24%, E. cloacae 19%, K. oxytoca 13%, E. agglomerans 10%, C. freundii 9%, E. coli 6%, S. fonticola 6% 등의 순서로 많았다(20). 본 연구에서 분원성 오염의 가장 직접적인 증거가 될 수 있는 E.
- 여름 123개 조사지점 중 15개 지점 (12%)과 겨울 117개 조사지점 중 21개 지점(18%)에서는 대장균군은 검출되지 않았으나 일반세균 수는 먹는물 수질기준인 100 CFU/ml을 초과하였다. 지하수의 대장균군 수는 일반세균 수와 양의 상관관계 (P<0.01)를 보였으며, 조사한 물리·화학적 환경요인과는 유의성이 있는 상관관계가 없었다(Table 3).
- 9와 19였고, 계절 및 행정구역에 따른 뚜렷한 차이는 없었다. 질산성 질소(NO3--N)의 조사지점 전체 평균과 중앙값은 각각 3.2mg/L과 1.9mg/L로 평균이 중앙값보다 높았으며, 행정구역별 평균과 중앙값은 대구가 가장 높아 각각 5.3mg/L과 4.6mg/L로 측정되었다. 질산성 질소의 최대값은, 경북, 대구, 부산에서 먹는물 수질기준인 10mg/L를 초과하는 것으로 나타났다.
- 5 mg/L보다 낮았으며, 암모니아성 질소의 평균과 중앙값은 시호은 구)와 군의 조사지점에서 큰 차이가 없었다. 질산성 질소와 암모니아성 질소의 농도 사이에는 유의성이 있는 상관관계가 없었다(Table 3). 미생물 분포와의 상관성을 살펴보기 위해 인산염 인(PQj-P)과 COD/도 측정하였다.
- 6mg/L로 측정되었다. 질산성 질소의 최대값은, 경북, 대구, 부산에서 먹는물 수질기준인 10mg/L를 초과하는 것으로 나타났다. 군에 위치한 조사지점에서 질산성 질소의 평균과 중앙값은 각각 3.
- 2). 행정구역별로는 여름의 경우 경남 24개 지점, 경북 15개 지점, 대구 5개 지점, 부산 6개 지점, 울산 7개 지점으로부터 추정시험에서 대장균군을 검출할 수 있었고, 겨울에는 경남 9개 지점, 경북 19개 지점, 대구 1개 지점, 부산 7개 지점, 울산 3개 지점으로부터 대장균군을 검출할 수 있었다. 시(혹은 구)에 위치한 조사지점의 경우 여름에는 68개 조사지점 중 51%인 35개 지점에서, 겨울에는 66개 조사지점 중 32%인 21개 지점에서 대장균군 추정시험 양성이었고, 군에 위치한 조사지점에서는 여름 55개 조사지점 중 40%인 22개 지점에서, 겨울 51개 조사지점 중 35 %인 18개 지점에서 대장균군 양성이었다(자료 미제시).
후속연구
- 한편 미생물 시험용 시료는 채수 후 즉시 시험하여야 하고, 불가능할 경우 일반 세균은 24시간, 대장균군은 30시간 이내에 시험하여야 하지만(9), 채수 당일 실험실로 가져올 수 없었던 일부 조사지점의 지하수는 채수 후 24/8시간에 미생물 수 측정을 위한 접종을 하였다. 따라서 본 연구에서 보관시간의 경과에 의한 지하수 시료의 대장균군 사멸과 이에 따른 대장균군 추정시험 양성 지역의 과소평가 가능성은 있으나 그 차이는 크지 않으리라 판단된다. 미국 Wisconsin주에서 행한 실험 결과는 41를 유지하여 보관한 시료의 경우 채수 후 적어도 48시간까지는 보관시간이 대장균군의 검출에 영향을 주지 않음을 보여준다(17).
- 조사대상 시료의 수가 많고 배양실험에서의 시간적 제약 때문에 지하수에 존재하는 세균의 분자적 검출 및 정 량은 시도하지 않았다. 본 연구에서 대장균군을 검출할 수 있었던 조사지점의 지하수를 대상으로 오염원의 확인, 토착미생물과의 상호작용, 다른 지표미생물의 존재 여부, 세균 분포의 계절적 변화 및 환경요인의 영향 등에 대한 보다 체계적인 연구가 필요하다고 판단된다. 또한 대장균군의 분포는 바이러스에 의한 수인성 질병의 발생과 연관이 있음이 제안되었다(19).
- agglomerans는 영남지역의 지하수에서 확인되지 않았으며(20, 24, 26), 주로 물에서 분리되는 Rahnella 속의 세균이 확인된 것은 흥미롭다. 본 연구에서는 수도꼭지나 펌프출구로부터 지하수를 채수하였으며, 대장균군 세균의 오염이 확인된 간이상수도의 경우 지하수 자체의 오염인지 배수관로에서의 오염인지 여부와 잔류 염소농도 등을 확인할 필요가 있다.
- 세균에 비해 훨씬 작은 크기인 장내바이러스(25-100 nm)는 세균보다 더 쉽게 토양을 통과하여 지하수를 오염시킬 수 있다(22, 27). 본 연구의 결과는 음용수로 사용하는 지하수의 장내바이러스 모니터링에 있어 소요되는 비용과 시간 등을 최소화할 수 있는 기초 자료로도 활용될 수 있을 것이다.
- 한편 동정시험을 행한 82개 집락 중 36개 집락(44%)은 동정확률이 90% 미만이어서 동정할 수 없는 것으로 판정하였다. 이들 집락이 EMB 한천배지에서 금속성 광택을 띠지만 대장균군에 속하지 않는 세균인지 아니면 대장균군에 속하는 세균이지만 생리적 다양성 때문에 사용한 kit로 확인할 수 없는 것인지는 현재 결과로는 불분명하며, 다른 동정 방법을 이용한 추가적인 확인이 필요하다고 본다. 또한 대장균군 추정시험 양성인 시료가 확정시험에서 음성으로 판정되는 빈도 및 관련 세균에 대한 정보도 효율적인 지하수 관리를 위해 중요하다고 판단된다.
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