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문제 정의
- 따라서 본 연구는 현재 주로 사용되는 제초제 중 지속적인 반복 사용 시 잔류 위험성이 대두되는 제초제를 선정하고 들잔디(Zoysia japonica) 토양에 살포한 후 아미노산 액비를 처리하고, 말단제 한절편분석 (terminal restriction fragment length poly-morphism, T-RFLP)을 통해 미생물 군집구조를 파악하고, 16S rDNA 염기서열분석 방법을 이용하여 들잔디 토양 생태계에서 중요한 위치를 차지하고 있는 미생물의 다양성 분석을 통해 들잔디 토양에서 미생물 생태환경을 이해하기 위한 것이다.
- 본 연구는 공시 제초제로 Bentazone (8 ml/2 L(H20)/5 m2), MCPP (7 ml/2 L(H20)/5 m2)< 사용한 후, 아미노산이 포함된 액비를 처리한 후 들잔디 토양 내 16S rDNA유전자 분석을 통해 미생물 군집구조와 다양성의 변화를 이해하기 위하여 진행되었다. KD1, KD2, KD3, KD4의 토양 미생물들을 T-RFLP 분석을 통하여 아미노산이 포함된 액비 2배액을 처리한 실험구가 무처리구에 비해 미생물군집 구조가 다른 것을 확인하였다(Fig.
가설 설정
- 나아.가 잔디토양생태계 내에서 생지화학적 물질 순환과정을 이해할 수 있게 하는 기반을 제공할 것이다. 잔디토양의 생태환경을 이해하기 위해서는 환경에 가장 큰 영향을 미칠 것으로 판단되는 사용되는 농약과 비료의 사용량과 잔류량을 평가하며, 미생물에 의한 물질순환에 대한 연구와 함께 16S ribosomal DNA (rDNA) 염기서열을 이용한 미생물 군집구조 및 다양성과의 관련성에 대한 정보기- 요구된다.
제안 방법
- PCR 산물은 Gel 정제를 한 후 TOPO TA cloning kit pCR 2.1-TOPO vector (Invitrogen Corporation, USA)를 이용하여 제작사의 protocol에 따라 클로닝 하였다. 개개의 plates에서 16S rDNA의 서열 분석을 위하여 약 110개의 콜로니를 선별하였다.
- 개개의 plates에서 16S rDNA의 서열 분석을 위하여 약 110개의 콜로니를 선별하였다. pCR2.1 vector 클론들로부터 rDNA insert들을 vetctor 프라이머인 M13F(GrAAAACGACGGCCAG) 와 M13R (CAGGAAA CAGCTATGAC)을 이용하여 PCR 증폭 하였다.
- 결정된 16S rDNA 염기 서열들은 NCBI (National Center for Biotechnology Infonnation; http://wwMncbi.nih.gov/)의 BLAST 검색을 통해 클론과 가장 가까운 그룹을 조사하여 참조 서열을 확보하였다. 염기서열 편집과 정렬은 Clustal X (ver.
- 6 을 이용하여 Neighbor-Joining method를 사용하였다. 계통도내 분지의 안정도를 조사하기 위하여 1000번의 bootstrap resampling 분석을 실시하여 값을 표시하였다.
- 농약 처리 후 들잔디 토양의 깊이 0~10cm의 토양을 대상으로 대조구(KD1), 무처리구(KD2), 아미노산 액비 1배(KD3); 아미노 산 액비 2배(KD4) 처리한 토양의 클론을 임의로 각각 110개씩 선택하여 16S rDNA clone partial sequence를 분석하였다. 110개의 분석된 부분 염기서열들은 chromas213 프로그램으로 정렬한 후 GeneBank database를 이용하여 16S rRNA sequence와 비교하였다.
- 시험포장은 100 m 크기이며, 액비처리에 따라 배치하였고 5 반복으로 수행하였다. 실험은 2005년 3월 10일 실험지를 조성하였으며, 4월 25일에 혼합 제조체 처리를 하였다. 이후 5월 5일 아미노산 액비를 처리한 후 15일이 경과한 후 토양 샘플링을 각각 실시하여 미생물분석을 실시하였다.
