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문제 정의
- 따라서 본 연구에서도 덩굴마름병의 방제를 목적으로 덩굴마름병을 강하게 억제하는 길항균주를 선발하고 그 길항균주가 생산하는 항진균 물질의 생산조건을 검토하여 덩굴마름병방제 미생물 제제화 및 농업용 항생물질 제제화의 기초를 마련 하고자 한다.
제안 방법
- 24~72시간동안 선발된 균주를 배양한 후, 24시간마다 배양액을 sampling하여 배양시간에 따른 항진균 활성을 조사하였다.
- 0% sodium chloride)에 접종하여 30℃, 180 rpm의 조건으로 24시간 배양한 후, 상등액을 12,000 rpm에서 10분간 4℃로 원심분리 하여 균체를 침전시켰다. Agar diffusion method를 수행하기 위하여 D. bryoniaee: 접종하여둔 PDA plate에 상등액 20 μ1를 침지한 paper disc(직경 6 mm)를 얹고, 241에서 7일간 배양하면서 항진균 활성을 조사하였다.
- D. bryoniae에 대하여 가장 높은 생육억제를 나타내는 균주를 최종적으로 선발한 후, 항진균 활성을 조사하였다. 선발한 균주의 콜로니를 LB broth (1.
- 0)로 현탁한 후 4P에서 24시간 동안 투석하여 사용하였다. D. bryoniae의 포자현탁액을 50 ml의 PDB에 접종하고 동량의 회수한 물질을 각각 첨가하여 항진균 활성을 조사하였으며 대조구에는 동량의 Tris-HCl buffer (pH 8.0)를 첨가하였다.
- Brevibacillus sp. KMU-391 가 생산하는 항진균 물질을 회수하기 위하여 기본배지인 TSB에 탄소원 및 질소원으로 1.0% sucrose와 1.0% polypeptone을 첨가하고 pH를 7, 0으로 조정한 후, 30℃ 2일간 배양하였다. 회수한 배양액에 0-30%와 30-60% 의 ammonium sulfkte를 첨가한 후, 원심분리하여 침전물을 회수하고 회수액을 VC에서 24시간 투석하여 탈염하였다.
- KMU-391 의 항진균 활성을 확인한 후, LB broth 에서 Brevibacillus sp. KMU-391 을 24시간 배양하여 paper disc를 이용한 agar diflusion method로 항진균 활성을 조사한 결과 inhibitory zone을 형성하였다. LB broth를 이용하여 전배양한 후, 항진균 물질의 생산을 위한 기본배지를 선택하기 위하여 LB broth, YM broth, NB, PDB, 그리고 TSB를 이용하여 각각의 배지에서 24시간 배양한 후 항진균 활성을 조사한 결과, 항진균 활성은 TSB에서 20mm로 가장 높게 나타났으며 NB와 YM broth에서도 18 mm으로 조사되었다.
- 기본배지에 따른 선발균의 항진균 물질의 생산과 생육을 조사하기 위하여 LB broth, YM broth (Yeast malt broth, 0.3% yeast extract, 0.3% malt extract, 0.5% peptone, 1.0% dextrose), NB (Nutrient broth, 0.5% peptone from meal, 0.3% meat extract), PDB (potato dextrose broth, 0.4% potato starch, 2.0% dextrose), 그리고 TSB (trypticase soybean broth, 1.7% digest of casein, 0.3% soytone, 0.5% sodium chloride, 0.25% dextrose)를 제조하여 pH를 7.0으로 조정한 후, 12FC에서 15분간 멸균하여 사용하였다. 전배양액은 24시간 전에 LB broth에 단일 콜로니를 접종하여 30℃에서 배양하여' 준비하였으며 각각의 삼각플라스크에 전 배양액 0.
- 기본배지인 TSB에 탄소원으로 1.0% s* ucrose 첨가한 후 다양한 질소원을 첨가하여 항진균 물질의 생산에 미치는 영향을 조사하였다. Table 7에서와 같이 첨가한 11 종류의 유, 무기 질소원 중에서 유기질소원인 polypeptone, bactotryptone, 그리고 malt extract에서 대조구보다 높은 항진균 활성을 나타내었으며 polypeptone을 첨가한 경우에 가장 양호한 것으로 나타났다 (Table 7).
