암을 치료하는 과정에서 사용하는 방사선조사와 화학요법제 처리는 암세포뿐만 아니라 정상세포에도 심각한 손상을 일으킨다. 이 연구에서는 정상세포의 손상을 최소화하고 암세포을 효과적으로 죽일 수 있는 방법을 찾기 위하여 항암과 항산화 효능이 알려진 녹차 추출물, Epigalocatechin-gallate(Green Tea EGCG)의 혈액암 세포 성장억제 및 사멸촉진 효능을 조사하였다. 혈액암 세포주인 HL-60 세포와 정상면역세포주인 NC-37세포에 녹차의 EGCG를 농도별 처리하고, 방사선을 조사하여 세포사멸에 미치는 영향을 조사하였다. 녹차 EGCG는 정상세포의 성장에는 영향을 미치지 않는 반면 적정농도에서 종양 세포주의 성장을 억제하였다. 녹차 EGCG를 처리한 뒤 방사선조사를 병행하면 종양 세포주는 방사선만 단독 조사한 군에 비해 녹차 EGCG를 첨가한 군에서 세포사멸 효과가 상승적으로 증가하였다. 그 효과는 저선량 방사선조사 시에 EGCG를 $50\;{\mu}g/ml$ 이상의 농도로 처리할 때 가장 크게 나타났다. 이상의 결과로 미루어 볼 때 혈액암을 포함한 각종 암의 방사선 치료시, 녹차의 음용 또는 녹차 EGCG을 병행 처리를 통해서 암세포(Leukemia cell)의 사멸을 촉진하고 정상세포를 보호하여 더 낳은 치료효과를 기대할 수 있을 것으로 추정된다.
암을 치료하는 과정에서 사용하는 방사선조사와 화학요법제 처리는 암세포뿐만 아니라 정상세포에도 심각한 손상을 일으킨다. 이 연구에서는 정상세포의 손상을 최소화하고 암세포을 효과적으로 죽일 수 있는 방법을 찾기 위하여 항암과 항산화 효능이 알려진 녹차 추출물, Epigalocatechin-gallate(Green Tea EGCG)의 혈액암 세포 성장억제 및 사멸촉진 효능을 조사하였다. 혈액암 세포주인 HL-60 세포와 정상면역세포주인 NC-37세포에 녹차의 EGCG를 농도별 처리하고, 방사선을 조사하여 세포사멸에 미치는 영향을 조사하였다. 녹차 EGCG는 정상세포의 성장에는 영향을 미치지 않는 반면 적정농도에서 종양 세포주의 성장을 억제하였다. 녹차 EGCG를 처리한 뒤 방사선조사를 병행하면 종양 세포주는 방사선만 단독 조사한 군에 비해 녹차 EGCG를 첨가한 군에서 세포사멸 효과가 상승적으로 증가하였다. 그 효과는 저선량 방사선조사 시에 EGCG를 $50\;{\mu}g/ml$ 이상의 농도로 처리할 때 가장 크게 나타났다. 이상의 결과로 미루어 볼 때 혈액암을 포함한 각종 암의 방사선 치료시, 녹차의 음용 또는 녹차 EGCG을 병행 처리를 통해서 암세포(Leukemia cell)의 사멸을 촉진하고 정상세포를 보호하여 더 낳은 치료효과를 기대할 수 있을 것으로 추정된다.
During cancer therapy, gamma-ray irradiation and treatment of anti-cancer chemicals destroy the normal cells as well as cancer cells. In this study, we investigated the effect of epigallocathechin-gallate(EGCG) extracted from green tea, which is known to have anti-cancer and anti-oxident activities,...
During cancer therapy, gamma-ray irradiation and treatment of anti-cancer chemicals destroy the normal cells as well as cancer cells. In this study, we investigated the effect of epigallocathechin-gallate(EGCG) extracted from green tea, which is known to have anti-cancer and anti-oxident activities, in order to find out the feasible method to protect the normal cells and to kill the cancer cells efficiently. We investigated the effect of EGCG on the leukemia cell growth and cell necrosis, especially when treated along with gamma radiation. The EGCG inhibited the leukemia cell, HL-60, growth at the appropriate concentration while it exhibited no influence on the normal cell growth. More significantly, it enhanced leukemia cell necrosis when its treatment was combined with gamma irradiation. Simultaneous treatment of EGCG and gamma radiation increased leukemia cell necrosis up to 35% compared with separate treatments. These results suggest that drinking of green tea or co-treatment of EGCG during gamma irradiation therapy may result in better prognosis through enhancement of the tumor cell necrosis and protection of the normal cells.
