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문제 정의
- 본 연구에서는 서울에 음용 부적합이 반복적인 양상을 보이는 중점관리 약수터를 대상으로 지표세균에 대하여 분포 현황과 검출된 세균의 유전학적인 계통분석을 수행하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 서울시 소재 약수터에 대한 지표세균의 조사 및 검출특성 연구를 위해 최근 1년간 4회 이상 반복 부적합 등의 사유로 인해 집중 관리대상으로 지정된 약수터에 대해 조사하였다. 봄철 조사는 2012년 4~6월까지 64개소이며, 2차 조사는 여름철에 해당하는 8월에 70개소에 대해 실시하였다.
제안 방법
- 등을 포함하고 있는 세균을 지칭하며, 사람과 동물 배설물을 통해 배출되지만 모든 세균이 분변에서 유래하지는 않는다.15) 약수터에서 검출된 총대장균군 집락을 16S rRNA 유전자 분석후 NCBI에서 제공하는 BLAST 프로그램을 이용하여 99% 이상의 상동성을 나타내는 세균을 봄과 여름으로 나누어 각각 동정16)하였다(Fig. 1).
- 5) 시퀀싱 반응은 ABI PRISM BigDye™ Term inator Cycle Sequencing Kits(Applied Biosystems)을 이용하여 진행하였으며 PTC-225 Peltier Thermal Cycler(MJ Research)를 사용하여 PCR 반응을 진행하였고, 반응물 2 µL를 1% agarose gel에 전기영동하여 약 1.5 kbp 크기를 확인하였다.
- 5 kbp 크기를 확인하였다.6) 정제된 PCR product는 3차 증류수에 다시 녹여 ABI PRISM 3730XL Analyzer에서 분석을 하였다. 분석된 염기서열을 이용한 총대장균군 동정은 미국 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에서 제공하는 BLAST를 이용하여 염기서열 상등비율을 99%이상으로 하였다.
- planticola(NR024996), Buttiauxella brennerae(AJ233401), Leclercia adecarboxylata (JX501721), Rahnella aquatilis(NR025337)를 이용한 총대장균군계통8)과 Aeromonas hydrophila (AJ508765)을 총대장균군 계통 외(outgroup)로 지정하여 계통수를 제작하였다.9) 한편 계통수의 정확성을 판단하기 위해 표준 균주인 Escherichia coli ATCC9001(This study)과 Enterobacter aerogenes ATCC10006(This study)를 염기서열 분석 후 계통수 분석에 삽입하였다. 제작된 계통수에 시료로부터 분석된 염기서열 자료를 삽입10)하여 Neighbor-Joining 연산법11)으로 1,000회 반복하여 신뢰도를 확보하고 CLUSTAL-W 방법12)으로 정렬된 결과를 얻은 후 MEGA5 프로그램을 이용하여 계통분석을 실시하였다.
- 5)℃에서 24시간 배양한 다음 진한 노란색을 발색하는 부분을 총대장균군 양성으로 판정하였고, 360 nm UV 파장에서 형광 빛을 발색하는 부분을 대장균 양성으로 판정하였다. 각각은 양성 웰(well)수를 산출하여 최적확수법(most probable number, MPN)으로 정량적인 수치(MPN/100 mL)를 나타냈다.
- 검사방법은 지표세균인 총대장균군, 분원성 대장균군 및 대장균의 경우 환경부에서 고시한 수질오염 공정시험기준을 사용하였으며,3) 일반세균 및 여시니아는 먹는물수질공정시험기준에 준하여 실험하였다.4)
- 대장균은 제조사의 지시에 따라 Quanti-Tray 2000(IDEXX, USA)을 이용하여 정량범위가 2400이하가 되도록 시료를 희석하여 (35±0.5)℃에서 24시간 배양한 다음 진한 노란색을 발색하는 부분을 총대장균군 양성으로 판정하였고, 360 nm UV 파장에서 형광 빛을 발색하는 부분을 대장균 양성으로 판정하였다.
- 따라서 본 연구는 최근 반복적인 음용 부적합으로 중점관리가 필요한 서울 소재 약수터에 대해 봄과 여름철로 나누어 지표세균 현황을 파악하고 검출된 총대장균군에 대한 16S rRNA 분석 등을 통해 출현빈도가 높은 미생물을 분류하였다.
