선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 이 시스템을 이용하여 16S의 가장 잘 보존된 부분에 대한 많은 즉홍진화 (instant evolution) 실험이 진행되었고(11 17), 이로 인해 16S의 기능과 구조에 대한 유전학적 해석이 가능하게 되었다. 이 시스템을 이용하여 소단위체 rRNA의 가장 잘 보존된 염기의 변형이 리보솜의 기능에 미치는 영향을 분석하고 이차복귀돌연변이 (second-site revertant)를 발췌하는 실험 방법을 개발하여 그 결과를 보고한다.
제안 방법
- 수 있게 제작하였다. 16S rRNA를 코딩하는 부분의 789 위치에 염기치환을 포함한 리보솜을 발현하는 클론을 제작하기 위하여, 이 부분에 염기 치환을 포함한 PCR DNA를 BgZH와 Dralll 제한효소로 분해하여 pRNA122 플라스미드의 같은 제한효소 자리에 클론하였다. PCR DNA를 증폭시키기 위해 사용한 primer는 16S-537F (5'-GGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAA), 16S-786R (5'-CCTGnTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTGAGCG), 16S-791H (5'-CTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATVAGA TACCCTGGTAGTCCACGCCGTAA)와 ASD-B (5, -GGCGACTT TCACTCACAAAC)이며 재조합 PCR 방법 (9) 을 사용하였다.
- PCR DNA를 증폭시키기 위해 사용한 primer는 16S-537F (5'-GGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAA), 16S-786R (5'-CCTGnTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTGAGCG), 16S-791H (5'-CTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATVAGA TACCCTGGTAGTCCACGCCGTAA)와 ASD-B (5, -GGCGACTT TCACTCACAAAC)이며 재조합 PCR 방법 (9) 을 사용하였다. 16S rRNA에 무작위로 염기 치환을 일으키기 위해서 PCR 반응에 0.1 ~0.3 mM MnCq를 첨가하였다. PCR kit는 Perkin Elmer에서 구매 하였으며 , 100㎕의 PCR 반응에는 IX PCR buffer II, 2.
- 3 mM MnCq를 첨가하였다. PCR kit는 Perkin Elmer에서 구매 하였으며 , 100㎕의 PCR 반응에는 IX PCR buffer II, 2.5 mM MgCl2, 250 pM dNTPs, 1)iM primers, 2.5 unit의 AmpliTaq DNA 중합 효소와 15 ng의 pRNA122 플라스미드가 포함되었으며 반응조건은 94℃에서 30초, 53℃에서 30초, 72℃에서 90초의 주기로 30번을 반복하였다. 사용되었던 primer는 16S- 1F (S-AAATTGAAGAGTTTGATCA)와 16S1542R (5'-TAATC CCATGATCCAACCGCAGGITCCCCTACGGITACC) 이었다.
- PRNA122와 pl6ST122의 제작은 보고된 바와 같고(10, 12) pASS2 플라스미드는 pl6ST122의 lacP 유전자에 존재하는 Bell 과 BsrEII 제한효소 자리에 잠재성 돌연변이를 재조합 PCR 방법을 이용해 삽입함으로서 제한효소 인식 부위를 제거하여, 대부분 (약 95%)의 16S rRNA를 코딩하는 부분을 PCR DNA5- 클로닝할 수 있게 제작하였다. 16S rRNA를 코딩하는 부분의 789 위치에 염기치환을 포함한 리보솜을 발현하는 클론을 제작하기 위하여, 이 부분에 염기 치환을 포함한 PCR DNA를 BgZH와 Dralll 제한효소로 분해하여 pRNA122 플라스미드의 같은 제한효소 자리에 클론하였다.
- coli 세포는 Cm에 대한 최소억제농도가 700 ㎍/ml이다. 다음으로 PCR을 통해 증폭한 16S rRNA를 코딩하는 DNA 분자 한 개당 평균 하나의 염기 치환이 무작위로 들어갈 수 있는 PCR 반응의 조건을 설정하기 위하여, Tag DNA 중합효소의 중합반응과정에서 염기 치환을 유발시키는 것으로 알려진 Mn2+-t- PCR 반응에 여러 농도로 포함하여 DNA를 증폭하고 pASS2 플라스미드에 클론하여 이 클론들의 Cm에 대한 저항성을 측정하였다(7). Fig.
- 실험 방법을 개발하였다. 먼저, 16S rRNA의 코딩부분만 무작위로 염기치환을 일으켜서 클론할 수 있는 플라스미드(pASS2) 를 제작하였다. 이 플라스미드는 pUC19에서 유래되었으며, PRNA122 플라스미드보다 한 세포당 플라스미드의 수가 많아 pASS2를 갖고 있는 E.
