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문제 정의
- 그 중에서도 본 연구진은 해양유래 미생물을 이용하여 어류질병세균을 제어하고자 한다. 해양미생물은 해수와 퇴적층에서의 물질 순환에 중요한 역할을 수행하고 있으며, 근래에는 해양오염이나 어류질병문제에서도 많은 관심을 받고 있다.
- 따라서 본 연구에서는 제주도 해양에서 분리한 해양유래 미생물 중 육상 양식장에 피해를 주는 어류질병세균에 대한 항균활성을 가지는 미생물을 탐색하고자 한다.
- 제주도 육상 양식장에서 주로 발생하는 어류 질병세균인 Edward tarda, Streptococcus parauberis, Photobacterium phosphoreum에 대한 피해를 줄이고 치료하고자 해양유래 미생물을 이용하고자 한다. 본 연구진은 제주 지역 4개 해역에서 해양유래 미생물을 8종 분리하였다.
- 최소 생육 배지인 GY 배지에 대표적인 탄소원, 질소원, 무기염을 추가로 첨가할 때 나타나는 생육활성을 대조구와 비교 하고자 한다.
제안 방법
- 각종 배지성분은 항균물질 생산에 중요한 것으로 알려져 있기 때문에[22], 해양유래 미생물인 B. subtilis MD-02의 배지조성에 탄소원인 Dextrine, Saccharose, Sorbitol을 첨가하여 생육활성을 측정하였다. 측정 결과 배지에 아무것도 첨가하지 않은 control에 비해 Dextrine만 생육 활성이 증가한 것을 확인할 수 있었다.
- 어류질병 균주는 전 배양하여 MHA에 도말 후 일정 간격으로 건조시킨 paper disc를 올려 놓은 후 25℃에서 48시간 동안 배양하였다. 배양 후 paper disc 주위에 억제환의 형성 유무를 확인하여 항균 활성능을 확인하였다[16].
- 채취한 해수는 0.85% 생리 식염수에 희석하여 Marine Agar (MA, Difco, USA), ISP Medium 2 (ISP2, Difco, USA), Reasoner’s 2A Agar (R2A, Difco, USA)에 각각 접종하였다.
- 항생제 종류는 Florfenicol 외 11종(Table 1)을 사용하였고, 세균의 내성유무를 확인하기 위해 일반적으로 사용되는 항생제에 Bauer-kirby test를 통해 항생제 내성 균주와 감수성 균주로 분류하였다[14].
- 해양유래 미생물 후보 균주의 배지조성에 따른 생육활성을 알아보기 위하여 최소 생육 배지인 GY 배지(Glucose 10 g, Yeast extract 2.5 g, Distilled water 1 L)에 대표적인 탄소원 Dextrine, Saccharose, Sorbitol을 각각 1% 첨가하여 30℃, 150 rpm으로 24시간 배양한 후 배양액의 탁도를 660 nm에서 측정하였다. 대조구는 GY 배지에서 glucose가 첨가되지 않은 배지를 사용하였다[17, 18].
- 해양유래 미생물 후보 균주의 배지조성에 따른 생육활성을 알아보기 위하여 최소 생육 배지인 GY 배지에 대표적인 무기염 KH2Po4, MgSO4· 7H2O, FeSO4· 7H2O를 각각 0.1% 첨가하여 30℃, 150 rpm으로 24시간 배양한 후 배양액의 탁도를 660 nm에서 측정하였다.
- 해양유래 미생물 후보 균주의 배지조성에 따른 생육활성을 알아보기 위하여 최소 생육 배지인 GY 배지에 대표적인 질소원 Malt extract, Peptone, Yeast extract를 각각 0.5% 첨가하여 30℃, 150 rpm으로 24시간 배양한 후 배양액의 탁도를 660 nm에서 측정하였다. 대조구는 GY 배지에서 yeast extract가 첨가되지 않은 배지를 사용하였다[18, 19].
- 해양유래 미생물인 B. subtilis MD-02의 배지조성에 무기염인 KH2Po4, MgSO4· 7H2O, FeSO4· 7H2O를 첨가하여 생육활성을 측정하였다.
- 해양유래 미생물인 B. subtilis MD-02의 배지조성에 질소원인 Malt extract, Peptone, Yeast extract를 첨가하여 생육활성을 측정하였다. 측정 결과 control과 비교 시 Peptone, Yeast extract가 생육활성이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
대상 데이터
- 대조구는 GY 배지에서 MgSO4·7H2O가 첨가되지 않은 배지를 사용하였다[18, 20].