- 먹는물 수질기준에서는 총대장균군, 분원성대장균군 및 대장균 항목에 대해 검출 유무로만 판단기준을 정하고 있어 약수터에서 검출되더라도 농도는 파악할 수 없어 농도 계산이 가능한 막여과법 및 최적확수법을 이용하여 분석대상시료를 정량분석 하였 으며, 이를 각각 봄철 및 여름철 시료로 구분하여 지표세균 검출농도 범위 별로 분포율을 나타내었다(Table 2). 일반세균의 경우 봄철의 경우 1~10 CFU/mL 분석대상 시료 중 43.
- 배양 후 여과지 위에 형성된 전형적인 금속성 광택을 나타내는 콜로니를 계수하여 100 mL당 총대장균군 수치로 정량하였고, 분원성대장균군은 선택배지인 m-FC(Difco, USA)를 사용하여 (44.5±0.2)℃ 인큐베이터에서 (24±2)시간 배양한 후 여과지 위에 형성된 전형적인 파란색 콜로니를 계수하여 100 mL 당 분원성대장균군 수치로 정량하였다.
- 봄철 조사는 2012년 4~6월까지 64개소이며, 2차 조사는 여름철에 해당하는 8월에 70개소에 대해 실시하였다. 시료채취는 무균 채수병에 4리터씩 각각 채수하여 일반세균, 총대장균군, 분원성대장균군 및 대장균을 정량 분석하였으며, 여시니아는 정성 분석하였다.
- 약수터 시료 중 막여과법에 의해 총대장균군으로 확정된 세균을 16S rRNA gene으로 동정하기 위해 검출세균농도를 감안하여 각각의 시료에 대해 1~10개 정도의 콜로니를 순수분리 배양하여 분리된 균을 TSA에 획선 접종 배양한 후 염기서열 분석을 (주)마크로젠에 의뢰하였다. 의뢰된 cell에서 genomic DNA 를 추출한 후 16S rDNA gene을 증폭하기 위해 사용한 primer인 27F(5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCA-3')와 1492R(5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3')로 end sequencing을 수행한 후 얻은 결과물은 internal primer인 518F(5'-CCAGCAGCCGCGGTAATACG-3')와 800R(5'-TACC AGGGTATCTAATC-3')을 사용하였다.
- 약수터 총대장균군 검출 세균에 대한 동정결과 NCBI에서 제공하는 BLAST 프로그램을 이용하여 99% 이상의 상동성을 나타내는 세균중 비 배양된 (Uncultured) 세균으로 동정되거나 정확한 세균으로 분류되지 않는 시료를 포함하여 총대장균군 계통분석을 수행하여 유사한속 그룹으로 분류22)하였다(Fig. 2).
- 약수터의 지표세균의 정량화를 위해 시료분석량을 100 mL로 조정하여 총대장균군, 분원성대장균군 및 대장균을 분석하였다. 총대장균군과 분원성대장균군은 막 여과장치(Millipore Microfil system, USA)을 이용하여 직경 47 mm, 여과경 0.
- 서울시에 위치하고 있는 중점관리 약수터를 대상으로 봄과 여름에 걸쳐 지표세균을 조사하였다. 지표세균 모니터링 항목은 기존 먹는물 수질공정시험 기준에 정하고 있는 방법을 사용하여 일반세균과 여시니아에 대하여 실험하였으며 총대장균군, 분원성 대장균군 및 대장균은 정량실험을 하여 약수터 오염수준14)을 파악하였다.
- 지표세균에 대한 먹는물 수질기준에서 정한 음용으로써의 적합성여부는 일반세균은 100 CFU/mL 이하, 총대장균군과 분원성대장균군 및 대장균은 100 mL 당 검출유무, 여시니아는 2L 검출유무로 평가하였다(Table 1). 적합성 여부를 약수터 시료에 대해서 봄과 여름으로 구분하여 적용하면 여시니아를 제외한 일반세균은 3지점에서 4지점으로, 총대장균군은 49지점에서 58지점으로 다소 증가 하였으며, 분원성대장균군 및 대장균의 경우는 봄에 비해 여름에 증가 하는 경향이 뚜렷하게 나타나는 것을 확인하였다.