- 실험은 2005년 3월 10일 실험지를 조성하였으며, 4월 25일에 혼합 제조체 처리를 하였다. 이후 5월 5일 아미노산 액비를 처리한 후 15일이 경과한 후 토양 샘플링을 각각 실시하여 미생물분석을 실시하였다.
- 2 g 으로부터 추출되었다. 전체 DNA는 QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen, German)를 사용하였으며 , 추출은 사용서에 포함된 protocol에 따라 추출하였다. 채집된 토양으로부터 16S rDNA 유전자는 Polymerase Chain Reaction(PCR)을 통하여 20 ul 반응액으로부터 MyGenie 32 Thermal Block (Bioneer, Korea)을 이용하여 증폭되었다.
- 효과적인 방법으로 알려져 있다(6, 8, 9). 정제된 PCR 산물 50 ng/gK 제한효소 HaeXll (Bioneer, Korea)으로 최종부피 20 |11로 하여 제조사의 방법대로 처리하였다. 반응이 끝난 말단 제한절편은 자동염기서열 결정 장치(모델 ABI 3100, Automated sequencer, Applied Instrument Biosystems, USA)를 사용하였다.
- 증폭된 클론들은 ABI 3700XL DNA sequencer (Applied Bio-sysems, USA)의 서열 분석기기를 사용하여 (주)제노텍 (Korea)에 서열 분석을 의뢰하였다.
대상 데이터
- n?)를 사용하였고, 공시 비료로는 아미노산이 포함된 액비(LFcAA)를 이용하였다. A사의 아미노산 액비는 필수아미노산 16.
- 1-TOPO vector (Invitrogen Corporation, USA)를 이용하여 제작사의 protocol에 따라 클로닝 하였다. 개개의 plates에서 16S rDNA의 서열 분석을 위하여 약 110개의 콜로니를 선별하였다. pCR2.
- 본 실험은 대전광역시 유성구 갑동 소재 실험포지에서 수행하였고, 공시 잔디는 들잔디 (Zoysia japonica)를 사용하였다. 공시 제초제는 Bentazone (8 ml/2 L(H20)/5 m2), MCPP (7 ml/2 L (H20)/5 n?)를 사용하였고, 공시 비료로는 아미노산이 포함된 액비(LFcAA)를 이용하였다.
- 채집된 토양으로부터 16S rDNA 유전자는 Polymerase Chain Reaction(PCR)을 통하여 20 ul 반응액으로부터 MyGenie 32 Thermal Block (Bioneer, Korea)을 이용하여 증폭되었다. 토양세균의 16S rDNA를 증폭하기 위하여 고안된 universal primer인 27F (E. coli numbering 8~27: 5' AGAGnTGATCMTGGCTCAG 31)와 1492R(E.coli numbering 1492-1510: 5' GGYTACCTTGTTACGACTT 3')가 사용 되었다. PCR 반응조건은 94℃에서 1분, 50℃에서 1분, 72℃에서 2분씩 25회 반복하고 마지막에는 72℃에서 8분간 처리하였다.
데이터처리
- 110개의 분석된 부분 염기서열들은 chromas213 프로그램으로 정렬한 후 GeneBank database를 이용하여 16S rRNA sequence와 비교하였다. 16S rDNA 클론의 염기서 열 분석 결과 Alpha-, Beta-Gamma- Deltaproteobacteria 그룹, Acidobacteria 그룹, Actinobacteria 그룹, Sphingobacteria, Planctomycetese 속하는 클론들로 주로 조사되었다(Table 1, 2, 3, 4).
이론/모형
- 들잔디 토양의 미생물 군집구조를 조사하기 위하여 T-RFLP를 실시하였다. 분석결과 대조구(KD1), 무처리구(KD2), 아미노산 액비 1배(KD3), 아미노산 액비 2배(KD4) 에서 나타나는 피크의 양상뿐만 아니라 각각의 T-RFs가 차지하는 상대적인 비율에도 차이를 보였다.