During cancer therapy, gamma-ray irradiation and treatment of anti-cancer chemicals destroy the normal cells as well as cancer cells. In this study, we investigated the effect of epigallocathechin-gallate(EGCG) extracted from green tea, which is known to have anti-cancer and anti-oxident activities, in order to find out the feasible method to protect the normal cells and to kill the cancer cells efficiently. We investigated the effect of EGCG on the leukemia cell growth and cell necrosis, especially when treated along with gamma radiation. The EGCG inhibited the leukemia cell, HL-60, growth at the appropriate concentration while it exhibited no influence on the normal cell growth. More significantly, it enhanced leukemia cell necrosis when its treatment was combined with gamma irradiation. Simultaneous treatment of EGCG and gamma radiation increased leukemia cell necrosis up to 35% compared with separate treatments. These results suggest that drinking of green tea or co-treatment of EGCG during gamma irradiation therapy may result in better prognosis through enhancement of the tumor cell necrosis and protection of the normal cells.
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문제 정의
본 실험은 항산화, 항암작용 등 여러 작용 가능성을 가지고 있는 것으로 알려진 녹차 추출성분 중 특히 주요 활성 물질인 EGCG를 이용하여 정상 면역세포와 종양 세포주에 대하여 EGCG의 처리가 세포성장에 어떤 영향을 미치는지 관찰하고 방사선조사와 병행하여 EGCG를 처리하였을 때 암세포 사멸효과가 어떻게 나타나는 지를 조사하였다.
제안 방법
세포주를 15 ml 원심분리 관에 넣고 Penicillin-streptomycin과 Fungizone 및 10% FBS가 포함된 RPMI 1640에 넣어서 800 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 2회 정도 반복하여 세포주에 있는 DMSO를 세척하여 제거시킨 후 10% FBS가 포함된 RPMI 1640 배양액에 세포 수를 2 × 104ml 정도로 조정한 후 culture flask에 넣어서 섭씨 37℃, 5% 이산화탄소를 포함한 배양기 내에서 배양하였다. 세포수가 지나치게 많아지면 세포를 원심분리하여 배양액을 교환하고 3~4일에 한 번씩 숫자를 줄여서 계대 배양하였다.
가볍게 혼합한 다음 37℃에서 5% CO2 배양기 및 100% 습도의 조건에서 48시간 또는 72시간 동안 배양하였다. 배양된 세포는 XTT kit(Roche, Swiss)를 이용하여 각각의 생존율을 측정하였다. 대조군에는 약물대신 50μl의 배양액을 넣었다.
2회 정도 반복하여 세척한 후 상층액을 버리고 침전세포에 10% FBS가 포함된 RPMI 1640 배양액을 넣어 세포수를 5×104/100 μl정도로 세포수를 조절하였다. 15ml 원심분리관에 4개 조절된 세포를 5ml씩 각각 넣고 대조세포(control cell)를 제외한 다른 3개의 세포에 혈액조사 장치인 Gammacell로 각각 3 Gy(300 rad), 5 Gy(500 rad), 7 Gy(700 rad) 조사하였다. 조사된 세포를 96 well plate의 각 well 에 100 씩분주한 다음 37℃에서 5% CO2 배양기 및 100% 습도의 조건에서 48시간 배양 그리고 72시간 배양하였다.
조사된 세포를 96 well plate의 각 well 에 100 씩분주한 다음 37℃에서 5% CO2 배양기 및 100% 습도의 조건에서 48시간 배양 그리고 72시간 배양하였다. 배양된 혈구암세포를 XTT kit를 이용하여 생존율을 측정하였다.
FBS가 포함된 RPMI 1640에 넣어 800 rpm에서 5분 동안 원심분리 하였다. 2회 정도 세척을 반복한 후 상층 액을 버리고 침전세포에 20% FBS가 포함된 RPMI 1640 배양액으로 세포수를 5×104/100 μl로 조정한 후 조정된 세포를 15 ml 원심분리관 4개에 각각 3ml씩 분주하고 여기에 EGCG 희석액(40 μg/ml, 50 μg/ml, 60μg/ml, 농도별로 희석한 EGCG 용액)을 각 농도별로 3ml씩 분주하여 가볍게 흔들어 잘 혼합한 후에 37℃, 100% 습도를 유지하여 5% 이산화탄소를 포함한 배양기 내에서 6시간 배양하였다. 6시간 배양된 세포주를 비교 세포(control cell)를제외한 다른 3개의 세포에 혈액조사 장치인 Gammacell로 각각 3Gy(300rad), 5 Gy(500 rad), 7 Gy(700 rad) 조사하였다.