- 총대장균군 계통분석을 실시하기 위해 GenBank에 등재되어 있는 Escherichia coli ATCC 11775(accession no. X80725), E. coli O157:H7(HQ658163), Shigella dysenteriae(X96966), Citrobacter freundii(AJ233408), C. braakii(AF025368), Enterobacter aerogenes(AB004750), E. aerogenes(FJ823005), E. cloacae ATCC 13047T(AJ251469), Hafnia alvei (M59155), Klebsiella pneumoniae(X87276), K. pneumoniae ATCC13884(Y17657), Serratia marcescens (AJ233431), S. rubidaea(AJ233436), Raoultella ornithinolytica(U78182), R. planticola(NR024996), Buttiauxella brennerae(AJ233401), Leclercia adecarboxylata (JX501721), Rahnella aquatilis(NR025337)를 이용한 총대장균군계통8)과 Aeromonas hydrophila (AJ508765)을 총대장균군 계통 외(outgroup)로 지정하여 계통수를 제작하였다.9) 한편 계통수의 정확성을 판단하기 위해 표준 균주인 Escherichia coli ATCC9001(This study)과 Enterobacter aerogenes ATCC10006(This study)를 염기서열 분석 후 계통수 분석에 삽입하였다.
- 총대장균군과 분원성대장균군은 막 여과장치(Millipore Microfil system, USA)을 이용하여 직경 47 mm, 여과경 0.45 µm 크기의 멸균된 멤브레인 필터에 집락수가 20~80개가 되도록 희석한 시료를 각각 여과하였고, 대장균은 효소발색기질을 이용하는 Coliert kit(IDEXX, USA)를 사용하여 분석하였다.
- 총대장균군은 수질오염공정시험기준에 따른 선택 배지인 m-ENDO(Difco, USA) 고체배지에 올려놓고 충분히 배지에 스며들도록 정치한 후 페트리디쉬를 뒤집어 (35.0±0.5)℃ 인큐베이터에서 (24±2)시간 배양하였다.
- 총대장균군이 검출된 약수터에 대해 검출농도를 감안하여 전형적인 콜로니를 봄철 총대장균군이 검출된 49개 지점에서 110개 시료를 여름철 검출된 58개 지점에서 301개 시료를 순수 분리 배양하였으며, 동정 결과는 Bergy’s manual에 따라 총대장균군 그룹의 특성으로 분류 할 수 있는17) 동정결과로 약수터에서 출현하는 총대장균군으로 분류하였다.
- 한편 일반세균 정량은 Plate Count Agar(Difco, USA) 배지를 사용하여 시료 1 mL를 (35±0.5)℃ 인큐베이터에서 (48±2)시간 배양한 후 형성되는 콜로니를 계수하였으며, 여시니아 검출은 CIN 및 m-MC 고체배지를 사용하여 시료 1L씩 여과한 후 20℃ 인큐베이터에서 48시간 배양한 후 전형적인 콜로니에 대해 예비동정실험과 API 20E kit를 사용하여 최종 확정하였다.
대상 데이터
- 서울시 소재 약수터에 대한 지표세균의 조사 및 검출특성 연구를 위해 최근 1년간 4회 이상 반복 부적합 등의 사유로 인해 집중 관리대상으로 지정된 약수터에 대해 조사하였다. 봄철 조사는 2012년 4~6월까지 64개소이며, 2차 조사는 여름철에 해당하는 8월에 70개소에 대해 실시하였다. 시료채취는 무균 채수병에 4리터씩 각각 채수하여 일반세균, 총대장균군, 분원성대장균군 및 대장균을 정량 분석하였으며, 여시니아는 정성 분석하였다.
- 서울시에 위치하고 있는 중점관리 약수터를 대상으로 봄과 여름에 걸쳐 지표세균을 조사하였다. 지표세균 모니터링 항목은 기존 먹는물 수질공정시험 기준에 정하고 있는 방법을 사용하여 일반세균과 여시니아에 대하여 실험하였으며 총대장균군, 분원성 대장균군 및 대장균은 정량실험을 하여 약수터 오염수준14)을 파악하였다.
- 의뢰된 cell에서 genomic DNA 를 추출한 후 16S rDNA gene을 증폭하기 위해 사용한 primer인 27F(5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCA-3')와 1492R(5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3')로 end sequencing을 수행한 후 얻은 결과물은 internal primer인 518F(5'-CCAGCAGCCGCGGTAATACG-3')와 800R(5'-TACC AGGGTATCTAATC-3')을 사용하였다.
데이터처리
- 9) 한편 계통수의 정확성을 판단하기 위해 표준 균주인 Escherichia coli ATCC9001(This study)과 Enterobacter aerogenes ATCC10006(This study)를 염기서열 분석 후 계통수 분석에 삽입하였다. 제작된 계통수에 시료로부터 분석된 염기서열 자료를 삽입10)하여 Neighbor-Joining 연산법11)으로 1,000회 반복하여 신뢰도를 확보하고 CLUSTAL-W 방법12)으로 정렬된 결과를 얻은 후 MEGA5 프로그램을 이용하여 계통분석을 실시하였다.13)
성능/효과
- 1%가 음용 목적으로 약수터를 이용하고 있는 것으로 나타났다.1) 서울은 2011년 말 기준으로 276개소의 약수터를 각 구청에서 시설유지 및 수질관리를 담당하고 있다. 약수터를 이용하는 시민들에게 안전한 음용을 위해 매분기마다 수질검사를 실시하여 먹는 물 공동시설 수질기준 검사 결과에 따라 음용 적합 여부를 판단하여 사용 안내하고 있다.