- 정제된 PCR 산물 50 ng/gK 제한효소 HaeXll (Bioneer, Korea)으로 최종부피 20 |11로 하여 제조사의 방법대로 처리하였다. 반응이 끝난 말단 제한절편은 자동염기서열 결정 장치(모델 ABI 3100, Automated sequencer, Applied Instrument Biosystems, USA)를 사용하였다.
- gov/)의 BLAST 검색을 통해 클론과 가장 가까운 그룹을 조사하여 참조 서열을 확보하였다. 염기서열 편집과 정렬은 Clustal X (ver. 1.83) (14)을, 이용하였고, 계통도는 Tree View 1.6.6 을 이용하여 Neighbor-Joining method를 사용하였다. 계통도내 분지의 안정도를 조사하기 위하여 1000번의 bootstrap resampling 분석을 실시하여 값을 표시하였다.
성능/효과
- 1). 16S rDNA 염기서열 분석 결과 아미노산 액비를 처리한 것과 처리하지 않은 곳에서 들잔디에 서식하는 미생물들이 서로 다른 분포를 나타내고 있으며, 대부분의 클론이 배양 가능한 미생물 그룹과 일치하지 않는 결과를 보였다(Fig. 2~Fig. 4). 이러한 결과는 배양 방법만을 이용한 잔디 토양생태계에서 미생물 생태연구 방법은 다양한 미생물 그룹들의 중요성과 역할에 대한 충분한 정보를 제시하지 못하므로 분자생물학적인 방법을 이용한 해석이 필요하다고 하겠다(6).
- 110개의 분석된 부분 염기서열들은 chromas213 프로그램으로 정렬한 후 GeneBank database를 이용하여 16S rRNA sequence와 비교하였다. 16S rDNA 클론의 염기서 열 분석 결과 Alpha-, Beta-Gamma- Deltaproteobacteria 그룹, Acidobacteria 그룹, Actinobacteria 그룹, Sphingobacteria, Planctomycetese 속하는 클론들로 주로 조사되었다(Table 1, 2, 3, 4). 이 중 Proteobacbacteria 그룹이 높은 비율로 나타났으며, 특히 KD4의 경우에는 KD2의 경우에는 출현하지 않았던 Planetnycetcdes에 속하는 클론들이 조사되었다.
- : 본 연구에서 Deltaproteobacteria&\ 속하는 클론들은 KD1 에서만 1 개의 클론이 Uncultured delta proteo-bacterium clone AKYH836과 92% 유사성을 갖는 것으로 조사되었다. 다른 실험구에서는 조사되지 않았다.
- 특히 KD4는 KD3보다도 더 다양한 미생물들이 서식하고 있었다. AIphaproteobacteria 에서는 Rhizobiales, Sphigo-monadales, 그리고 Caulobacterales 목에 속하는 미생물들의 클론이 조사되었으며, Gammaproteobacteria 에서는 Pseudomonas속의 세균들이 주로 나타났으며, Betaproteobacteria 에서는 Nitrosomonadales 목의 Nitrosospira 속들이 주로 조사되었다. 이외에도 Acidobacteria 그룹, Actinobacteria 그룹, Planctomycetes, Sphingobacteria 그룹들이 다양하게 조사되었다.
- 이 중 Proteobacbacteria 그룹이 높은 비율로 나타났으며, 특히 KD4의 경우에는 KD2의 경우에는 출현하지 않았던 Planetnycetcdes에 속하는 클론들이 조사되었다. BLAST 검색 결과 대부분의 클론들은 90% 이상의 유사성을 갖는 클론들이었으며, 대부분 95% 이상의 높은 유사성을 갖는 것으로 나타났다.
- KD1, KD2, KD3, KD4의 토양 미생물들을 T-RFLP 분석을 통하여 아미노산이 포함된 액비 2배액을 처리한 실험구가 무처리구에 비해 미생물군집 구조가 다른 것을 확인하였다(Fig. 1). 16S rDNA 염기서열 분석 결과 아미노산 액비를 처리한 것과 처리하지 않은 곳에서 들잔디에 서식하는 미생물들이 서로 다른 분포를 나타내고 있으며, 대부분의 클론이 배양 가능한 미생물 그룹과 일치하지 않는 결과를 보였다(Fig.