- 다양한 작물병원성 곰팡이를 대상으로 하여 선발된 균이 가지는 항진균 활성의 spectrum을 조사하였다. 항진균 활성을 조사하기 위하여 앞의 실험과 동일조건으로 200 ml 배양한 후, 배양액을 원심분리 하여 균체를 제거하고, 상등액에 2배 volume의 butanol을 첨가하여 항진균 물질을 용매층으로 이행시키고 용매를 회수하고 5SC이하에서 감압농축 한 후, 항진균 활성을 조사하였다.
- 서로 다른 23 균주를 선발하였다. 덩굴마름병을 야기하는 D. bryoniae KACC 40669에 대한 길항균주를 선발하기 위하여 PDA plate에 선발된 각각의 균을 획선 접종하여 배양하면서 D. bryoniae의 생육을 억제하는 8균주를 일차적으로 선발하였다. 선발된 균주를 각각 대치배양 하여 24℃에서 7일간 배양하면서 D.
- 분리균주를 대치배양한 후, 일차적으로 D. bryoniae의 증식을 억제하는 것으로 확인된 균주들을 대상으로 가장 높은 생육 저지대를 형성하는 균주를 최종적으로 선발하기 위하여 D. bryoniae 를 직경 6 mm 크기의 culture disc로 PDA에 접종하고 241에서 24시간 배양한 후, 6 cm 떨어진 곳에 일차적으로 선발한 균주들을 획선 접종 하여 24℃에서 7일간 배양하면서 D. bryoniae 에 대한 발육 억제를 조사하였다.
- 선발균의 항진균 활성과 생육에 대한 배양온도의 영향을 조사하기 위하여 앞에서 조사된 기본배지에 전배양한 선발균을 접종한 후 24, 30, 37, 그리고 45℃(2에서 180 rpm으로 24시간 배양하여 균의 생육 및 항진균 활성을 조사하였다.
- 선발균의 항진균 활성과 생육에 대한 탄소원의 영향을 조사하기 위하여 앞에서 조사된 기본배지를 대조구로 하여 arabinose, fructose, glucose, glycerol, lactose, maltose, mannitol, soluble starch, sorbitol, 그리고 sucrose를 각각 1.0%씩 첨가한 후, 앞에서 조사된 초기 pH로 조정하여 사용하였다. 전배양액을 접종하여 앞에서 조사된 최적 배양온도에서 180 rpm의 조건으로 24시간 배양한 후 균체의 증식과 항진균 활성을 조사하였다.
- bryoniae의 생육을 억제하는 8균주를 일차적으로 선발하였다. 선발된 균주를 각각 대치배양 하여 24℃에서 7일간 배양하면서 D. bryoniae의 생육을 가장 많이 저지하는 균주를 최종적으로 선발하고 KMU-391 이라 명명하였다(Fig. 1): KMU-391은 그람양성의 rod form으로 내생포자를 형성하고 형성된 집락은 원형으로 점질 성의 물질을 생산하는 mucoid type이였으며 표면은 smooth 하였다. KMU-391은 호기성 세균으로 catalase, gelatin liquefaction, citrate utilization, 그리고 nitrate reduction 등을 하는 것으로 조사되었으며 Bergey's manual of systematic bacteriology와 비교한 결과, Bacillus sp.
- 선발된 균주의 항진균 활성을 조사하기 위하여 앞에서 조사되어진 항진균 물질 생산배지 300 ml을 제조하고 선발된 균주를 앞에서 조사된 최적조건에서 배양한 후, 10, 000 rpm, 4℃에서 20분간 원심분리를 하여 상등액을 회수하였다. 항진균 활성을 나타내는 물질을 회수하기 위하여 ammonium sulfhte를 0~30%와 30-60% 농도로 첨가한 후, 4℃에서 12시간 정치하면서 항진균물질의 침전을 유도하여 4℃에서 10, 000 rpm, 20분간 원심분리하여 회수하였다.
- 0%씩 첨가한 후, 앞에서 조사된 초기 pH로 조정하여 사용하였다. 전배양액을 접종하여 앞에서 조사된 최적 배양온도에서 180 rpm의 조건으로 24시간 배양한 후 균체의 증식과 항진균 활성을 조사하였다.
- 75X106 spores/ml로 포자 현탁액을 제조하여 4℃ 에 보관하면서 사용하였다. 제조한 포자 현탁액 0.1 ml을 PDA에 첨가하고 각각의 배양액을 12,000 rpm, 4℃에서 10분간 원심분리 한 상등액 20 μ1를 paper disc에 침지하여 건조한 후 PDA에 얹고 24℃에서 7일간 배양하여 조사하였다.