- 1. 중점관리 약수터에 대한 지표세균의 조사 결과 일반세균은 봄철 64개소에서 0~550 CFU/mL이고 여름철 70개소에서 0~800 CFU/mL로 조사되었으며 총 대장균군의 정량분석 결과는 봄과 여름철에 각각 0~1,900, 0~2,100 CFU/100 mL로, 분원성대장균군의 경우 0~600, 0~550 CFU/100 mL로, 대장균의 경우는 0~37, 0~326 MPN/100 mL로 조사됐다. 한편 여시니아는 조사대상 중 봄철 3건이 검출되었으며 여름철에는 1건이 검출되었다.
- 2. 분변오염 지표세균인 분원성대장균군 검출은 봄철 12.5%에 비해 여름철 58.6%로, 대장균은 4.7%에서 51.4 %로 검출률이 증가하는 경향을 나타내어 기온이 상승하는 여름철 약수터 음용 부적합 요인이 상대적으로 상승하는 것으로 나타나 분변오염 가능성에 따른 음용에 각별한 주의가 요구되는 것으로 판단되었다.
- 3. 지표 세균에 의한 약수터 음용 기준 부적합 유형은 봄철의 경우 총대장균군이 59.4%로 주요 원인으로 나타났지만 여름철의 경우는 같은 시료에 대해 총대장균군, 분원성대장균군 및 대장균이 동시 복합적으로 검출되는 비율이 47.1%로 주요 원인으로 나타나 여름철 약수터 분변오염원 유입에 대해 취약한 것으로 판단되었다.
- 6%, Citrobacter spp. 3.0% 순으로 동정되었으며, 분변오염지표항목인 Escherichia coli 가 봄에 비해 여름철에 상대적으로 증가하여 건강 위해 가능성이 높은 것으로 판단되었다.
- 등의 순서로 유사한 속으로 분류되었다(Table 4). 계통분석에 의한 총대장균군 그룹의 분류에서도 마찬가지로 분변오염 지표항목인 Escherichia coli가 봄 4.5%에서 여름 13.6%로 증가하는 것을 확인하여 공중 보건학상 여름철 약수터 음용에 각별한 주의가 요구되는 것으로 판단하였다. 계통분석을 이용하여 유사한 그룹으로 분류된 총대장균군은 기존 비 배양된 세균이나 동정 속명을 알수 없는 자료를 분류할 수 있었으며 약수터 검출 총 대장균군의 그룹을 분류하는데 도움이 될 것으로 판단하였다.
- 6%로 증가하는 것을 확인하여 공중 보건학상 여름철 약수터 음용에 각별한 주의가 요구되는 것으로 판단하였다. 계통분석을 이용하여 유사한 그룹으로 분류된 총대장균군은 기존 비 배양된 세균이나 동정 속명을 알수 없는 자료를 분류할 수 있었으며 약수터 검출 총 대장균군의 그룹을 분류하는데 도움이 될 것으로 판단하였다.
- 6) 정제된 PCR product는 3차 증류수에 다시 녹여 ABI PRISM 3730XL Analyzer에서 분석을 하였다. 분석된 염기서열을 이용한 총대장균군 동정은 미국 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에서 제공하는 BLAST를 이용하여 염기서열 상등비율을 99%이상으로 하였다.7)
- 1%로 감소하였다. 이와 관련하여 여름철 약수터 지표세균 검출유형을 살펴보면 총대장균군, 분원성대장균군 및 대장균이 동시에 검출되는 경우는 47.1%로, 총대장균군과 분원성대장균군 동시검출은 15.7%로 봄철과 같은 지표세균 검출유형이 각각 4.7%인 것을 감안하면 여름철 약수터 분변 오염 지표세균인 분원성대장균군과 대장균이 크게 증가하여 분변오염유입에 대해 취약한 것으로 판단하였다.