- 5 g, Distilled water 1 L)에 대표적인 탄소원 Dextrine, Saccharose, Sorbitol을 각각 1% 첨가하여 30℃, 150 rpm으로 24시간 배양한 후 배양액의 탁도를 660 nm에서 측정하였다. 대조구는 GY 배지에서 glucose가 첨가되지 않은 배지를 사용하였다[17, 18].
- 5% 첨가하여 30℃, 150 rpm으로 24시간 배양한 후 배양액의 탁도를 660 nm에서 측정하였다. 대조구는 GY 배지에서 yeast extract가 첨가되지 않은 배지를 사용하였다[18, 19].
- 접종한 배지는 25℃에서 48시간 배양하였다[9]. 배양 된 균주를 이용하여 어류질병세균에 대하여 항균활성을 가진 해양유래 미생물 후보 균주만 선별하였다. 선별된 균주는 Marine Broth (MB, Difco, USA), ISP medium 2 Broth (ISP2, Difco, USA), Reasoner’s 2A Broth (R2B, Difco, USA)에 접종하여 25℃에서 48시간 배양시킨 후, −80℃에 20% (v/v) glycerol에 보관하였다[10, 11].
- 제주도 육상 양식장에서 주로 발생하는 어류 질병세균인 Edward tarda, Streptococcus parauberis, Photobacterium phosphoreum에 대한 피해를 줄이고 치료하고자 해양유래 미생물을 이용하고자 한다. 본 연구진은 제주 지역 4개 해역에서 해양유래 미생물을 8종 분리하였다. 분리 된 해양유래 미생물을 이용하여 항생제 디스크에 대한 감수성 확인을 한 결과, Oxytetracycline과 penicillin에서만 약한 내성을 보일 뿐 나머지 항생제 디스크에 대해선 감수성을 보였다.
- 분리된 균주는 MD-01∼MD-08으로 명명하여 본 실험에 사용하였다.
- Phosphoreum에 대해선 모든 해양 유래 미생물에서 항균활성을 보였다. 이 중 어류질병세균에 대하여 항균활성이 가장 좋으며 항생제에 감수성을 보이는 B. subtilis MD-02를 최종 선정하였다. B.
- 4C). 이에 어류질병세균에 대한 항균활성이 좋으며 항생제에 감수성을 보이는 Bacillus subtilis MD-02로 최종 선정하였다(Fig. 2).
- 제주도 내 넙치 양식장에서 주로 발생하는 Streptococcus parauberis KCTC 3651 (Sp), Edwardsiella tarda KCTC 12267 (Et), Photobacterium phosphoreum KCTC 12377 (Pp)를 생물자원센터(Korea Collection for Type Culture, KCTC)에서 분양받았다. 분양받은 균주를 Brain Heart Infusion Agar (BHIA, Difco, USA)에 접종하여 25℃에서 48시간 배양하였다[12, 13].
- 해양유래 미생물 후보 균주를 분리 하기 위해 제주도 내 4개 해역(성산, 표선, 대정, 한림)에서 각각 해수를 채취하였다(Fig. 1). 채취한 해수는 무균 채수병에 담아 4℃에 보관하여 실험실로 운반하여 실험을 진행하였다.
이론/모형
- 제주 해역에서 분리한 해양유래 미생물 후보 균주에 대한 어류질병세균의 항균 활성능을 paper disc법을 이용하여 측정하였다[15]. 8 mm paper disc에 전 배양한 해양유래 미생 후보 균주를 100 µl씩 분주하여 25℃에서 24시간 건조 시켰다.
성능/효과
- B. subtilis MD-02의 배지조성은 탄소원에서는 Dextrine, 질소원에서는 Peptone, 무기염에서는 MgSO4·7H2O에서 생육이 가장 활발한 것을 확인하였다.
- 4B). P. phosphoreum에 대해서는 모든 해양 유래 미생물에서 항균활성을 보였다(Fig. 4C). 이에 어류질병세균에 대한 항균활성이 좋으며 항생제에 감수성을 보이는 Bacillus subtilis MD-02로 최종 선정하였다(Fig.
- tarda에 대해선 MD-02, MD-04, MD-06이 각각 22 mm, 18 mm, 19 mm의 억제환이 나타났다. S. parauberis에 대해선 MD-01, MD-02, MD-04, MD-06이 각각 19 mm, 22 mm, 30 mm, 29 mm의 억제환이 나타났으며, P. Phosphoreum에 대해선 모든 해양 유래 미생물에서 항균활성을 보였다. 이 중 어류질병세균에 대하여 항균활성이 가장 좋으며 항생제에 감수성을 보이는 B.
- 측정 결과 배지에 아무것도 첨가하지 않은 control에 비해 Dextrine만 생육 활성이 증가한 것을 확인할 수 있었다. Saccharose와 Sorbitol의 경우 control에 비해 생육활성이 변화가 없거나 감소하는 것을 확인하였다(Fig. 5A).