2회 정도 세척을 반복한 후 상층 액을 버리고 침전세포에 20% FBS가 포함된 RPMI 1640 배양액으로 세포수를 5×104/100 μl로 조정한 후 조정된 세포를 15 ml 원심분리관 4개에 각각 3ml씩 분주하고 여기에 EGCG 희석액(40 μg/ml, 50 μg/ml, 60μg/ml, 농도별로 희석한 EGCG 용액)을 각 농도별로 3ml씩 분주하여 가볍게 흔들어 잘 혼합한 후에 37℃, 100% 습도를 유지하여 5% 이산화탄소를 포함한 배양기 내에서 6시간 배양하였다. 6시간 배양된 세포주를 비교 세포(control cell)를제외한 다른 3개의 세포에 혈액조사 장치인 Gammacell로 각각 3Gy(300rad), 5 Gy(500 rad), 7 Gy(700 rad) 조사하였다. 조사된 세포를 96 well plate의 각 well에 100 μl씩 분주한 다음 370에서 5% CO2 배양기 및 100% 습도의 조건에서 48시간 배양 그리고 72시간 배양하였다.
즉 3 Gy는 18초, 5 Gy 는 30초이고 7 Gy는 42초를 조사하였다. 배양된 세포는 XTT kit를 이용하여 각각의 생존율을 측정하였다.
혈구암세포인 HL-60세포의 생존율을 측정하기 위하여 cell proliferation kit(Boehrinrer-Mannheim, Germany)는 정량 kit인 XTT kit를 사용하였다. 배양하던 세포를 hemocytometer를 이용하여 96 well plate로 100μl 배양액 안에 5×104/well이 되게 분주한 다음 CO2 incubator 안에 넣고 48시간, 72시간 각각 배양된 96 well에 XTT assay kit(Boehrinrer Mannheim, Germany)를 이용하였다.
혈구암세포인 HL-60세포의 생존율을 측정하기 위하여 cell proliferation kit(Boehrinrer-Mannheim, Germany)는 정량 kit인 XTT kit를 사용하였다. 배양하던 세포를 hemocytometer를 이용하여 96 well plate로 100μl 배양액 안에 5×104/well이 되게 분주한 다음 CO2 incubator 안에 넣고 48시간, 72시간 각각 배양된 96 well에 XTT assay kit(Boehrinrer Mannheim, Germany)를 이용하였다. 각각 배양된 96 well에 XTT 반응액 50μl을 넣어 섭씨 37℃ 배양기에서 4시간 동안 배양시킨 후 490 nm 파장에서 ELISA 판독기(EMAX, Molecular Device, U.
혈액암세포인 HL-60 세포주에 EGCG를 처리하여 농도별로 세포생존율을 비교하였다. HL-60 세포주의 EGCG 처리 후 48시간 배양에서는 대조군에 비해 농도가 높아질수록 점차적으로 완만하게 세포사멸이 증가시키는 경향을 보였다.
방사선조사와 녹차 EGCG 처리는 개별적으로 혈구암세포의 사멸을 유도하였다(Fig. 1, 2). 따라서 두 가지 처리를 병행하면 상승효과가 나타날 것으로 예상되어 혈구암세포에 EGCG를 처리한 뒤 방사선을 선량별로 조사하였다.
1, 2). 따라서 두 가지 처리를 병행하면 상승효과가 나타날 것으로 예상되어 혈구암세포에 EGCG를 처리한 뒤 방사선을 선량별로 조사하였다. 서로 다른 농도의 녹차 EGCG를 투여 후 48시간째에 3 Gy의 방사선을 조사한 집단의 세포 생존율은 EGCG 무 처리 군이 0.
혈액 조사장치에서의 암세포 조사는 아래 수식에 의하여 각각 1 Gy/6 sec씩 조사하였다. 즉 3 Gy는 18초, 5 Gy 는 30초이고 7 Gy는 42초를 조사하였다.
대상 데이터
실험에 사용한 녹차 추출물인 EGCG는 (95~98% poly-phenols(>80% catechin(EGCG>45%), < 3% caffeine)Sigma(USA) 에서 구입하였다. 정제된 녹차 추출물인 EGCG 0.