- 이 변이체 리보솜이 단백질합성과정의 어느 특정 단계에서의 기능 또는 그 기능을 수행하는데 필요한 구조를 상실했는지를 유전학적으로 규명하기 위하여, 이 변이체의 기능을 회복시키는 16S rRNA 상의 이차복귀 돌연변이 (second-site revertant)를 발췌하는 실험 방법을 개발하였다. 먼저, 16S rRNA의 코딩부분만 무작위로 염기치환을 일으켜서 클론할 수 있는 플라스미드(pASS2) 를 제작하였다.
- coli 16S rRNA의 789 와 791 염기가 리보솜의 기능을 위해서 필수적일 수 있다는 가설을 얻을 수 있었다(11). 이 사실을 근거로 하여, pRNA122 플라스미드의 16S rRNA 코딩 부분의 789 위치에 염기치환을 만들어, 변형된 리보솜의 기능을 chloramphenicol (Cm) 에 대한 저항성으로 측정함으로써 789 염기가 리보솜의 기능에 미치는 영향을 측정하였다. 예상했던 바와 같이, 789 위치에서의 염기변형은 리보솜의 기능을 급격히 저하시켰으며, 모든 변이체 리보솜 중에서 U에서 C로의 치환을 포함한 리보솜이 가장 높은 단백질 합성기능을 보였으며, 이 변이체 리보솜을 발현하는 E.
- pRNA122 플라스미드의 lacUV5 프로모터에서 rRNA 합성을 유발하기 위해서 1 mM IPTG가 사용되었다. 최소억제 농도 (minimal inhibitory concentra tion)# 측정하기 위해서는 하룻밤 배양한 세포를 1:100으로 희석시켜 2시간 배양한 뒤에 IPTG를 첨가하여 2~3시간 더 배양한 후, 약 IO, 개의 세포를 여러 농도의 chloramphenicol (0, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600 μg/ml)을 포함한 LB배지에 접종하여 24시간 동안 배양하여 세포의 성장을 완전히 억제하는 최소한의 chloramphenicol 농도를 결정하였다.
- 이 결과로 16S rRNA의 코딩 부분이 MW+농도에 따라서 염기 치환이 유발되었음을 알 수 있었다. 하나의 PCR DNA 분자당 평균 염기 치환 수를 알아보기 위하여 0.1 mM M* n을 포함한 반응에서 얻은 PCR DNA를 간직한 20개 클론들의 염기 배열을 분석하였다. 전체 1, 542 뉴클레오티드의 16S rRNA 코딩 부분의 ~90%에 해당하는 부분을 분석한 결과, 하나의 클론에 0~3개의 염기 치환이 일어났음을 알 수 있었다(Table 1).
대상 데이터
- coli DH5 (supEM, hsdRXl, recAl, endAl, gyrA96, thi-1)에서 유지하였으며 ampicillin (100 μg/ml)을함유한 LB 배지에서 배양하였다. pRNA122 플라스미드의 lacUV5 프로모터에서 rRNA 합성을 유발하기 위해서 1 mM IPTG가 사용되었다. 최소억제 농도 (minimal inhibitory concentra tion)# 측정하기 위해서는 하룻밤 배양한 세포를 1:100으로 희석시켜 2시간 배양한 뒤에 IPTG를 첨가하여 2~3시간 더 배양한 후, 약 IO, 개의 세포를 여러 농도의 chloramphenicol (0, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600 μg/ml)을 포함한 LB배지에 접종하여 24시간 동안 배양하여 세포의 성장을 완전히 억제하는 최소한의 chloramphenicol 농도를 결정하였다.
- 5 unit의 AmpliTaq DNA 중합 효소와 15 ng의 pRNA122 플라스미드가 포함되었으며 반응조건은 94℃에서 30초, 53℃에서 30초, 72℃에서 90초의 주기로 30번을 반복하였다. 사용되었던 primer는 16S- 1F (S-AAATTGAAGAGTTTGATCA)와 16S1542R (5'-TAATC CCATGATCCAACCGCAGGITCCCCTACGGITACC) 이었다.
이론/모형
- 16S rRNA를 코딩하는 부분의 789 위치에 염기치환을 포함한 리보솜을 발현하는 클론을 제작하기 위하여, 이 부분에 염기 치환을 포함한 PCR DNA를 BgZH와 Dralll 제한효소로 분해하여 pRNA122 플라스미드의 같은 제한효소 자리에 클론하였다. PCR DNA를 증폭시키기 위해 사용한 primer는 16S-537F (5'-GGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAA), 16S-786R (5'-CCTGnTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTGAGCG), 16S-791H (5'-CTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATVAGA TACCCTGGTAGTCCACGCCGTAA)와 ASD-B (5, -GGCGACTT TCACTCACAAAC)이며 재조합 PCR 방법 (9) 을 사용하였다. 16S rRNA에 무작위로 염기 치환을 일으키기 위해서 PCR 반응에 0.