- 5% agar) 배지에 접종하여 균주를 분리하였다. 증식한 균주들을 순수 분리한 후, 덩굴마름병원균인 Didymella bryoniaee: 방제할 수 있는 균주를 선발하기 위하여 PDA (potato dextrose agar, 0.4% potato starch, 2.0% dextrose, 1.5% agar) plate에서 대치배양(pairing culture)을 실시하여 D. bryoniae 의 증식을 억제하는 균주들을 일차적으로 선발하였다. 공시 균주로 사용한 D.
- 질소원에 의한 선발균의 항진균 활성과 생육의 영향을 조사하기 위하여 앞에서 조사된 탄소원 L0%를 기본배지에 첨가한 후, 질소원으로 ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium sulfate, beef extract, bactopeptone, bactotryptone, com steep liquor (CSL), malt extract, polypeptone, urea, 그리고 yeast extracti 각각 1.0%씩 첨가하고 pH를 조정하여 동일한 방법으로 조사하였다.
- 초기 pH의 변화에 따른 영향을 조사하기 위하여 기본배지의 pH를 3.0~ 10.0으로 각각 조정하여 동일한 방법으로 배양하여 조사하였다.
- 원심분리를 하여 상등액을 회수하였다. 항진균 활성을 나타내는 물질을 회수하기 위하여 ammonium sulfhte를 0~30%와 30-60% 농도로 첨가한 후, 4℃에서 12시간 정치하면서 항진균물질의 침전을 유도하여 4℃에서 10, 000 rpm, 20분간 원심분리하여 회수하였다. 회수한 물질을 소량의 100 mM Tris-HCl buffer (pH 8.
- 항진균 활성의 spectrum을 조사하였다. 항진균 활성을 조사하기 위하여 앞의 실험과 동일조건으로 200 ml 배양한 후, 배양액을 원심분리 하여 균체를 제거하고, 상등액에 2배 volume의 butanol을 첨가하여 항진균 물질을 용매층으로 이행시키고 용매를 회수하고 5SC이하에서 감압농축 한 후, 항진균 활성을 조사하였다. 조사한 작물 병원성 곰팡이는 장미 잿빛곰팡이병을 야기하는 Botrytis cinerea KACC 40573, 잠두 붉은점무늬병을 야기하는 Botrytis fabae KACC 40962, 고추 탄저병을 야기하는 Colletotrichum gloeosporioides KACC 40804, 참외 탄저병을 야기하는 Colletotrichum orbiculare KACC 40808, 수박 등의 박과 작물에 덩굴마름병을 야기하는 Didymella bryoniae KACC 40669, 보리 질병을 야기하는 Fusarium graminearum KACC 41040, 토마토 시들음병을 야기하는 Fusarium oxysporum KACC 40037, 글라디올러스 마른썩음병을 야기하는 Fusarium oxysporum KACC 40052, 토마토 질병을 야기하는 Fusarium oxysporum f.
- 회수한 배양액에 0-30%와 30-60% 의 ammonium sulfkte를 첨가한 후, 원심분리하여 침전물을 회수하고 회수액을 VC에서 24시간 투석하여 탈염하였다. 항진균 활성을 조사하기 위하여 회수한 용액(6 ml) 중 96ul를 50 ml의 PDB배지에 첨가하고 대조구에는 100 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0)를 첨가한 후, D. biyoniaee] 포자 현탁액 100 μ1를 접종하여 24℃, 150 rpm으로 7일간 배양하면서 조사한 결과, 대조구와 0~ 30% ammonium sulfate로 회수한 경우에는 배양 중 큰 차이를 나타내지는 않았으나 30-60% ammonium sulfated. 회수한 경우에는 배양 중 포자의 생육이 상대적으로 늦었으며 포자의 크기도 상대적으로 작게 형성되었다.
- 0% polypeptone을 첨가하고 pH를 7, 0으로 조정한 후, 30℃ 2일간 배양하였다. 회수한 배양액에 0-30%와 30-60% 의 ammonium sulfkte를 첨가한 후, 원심분리하여 침전물을 회수하고 회수액을 VC에서 24시간 투석하여 탈염하였다. 항진균 활성을 조사하기 위하여 회수한 용액(6 ml) 중 96ul를 50 ml의 PDB배지에 첨가하고 대조구에는 100 mM Tris-HCl buffer (pH 8.