실험에 사용된 암세포주는 인체기원 암세포주로 전골 수성 백혈병 세포주, HL-60(Human leukemia, acute promyelocyte)과 정상면역세포주, NC-37(Human B cell : B lymphoblast)를 이용하였다. 세포주를 15 ml 원심분리 관에 넣고 Penicillin-streptomycin과 Fungizone 및 10% FBS가 포함된 RPMI 1640에 넣어서 800 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다.
세포수가 지나치게 많아지면 세포를 원심분리하여 배양액을 교환하고 3~4일에 한 번씩 숫자를 줄여서 계대 배양하였다. 본 실험에서는 8~10대 사이의 계대배양 중인 대수기의 증식력이 왕성한 세포를 이용하였다.
세포 계대배양에 사용되는 CO2 배양기(Model Qwj- 300T, U.S.A)를 사용하였고, 세포독성 측정을 위한 생존율 검사시 사용되는 위상차 현미경(Olympus IMT-2-21) 및 XTT즉정을 위한 microplate reader(ELISA reader ; EMAX, Molecular Device, U.S.A)를 사용하였으며, 세포 방사선 선량별 조사에 사용한 blood irradiator는 전남대학교병원 임상연구소에 있는 Nodion사의 Gammacell 3000 Elan system. (Canada, 선원 : 60Co gamma ray)을 사용하였다.
성능/효과
세포생존율을 비교하였다. HL-60 세포주의 EGCG 처리 후 48시간 배양에서는 대조군에 비해 농도가 높아질수록 점차적으로 완만하게 세포사멸이 증가시키는 경향을 보였다. EGCG는30μg/ml까지는 90%의 생존율을 유지하다가, 40μg/ml에서는 80%, 80μg/ml에서는 약 70%까지 생존율이 감소하였다.
NC-37세포는 분열 속도가 느릴 뿐만 아니라 EGOG에 의해서 세포 사멸이유도 되지도 않았다. 반대로 낮은 농도의 EGCG처리(10μg/ml)시에 오히려 세포분열이 10% 정도 증가하는 결과를 나타내었다.
2). 그리고 72시간 배양에서 대조군과 비교하여 볼 때 3 Gy에서는 약 40%의 세포 감소율을 보였으며 5 Gy에서는 46%, 7 Gy에서는 약 75%의 세포 감소율을 보임으로서 방사선 선량이 높을수록 그리고 배양 시간이 경과할수록 세포수의 감소가 더 크게 관찰되었다. 시간이 경과하여도 세포수 증가가 관찰되지 않는 것은 방사선 조사가 세포분열을 억제하는 결과를 유도하였음을 의미한다.
따라서 두 가지 처리를 병행하면 상승효과가 나타날 것으로 예상되어 혈구암세포에 EGCG를 처리한 뒤 방사선을 선량별로 조사하였다. 서로 다른 농도의 녹차 EGCG를 투여 후 48시간째에 3 Gy의 방사선을 조사한 집단의 세포 생존율은 EGCG 무 처리 군이 0.98로 세포사멸이 거의 나타나지 않았다(Table2, Fig. 3). EGCG 만을 40, 50, 60 μg/ml 농도로 처리한 세포에서는 생존율이 0.
73으로 3 Gy의 방사선을 조사한 집단보다 약간 더 사멸하였다. 그런데 EGCG 를 각각 40, 50, 60 μg/ml 농도로 처 리한 세포에 동일한선량으로 방사선조사를 하면 EGCG만 단독처리한 세포군에 비교하여 예상값보다 각각 3.1%, 26.2%, 23.3% 더 사멸하는 상승효과가 나타났다(Table 2, Fig. 3). 방사선 조사량을 5 Gy, 7 Gy로 각각 늘리면 세포사멸 상승효과는 감소하였으나 약 10% 정도의 상승작용을 유지하였다.
3). 방사선 조사량을 5 Gy, 7 Gy로 각각 늘리면 세포사멸 상승효과는 감소하였으나 약 10% 정도의 상승작용을 유지하였다. 암세포사멸 상승효과는 EGCG 농도가 50 μg/ml일 때 가장 높게 나타났다(Fig.
방사선 조사량을 5 Gy, 7 Gy로 각각 늘리면 세포사멸 상승효과는 감소하였으나 약 10% 정도의 상승작용을 유지하였다. 암세포사멸 상승효과는 EGCG 농도가 50 μg/ml일 때 가장 높게 나타났다(Fig. 3). 녹차 EGCG의 처리시간을 72시간으로 늘렸을 때도 암세포사멸 상승효과는 48시간 처리 군과 유사한 형태를 나타내었다(Table 3).