- 다른 클론 1개는 계통분류학적 분석 결과 Comamonadaceaee\^\ Acidovorca속과 97% 유사성을 갖는 것으로 탈질화에 관여하는 분리 균주들로 조사되었다. KD3의 클론은 Burkholderiaceaee\^\ Burkholderia 속으로 96% 유사성을 나타냈으며, 또 다른 클론은 Nitrosomonadaceae과의 Nitmsospim속과 94% 유사성을 나타냈다. KD4에서는 주로 Nitrosomonadales 목의 Nitrosospira속들이 주로 조사되었다.
- 특히 KD4에서는 Rhizobiales, Sphigo-monadales, 그리고 Caulobacterales 목에 속하는 미생물들의 클론이 조사되었다. KD4-1(97%), 5(96%), 15(96%), 78(98%)의 4개의 클론은 Rhizobiales 에 속하는 것으로 조사되었다. Rhizobiaceae과의 그룹에 속하는 이 구성원들은 호기성이며, 운동성 간균으로 불리한 환경에서는 모양이 다양하게 변하기도 한다.
- 또한 이 그룹의 Rhizobiume 콩과 식물의 뿌리혹세포와 공생관계를 맺어 질소를 고정하는 박테로이드로 살아간다(1). KD4-71(96%), 92(92%), 97 (96%), 103(94%), 112(97%)의 5개의 클론이 Sphingomonadales 목에 속하는 것으로 조사되었다(Table 1). KD4-102(94%)의 I개의 클론은 Caulobacterales 목에 속하는 것으로 Phenylobacterium immobile로 조사되었다(Fig.
- 아미노산 액비 1배 처리구인 KD3에서는 8개의 클론이 조사되었는데 이들은 Sphingomonadaceae의 비배양 환경샘플과 Kaistobacter 속이 94%의 유사성을 나타냈으며, Caulobacteraceaeee} Brevundimonas 속과 98%의 유사성을 나타냈다. 그리고 Methylobacteriaceaee\^\ 비배양의 환경샘플 98% 유사성을 나타냈으며, Caulobacteraceaeee} Caulobacter 속과 96%의 유사성을 나타냈다. Caulobacter 속에 속하는 세균은 대개 영양분이 적은 담수나 해수 서식처에서 분리되지만 토양에도 존재한다(1).
- Caulobacter 속에 속하는 세균은 대개 영양분이 적은 담수나 해수 서식처에서 분리되지만 토양에도 존재한다(1). 그리고 아미노산 액비 2배 처리구인 KD4에서는 14개의 클론이 나타났으며, 대부분의 클론들은 96~98%의 높은 유사성을 갖고 있었다. 특히 KD4에서는 Rhizobiales, Sphigo-monadales, 그리고 Caulobacterales 목에 속하는 미생물들의 클론이 조사되었다.
- 수의 클론이 조사되었다. 대조구인 KD1 에서는 9개의 클론이 조사되었으며, 주로 Sphingomonadaceae 그룹에 속하는 배양되지 않는 환경샘플 균주들이 조사되었고 이들은 95-97% 의 유사도를 나타냈다(Fig. 2).
- 들잔디에 농약처리 후 아미노산 액비를 처리한 KD3과 KD4를 아미노산 액비를 처리하지 않은 KD2와 비교해 볼 때 KD3, KD4가 더 다양하고 식물체에 효과적인 미생물들이 서식함을 알 수 있었다. 특히 KD4는 KD3보다도 더 다양한 미생물들이 서식하고 있었다.
- 이들 KD4에서 조사된 미생물들은 종류가 다양한 유기 분자를 분해하며 자연에서나 하수처리 과정에서의 무기질화 과정에 매우 중요한 역할을 하는 세균들이다. 또한 이들 미생물은 암모니아를 산화하여 아질산염으로 만들며, 질산염의 질소는 식물의 생장에 도움을 주는 중요한 역할을 하는 미생물들이 주로 서식하고 있음을 알 수 있었다. 특히 아미노산이 포함된 액비를 시비했을 때 제초제를 분해하는 Phenylobacterium immobile 이 조사되었다.