- 지표세균에 대한 먹는물 수질기준에서 정한 음용으로써의 적합성여부는 일반세균은 100 CFU/mL 이하, 총대장균군과 분원성대장균군 및 대장균은 100 mL 당 검출유무, 여시니아는 2L 검출유무로 평가하였다(Table 1). 적합성 여부를 약수터 시료에 대해서 봄과 여름으로 구분하여 적용하면 여시니아를 제외한 일반세균은 3지점에서 4지점으로, 총대장균군은 49지점에서 58지점으로 다소 증가 하였으며, 분원성대장균군 및 대장균의 경우는 봄에 비해 여름에 증가 하는 경향이 뚜렷하게 나타나는 것을 확인하였다. 특히 분변오염 지표항목인 분원성대장균군 검출은 봄철 분석대상 시료 중 8개소(12.
- 한편 여시니아는 조사대상 중 봄철 3건이 검출되었으며, 여름철에는 1건이 검출되 었다(Table 1). 조사기간에 따른 지표세균 검출은 평균농도를 이용하여 비교한 결과 강우량이 많아지고 온도가 상승하는 여름철에 일반세균, 총대장균군, 대장균의 검출농도가 각각 높아지는 것을 확인할 수 있었으며 분원성대장균군도 마찬가지로 최대값을 제외한 결과로 살펴보았을 때 평균 2.6에서 5.5 CFU/100 mL로 상승하는 것을 확인하였다.
- 중점관리 약수터에 대한 지표세균 조사 결과 일반 세균은 봄철 64개소 조사 대상으로 0~550 CFU/mL 이고 여름철 70개소 조사 대상으로 0~800 CFU/mL 로 조사되었으며, 조사 대상 약수터의 봄철 평균은 30.7 CFU/mL이고 여름철은 45.2 CFU/mL로 여름철에 증가하는 경향을 나타냈다. 총대장균군의 정량분석 결과는 봄과 여름철에 각각 0~1,900 CFU/100 mL, 0~2,100 CFU/100mL로 평균값은 82.
- 총대장균군 그룹으로 분류 특정할 수 없었던 시료들은 계통분석결과 대부분 총대장균군 그룹으로 분류되었으며 총대장균군 그룹에는 속할 것으로 판단되어지나 특징적인 명칭으로 분류되지 않는 시료는 Enterobacteriacae(Family)로 분류하였다. 계통분석에서 이를 포함한 시료들을 계통학적으로 유사한 그룹으로 분류한 결과 봄철의 경우 Enterobacter spp.
- 2 CFU/mL로 여름철에 증가하는 경향을 나타냈다. 총대장균군의 정량분석 결과는 봄과 여름철에 각각 0~1,900 CFU/100 mL, 0~2,100 CFU/100mL로 평균값은 82.4 CFU/ 10 0mL, 128.3 CFU/100mL로 조사됐다. 분원성대장균군의 경우 0~600 CFU/100 mL, 0~550 CFU/100 mL로 평균값은 13.
- 적합성 여부를 약수터 시료에 대해서 봄과 여름으로 구분하여 적용하면 여시니아를 제외한 일반세균은 3지점에서 4지점으로, 총대장균군은 49지점에서 58지점으로 다소 증가 하였으며, 분원성대장균군 및 대장균의 경우는 봄에 비해 여름에 증가 하는 경향이 뚜렷하게 나타나는 것을 확인하였다. 특히 분변오염 지표항목인 분원성대장균군 검출은 봄철 분석대상 시료 중 8개소(12.5%)로 나타난 것에 비해 여름철 41개소(58.6%)로, 대장균은 3개소(4.7%)에서 36개소(51.4%)로 증가하여 기온이 상승하는 여름철 약수터 음용 부적합 요인이 상대적으로 상승하는 것으로 나타나 분변오염 가능성에 따른 음용에 각별한 주의가 요구되는 것으로 판단되었다. 한편 Table 3과 같이 약수터 개별지점에서 지표세균 검출에 따른 지표세균 부적합 유형을 살펴보면 봄철의 경우 총대장균군 단일항목 검출이 59.
- 4%로 높게 나타났다. 특히 분원성대장균 군과 대장균이 봄철에 비해 여름철에 검출빈도 및 농도가 증가하는 경향이 뚜렷하게 높아지는 것을 확인 할 수 있었으며 이러한 세균들이 분변오염지표세균인 점을 감안할 때 여름철 약수터 이용에 각별한 주의가 요구되는 것으로 판단되었다.
후속연구
- 5. 시민들이 자주 이용하는 약수터는 특히 여름철 지표세균에 의한 오염이 분변에서 유래 가능성이 증가하는 점을 감안할 때 오염원 제거 및 지속적인 수질 조사를 통해 음용 관리를 위한 제도적 보완이 세심한 주의가 필요할 것으로 판단되었다.
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