성능/효과
- Fig. 2에서 보는 바와 같이 PCR 반응에 포함된 Mr?+의 농도가 0에서 0.3 mM로 증가함에 따라, PCR DNA가 삽입된 pASS2 플라스미드를 가진 E. colt 세포의 Cm에 대한 저항성이 감소함을 관찰하였다. 이 결과로 16S rRNA의 코딩 부분이 MW+농도에 따라서 염기 치환이 유발되었음을 알 수 있었다.
- coli 세포의 Cm에 대한 최소억제농도는 600 ㎍/ml에서 300 ㎍/ml로 감소하였다 (그림 1C). U에서 A 또는 G로의 염기 치환을 포함한 변이체 리보솜을 발현하는 E. coli 세포의 Cm에 대한 최소억제농도는 600㎍/ml에서 50~75 ㎍/ml로 감소되어, 789 염기의 교차형 변이 (transversion)가 리보솜의 단백질 합성기능을 상대적으로 더욱저하시킴을 보였다. 이 결과는 789 염기가 리보솜의 단백질 합성 수행능력에 중요한 역할을 한다는 것을 암시한다.
- 이 사실을 근거로 하여, pRNA122 플라스미드의 16S rRNA 코딩 부분의 789 위치에 염기치환을 만들어, 변형된 리보솜의 기능을 chloramphenicol (Cm) 에 대한 저항성으로 측정함으로써 789 염기가 리보솜의 기능에 미치는 영향을 측정하였다. 예상했던 바와 같이, 789 위치에서의 염기변형은 리보솜의 기능을 급격히 저하시켰으며, 모든 변이체 리보솜 중에서 U에서 C로의 치환을 포함한 리보솜이 가장 높은 단백질 합성기능을 보였으며, 이 변이체 리보솜을 발현하는 E. coli 세포의 Cm에 대한 최소억제농도는 600 ㎍/ml에서 300 ㎍/ml로 감소하였다 (그림 1C). U에서 A 또는 G로의 염기 치환을 포함한 변이체 리보솜을 발현하는 E.
- coli 세포의 Cm에 대한 최소억제농도는 600㎍/ml에서 50~75 ㎍/ml로 감소되어, 789 염기의 교차형 변이 (transversion)가 리보솜의 단백질 합성기능을 상대적으로 더욱저하시킴을 보였다. 이 결과는 789 염기가 리보솜의 단백질 합성 수행능력에 중요한 역할을 한다는 것을 암시한다.
- colt 세포의 Cm에 대한 저항성이 감소함을 관찰하였다. 이 결과로 16S rRNA의 코딩 부분이 MW+농도에 따라서 염기 치환이 유발되었음을 알 수 있었다. 하나의 PCR DNA 분자당 평균 염기 치환 수를 알아보기 위하여 0.
- 1 mM M* n을 포함한 반응에서 얻은 PCR DNA를 간직한 20개 클론들의 염기 배열을 분석하였다. 전체 1, 542 뉴클레오티드의 16S rRNA 코딩 부분의 ~90%에 해당하는 부분을 분석한 결과, 하나의 클론에 0~3개의 염기 치환이 일어났음을 알 수 있었다(Table 1). 이 결과를 이용하여, 789 위치에 염기치환을 가지고 있는 변이체 리보솜의 단백질 합성 기능을 회복시키는 이차복귀 돌연변이(second-site revertant)를 발췌하는 실험을 수행 중에 있으며, 발췌된 이차복귀 돌연변이는 789 염기가 단백질 합성과정에서 16S rRNA의 어떤 다른 부분과 결합을 하는지, 그러한 결합으로 이루어지는 구조의 기능이 무엇인지 등에 관한 구체적인 단백질 합성기작 연구에 도움이 될 것으로 기대한다.
후속연구
- 전체 1, 542 뉴클레오티드의 16S rRNA 코딩 부분의 ~90%에 해당하는 부분을 분석한 결과, 하나의 클론에 0~3개의 염기 치환이 일어났음을 알 수 있었다(Table 1). 이 결과를 이용하여, 789 위치에 염기치환을 가지고 있는 변이체 리보솜의 단백질 합성 기능을 회복시키는 이차복귀 돌연변이(second-site revertant)를 발췌하는 실험을 수행 중에 있으며, 발췌된 이차복귀 돌연변이는 789 염기가 단백질 합성과정에서 16S rRNA의 어떤 다른 부분과 결합을 하는지, 그러한 결합으로 이루어지는 구조의 기능이 무엇인지 등에 관한 구체적인 단백질 합성기작 연구에 도움이 될 것으로 기대한다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.