대상 데이터
- KMU-391 의 항진균 활성의 spectrum을 조사하기 위하여 위와 동일한 조건에서 Brevibacillus sp. KMU-391을 배양하였다. Butanol 이용하여 배양액으로부터 항진균 활성물질을 회수한 후, agar diffusion method로 항진균 spectrum을 조사-한 결과 항진균 활성을 조사한 Botrytis cinerea KACC 40573, Botrytis fabae KACC 40962, Colletotrichum gloeosporioides KACC 40804, Colletotrichum orbiculare KACC 40808, Didymella btyoniae KACC 40669, Fusarium graminearum KACC 41040, Fusarium oxysporum KACC 40037, Fusarium oxysporum KACC 40052, Fusarium oxysporum f.
- sp. radicis-lycopersici KACC 40537, 수박 덩굴쪼김병을 야기하는 Fusarium oxysporum KACC 40902, 수박 질병을 야기하는 Monosporascus cannonballus KACC 40940, 사과나무 역병을 야기하는 Phytophthora camvibora KACC 40160, 벼잎 집 무늬 마름병 을 야기 하는 Rhizoctonia solani AG-1 (IA) KACC 40101, 참외 줄기썩음병을 야기하는 Rhizoctonia solani AG-4 KACC 40142, 그리고 고추 균핵병을 야기하는 Scleotinia scleotiorum KACC 41065를 사용하였다.
- bryoniae 의 증식을 억제하는 균주들을 일차적으로 선발하였다. 공시 균주로 사용한 D. bryoniae KACC 40669는 농업진흥청 농업 생명공학연구원 한국농용미 생 물보존센터 (Korean Agricultural Culture Collection, KACC)에서 보유중인 덩굴마름병원균 중 병원성을 나타내는 균주를 분양받아 사용하였다.
- 토양시료로부터 분리된 균주 중에서 육안관찰, 형태 및 증식양상이 서로 다른 23 균주를 선발하였다. 덩굴마름병을 야기하는 D.
- 항진균 활성을 가지는 균주를 분리하기 위하여 Russia의 Sanktpeterburg지역의 토양을 사용하였다. 시료 30 g을 270 ml의 멸균수에 넣고 shaking incubator로 10분간 진탕하여 시료가 잘 섞이도록 교반한 훅, 80℃ water bath에서 30분간 열처리하고 LB agar (1.
이론/모형
- 항진균 활성을 나타내는 선발균의 분류학상 위치를 검토하기 위하여 형태학적, 배양학적, 생화학적 특성을 검토하였으며, 도출된 결과는 Bergey's manual of systematic bacteriology(3)를 참고하였으며 API kit (bioMerieux, France)을 이용하여 동정하였다.
성능/효과
- D. bryoniaee 회수하여 50。<2에서 2일간 건조한 후 중량을 측정하여 항진균 활성을 조사한 결과 배양액에 30-60% ammonium sulfated 처리한 경우에 건조중량이 0.5 g으로 대조구와 비교하여 41%정도의 생육을 저해 받은 것으로 조사되었으나 0-30% ammonium sulfhte를 처리한 경우에는 0.84 g으로 대조구의 0.85 g과 비교할 때 거의 유사하였다. 이러한 결과로부터 30-60% ammonium sulfhte를 처리하여 항진균 물질을 회수할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
- 로 분류되었다(Table 1). API 50 CHB kit을 사용하여 50가지의 당에 대한 생화학적 특성을 조사한 후, API 20E kit의 결과와 함께 API LABplus (V. 3. 3. 3) 프로그램으로확인한 결과, Brevibacillus 와 94.3%의 상동성을 나타내었으나 16S rDNA sequence와 같은 보다 정확한 결과와 비교하지 못하여 Brevibacillus sp. KMU-391로 명명하였다(Table 2).
- 배양초기 pH에 따른 Brevibacillus sp. K0U-391의 항진균 활성과 생육을 조사하기 위하여 기본배지인 TSB의 pH를 3.0-10.0 으로 각각 조정하여 조사한 결과 pH 7.0에서 가장 양호한 항진균 활성을 나타내었다. pH 7.
- sp. KMU-391 의 항진균 활성을 조사한 결과, Table 4와 같이 30℃ 에서 가장 높은 항진균 활성을 나타내었으며 37, 45, 그리고 24 ℃ 순으로 조사되었다. Brevibacillus sp.
- 배양일수에 따른 Brevibacillus sp. KMU-391의 항진균 활성을 조사하기 위하여 기본배지에 탄소원으로 1.0% sucrose와 질소원으로 1.0% polypeptone을 첨가하여 1~3일간 3이에서 180 rpm 으로 배양하면서 조사한 결과 배양일수에 따른 항진균 활성의 차이는 거의 나타나지 않았으나 배양 2일째 가장 양호한 활성을 나타내었다(Fig. 2). 생육의 경우에 배양 3일째 가장 양호한 생육을 하는 것으로 조사되었으나 배양 1일째와 비교하였을 때 큰 차이를 나타내지는 않는 것으로 판단되었다.