- 분석결과 대조구(KD1), 무처리구(KD2), 아미노산 액비 1배(KD3), 아미노산 액비 2배(KD4) 에서 나타나는 피크의 양상뿐만 아니라 각각의 T-RFs가 차지하는 상대적인 비율에도 차이를 보였다. KD1 에서는 유효 크기를 가진 피크가 69개로 현저히 많은 클론이 나타났음을 알 수 있었다.
- 가 96~97%의 유연관계를 나타냈다(Table 1). 아미노산 액비 1배 처리구인 KD3에서는 8개의 클론이 조사되었는데 이들은 Sphingomonadaceae의 비배양 환경샘플과 Kaistobacter 속이 94%의 유사성을 나타냈으며, Caulobacteraceaeee} Brevundimonas 속과 98%의 유사성을 나타냈다. 그리고 Methylobacteriaceaee\^\ 비배양의 환경샘플 98% 유사성을 나타냈으며, Caulobacteraceaeee} Caulobacter 속과 96%의 유사성을 나타냈다.
- KD1 에서는 유효 크기를 가진 피크가 69개로 현저히 많은 클론이 나타났음을 알 수 있었다. 아미노산액비를 처리하지 않은 무처리구인 KD2에서는 유효 bp 크기를 가진 피크가 23개를 나타났으며, 연구의 실험처리구인 KD3과 KD4에서는 점차 증가흐}는 32개, 38개의 피크기- 유효 bp 피크를 갖는 것으로 나타났다(Fig. 1). 이는 아미노산을 포함한 액비가 토양의 미생물 환경생태계에 영향을 주고 이를 통해 다양한 미생물이 서식하게 하는 것으로 판단된다.
- 16S rDNA 클론의 염기서 열 분석 결과 Alpha-, Beta-Gamma- Deltaproteobacteria 그룹, Acidobacteria 그룹, Actinobacteria 그룹, Sphingobacteria, Planctomycetese 속하는 클론들로 주로 조사되었다(Table 1, 2, 3, 4). 이 중 Proteobacbacteria 그룹이 높은 비율로 나타났으며, 특히 KD4의 경우에는 KD2의 경우에는 출현하지 않았던 Planetnycetcdes에 속하는 클론들이 조사되었다. BLAST 검색 결과 대부분의 클론들은 90% 이상의 유사성을 갖는 클론들이었으며, 대부분 95% 이상의 높은 유사성을 갖는 것으로 나타났다.
- : 이 그룹은 KD1에서 7개의, KD2에서 1개의, KD4에서 2개의 클론이 조사되었다. 일반적으로 혐기적 환경에서 주로 나타나는 그룹으로 본 연구에서는 KD1에서 많이 나타났다. 이 그룹은 혐기 환경에서 acetate와 propionate등과 같은 다양한 유기산을 이용하여 성장하며, 주로 호산성(acidophilic) 환경에서 화학 종속영양을 하는 그룹이다(12).
- 71 g/L로 시중판매 아미노산 액비 중에 가장 많은 양의 아미노산을 포함하고 있다. 화학적 특성은 질소 3.7%, 수용성 인산 2.78%, 수용성 칼륨 4.94%, 수용성 붕소 0.15%, 그리고 수용성 몰리브덴 0.0011%이었고, 아미노산 함량은 41.7 g/L 였다. 시험포장은 100 m 크기이며, 액비처리에 따라 배치하였고 5 반복으로 수행하였다.
후속연구
- 이들 미생물들에 의한 생물학적 조절이 가능하기 위해서는 병원균을 억제 할 수 있도록 유효 미생물의 활동성이 커야만 하므로 유효미생물이 더 활성화될 수 있는 조치를 취해야만 한다(5). 그러므로 이와 같은 열악한 잔디 환경에 아미노산을 포함한 액비를 처리한다면 본 연구의 결과에서 나타난 것처럼 다양한 미생물이 서식하게 될 것이며, 식물의 생장에 중요한 양분을 공급할 수 있는 유효미생물들이 더 활성화 될 것으로 판단된다.
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