- 본 연구진은 제주 지역 4개 해역에서 해양유래 미생물을 8종 분리하였다. 분리 된 해양유래 미생물을 이용하여 항생제 디스크에 대한 감수성 확인을 한 결과, Oxytetracycline과 penicillin에서만 약한 내성을 보일 뿐 나머지 항생제 디스크에 대해선 감수성을 보였다. 해양유래 미생물을 이용하여 어류질병에 대한 항균활성을 확인한 결과 E.
- 분리한 해양유래 미생물을 이용하여 어류질병세균에 대한 항균활성을 확인한 결과 E. tarda에 대해서는 MD-02, MD04, MD-06이 각각 22 mm, 18 mm, 19 mm로 억제환을 보여 항균활성을 나타냈다(Fig. 4A). S.
- 측정 결과 control과 비교 시 KH2Po4, MgSO4· 7H2O가 생육활성이 증가하는 것을 확인 할 수 있었다.
- subtilis MD-02의 배지조성에 질소원인 Malt extract, Peptone, Yeast extract를 첨가하여 생육활성을 측정하였다. 측정 결과 control과 비교 시 Peptone, Yeast extract가 생육활성이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. Malt extract의 경우 control에 비해 생육활성이 감소하는 것을 확인하였다(Fig.
- subtilis MD-02의 배지조성에 탄소원인 Dextrine, Saccharose, Sorbitol을 첨가하여 생육활성을 측정하였다. 측정 결과 배지에 아무것도 첨가하지 않은 control에 비해 Dextrine만 생육 활성이 증가한 것을 확인할 수 있었다. Saccharose와 Sorbitol의 경우 control에 비해 생육활성이 변화가 없거나 감소하는 것을 확인하였다(Fig.
- 3). 하지만 MD01, MD-03은 양식장에서 주로 사용하고 있는 Oxytetracycline에 대해서는 8 mm의 억제환을 보여 다른 해양미생물에 비해 약한 내성을 보이는 것을 확인하였다. 또한 MD-07은 Penicillin에 11 mm의 억제환을 보여 다른 해양 미생물에 비해 약한 내성을 보였다.
- 항생제 감수성 결과 실험에 사용된 모든 해양유래 미생물에서 항생제에 대하여 감수성을 보였다(Fig. 3). 하지만 MD01, MD-03은 양식장에서 주로 사용하고 있는 Oxytetracycline에 대해서는 8 mm의 억제환을 보여 다른 해양미생물에 비해 약한 내성을 보이는 것을 확인하였다.
- 해양유래 미생물 후보균주는 총 8종이 분리되었으며, Bacillus safensis 2종, Bacillus subtillis 3종, Psychrobacter pulmonis, Pseudomonas balearica, Psychrobacter celer이 분리되었다(Table 2). 분리된 균주는 MD-01∼MD-08으로 명명하여 본 실험에 사용하였다.
- 분리 된 해양유래 미생물을 이용하여 항생제 디스크에 대한 감수성 확인을 한 결과, Oxytetracycline과 penicillin에서만 약한 내성을 보일 뿐 나머지 항생제 디스크에 대해선 감수성을 보였다. 해양유래 미생물을 이용하여 어류질병에 대한 항균활성을 확인한 결과 E. tarda에 대해선 MD-02, MD-04, MD-06이 각각 22 mm, 18 mm, 19 mm의 억제환이 나타났다. S.
후속연구
- subtilis MD-02의 배지조성은 탄소원에서는 Dextrine, 질소원에서는 Peptone, 무기염에서는 MgSO4·7H2O에서 생육이 가장 활발한 것을 확인하였다. 이에 따라 해양에서 분리된 B. subtilis MD-02는 어류질병균주에 대한 항균활성을 가지는 동시에 향후 치료제로써의 가치가 있다고 사료된다.
- 이에 따라 해양유래 미생물인 B. subtilis MD-02의 가장 좋은 생육활성 환경은 배지에 Dextrine, Peptone, MgSO4·7H2O를 첨가하여 배양 시 높은 생육활성을 기대할 수 있다고 사료된다.
- 해양미생물은 해수와 퇴적층에서의 물질 순환에 중요한 역할을 수행하고 있으며, 근래에는 해양오염이나 어류질병문제에서도 많은 관심을 받고 있다. 해양미생물의 응용사례로는 호염성 해양미생물로부터 항생제 istamycin, biopolymer, glycine betaine 생산, 내한성 미생물의 경우 세제용 효소의 개발, 빙핵활성 단백질 생산 등 다양한 방면에서 이용되고 있으며 앞으로 새로운 기능이 밝혀짐에 따라 산업적 이용은 더욱 확대될 것이다[7, 8].
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