- KMU-391 을 24시간 배양하여 paper disc를 이용한 agar diflusion method로 항진균 활성을 조사한 결과 inhibitory zone을 형성하였다. LB broth를 이용하여 전배양한 후, 항진균 물질의 생산을 위한 기본배지를 선택하기 위하여 LB broth, YM broth, NB, PDB, 그리고 TSB를 이용하여 각각의 배지에서 24시간 배양한 후 항진균 활성을 조사한 결과, 항진균 활성은 TSB에서 20mm로 가장 높게 나타났으며 NB와 YM broth에서도 18 mm으로 조사되었다. Brevibacillus sp.
- 0% s* ucrose 첨가한 후 다양한 질소원을 첨가하여 항진균 물질의 생산에 미치는 영향을 조사하였다. Table 7에서와 같이 첨가한 11 종류의 유, 무기 질소원 중에서 유기질소원인 polypeptone, bactotryptone, 그리고 malt extract에서 대조구보다 높은 항진균 활성을 나타내었으며 polypeptone을 첨가한 경우에 가장 양호한 것으로 나타났다 (Table 7). 다른 질소원들의 경우에도 polypeptone이 나타내는 항진균 활성의 87% 이상은 유지하였다.
- 0에서 가장 양호한 항진균 활성을 나타내었다. pH 7.0과 비교하였을 때 pH 6.0과 8.0은 각각 90%의 항진균 활성을 나타내었으며 4.0, 5.0, 그리고 9.0에서는 80% 이상의 항진균 활성을 나타내었다. 생육은 pH 5.
- 그러나 탄소원으로 sorbitol을 첨가하였을 때 50% 정도의 항진균 활성을 나타낸 것처럼 질소원의 첨가에 의하여 항진균 활성의 급격한 감소를 나타내는 것은 없는 것으로 조사되었다. 생육의 경우 com steep liquet 첨가한 경우에 가장 양호한 생육을 하였으며 ammonium chloride와 yeast extract# 첨가한 경우에도 양호한 생육을 하는 것으로 조사되었다.
- KMU-391에 의한 항진균물질의 생산은 탄소원에 대한 기질 특이성을 가지는 것으로 판단되었으며 sucrose를 첨가하였을 때 가장 양호한 항진균 활성을 나타낸다고 보고한 김 등(10)의 결과와 유사하였다. 생육의 경우 sucrose를 첨가한 경우에도 양호한 생육을 나타내었으나 다른 실험 구와 비교할 때 상대적으로 낮은 생육을 하는 것으로 나타났으며 이와는 반대로 항진균 활성이 가장 낮게 조사된 sorbitol의 경우에는 양호한 증식을 하는 것으로 조사되었다.
- 85 g과 비교할 때 거의 유사하였다. 이러한 결과로부터 30-60% ammonium sulfhte를 처리하여 항진균 물질을 회수할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
- KMU-391 가 생산하는 항진균 물질의 생산에 미치는 탄소원의 영향을 조사한 결과는 Table 6와 같다. 탄소 원 중에서 sucrose를 첨가하였을 때 23 mm로 가장 높은 항진균 활성을 나타내었으며 arabinose, maltose, 그리고 mannitol을 첨가한 경우에도 대조구에 비하여 높은 항진균 활성을 나타내었다. 그러나 fructose, glucose, glycerol, lactose, 그리고 soluble starch를 첨가한 경우 가장 양호한 항진균 활성을 나타낸 sucrose와 비교하였을 때 70% 이상의 항진균 활성을 나타내었으나 sorbitol을 첨가하였을 때에는 50%의 항진균 활성을 나타내었다.
후속연구
- sp. radicis-lycopersici KACC 40537, Fusarium oxysporum KACC 40902, Monosporascus cannonballus KACC 40940, Phytophthora camvibora KACC 40160, Rhizoctonia solani AG-1 (IA) KACC 40101, Rhizoctonia solani AG-4 KACC 40142, 그리고 Scleotinia scleotiorum KACC 41065에 대하여 항진균 활성을 나타내었으며(Table 8) 덩굴마름병에 대한 실용적인 생물학적 방제제 개발을 위한 포장실험, 제형개발 등의 다양한 조사를 진행할 예정이다.
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