녹차 EGCG의 처리시간을 72시간으로 늘렸을 때도 암세포사멸 상승효과는 48시간 처리 군과 유사한 형태를 나타내었다(Table 3). 가장 큰 사멸 상승효과는 EGCG 농도가 50 μg/ml일 때 3 Gy의 방사선을 처리하여 얻을 수 있었으며 이때 처리 상승효과는 약 35%까지 증가하였다.
녹차의 EGCG는 단독처리 했을 때 혈구암세포 사멸유도 효과를 나타내며 방사선조사와 병행처리 하였을 때는 방사선의 사멸효과를 증진시키는 결과를 보였다. 이와 같은 결과는 기존의 연구와 일치한다.
Guo 등10)은 green tea polyphenol (GTPP) 성분인 EGCG, ECG, EGC(-) epigallocatechin, EC (epicacatechin) 등이 synaptosome에서 iron-induced lipid peroxidation 억제 효과를 관찰하였는데, EGCG>ECG>EGC>EC 등의 순으로 lipid peroxidation 생성을 억제시키고, hydroxyradical (HO) 배기 능력은 ECG> EC> EGOG> EGC 순으로 감소시킴을 관찰하였다 Otsuka 등 11)은 사람과 생쥐 leukemic cell line인 K562, KG1, THP-1, U397, NFS60 세포주를 이용여 0μM, 10μM, 50μM, 100μM, 10000μM 등 각각의 EGCG 농도에 따른 세포주의 생장률을 36시간 경과 후 MTT 분석을 통해서 관찰하였고, colony 형성은 14 일 경과 후 관찰하였다. colony 형성의 경우 모두 100 zzM 농도 이상의 경우에서만 암세포주 생장억제 및 colony 형성을 억제시킴을 관찰할 수 있었는데, 특히, 생쥐 세포주인 NFS60 세포주의 경우는 사람과는 달리 20μM에서 암세포 생장률을 억제함이 관찰되었다.
정상 세포를 보호하는 기능을 나타낸다. 본 실험결과를 보면(Table 1, Fig. 1) EGCG가 암세포에 대해서는 강력한 사멸유도 효과를 보이지만(100μg/ml에서 50% 정도사멸), 동일한 농도에서 정상세포는 거의 사멸되지 않는다. 이런 결과는 안정된 분열조절체계를 지닌 정상 세포가, 불안정한 분열 조절체계를 지닌 암세포에 비해서 독성작용을 덜 받기 때문인 것 같다.
본 연구에서 녹차 처리와 방사선조사를 병행하였을 때 세포사멸은 상승적으로 증가하는데 특히 그 효과는 저선량 조사에서 뚜렷하게 관찰된다. 7 Gy와 5 Gy에서 10% 미만의 상승효과를 보이던 EGCG 처리효과는 3 Gy에서 35%까지 증가한다.
조사에서 뚜렷하게 관찰된다. 7 Gy와 5 Gy에서 10% 미만의 상승효과를 보이던 EGCG 처리효과는 3 Gy에서 35%까지 증가한다. 방사선조사는 일반적으로 많은 정상 세포의 손실을 초래하는데 저선량 방사선과 녹차 처리로써 암세포를 효과적으로 제거할 수 있을 것이라는 가능성을 보여준다.
방사선조사는 일반적으로 많은 정상 세포의 손실을 초래하는데 저선량 방사선과 녹차 처리로써 암세포를 효과적으로 제거할 수 있을 것이라는 가능성을 보여준다. 본 연구에서는 40~60㎛의 미량의 EGCG를 처리하여 암세포에 대한 사멸촉진 상승효과를 확인할 수 있었다. 또한, 방사선조사 전, 후 EGCG 첨가 유무에 따른 혈구암 세포주 성장률을 비교한 결과 방사선 단독처리 세포에서보다 현저한 암세포 억제가 있는 것을 확인하였으며, 고선량보다 저선량에서 상승효과가 높게 나타난 사실을 관찰할 수 있었다.
본 연구에서는 40~60㎛의 미량의 EGCG를 처리하여 암세포에 대한 사멸촉진 상승효과를 확인할 수 있었다. 또한, 방사선조사 전, 후 EGCG 첨가 유무에 따른 혈구암 세포주 성장률을 비교한 결과 방사선 단독처리 세포에서보다 현저한 암세포 억제가 있는 것을 확인하였으며, 고선량보다 저선량에서 상승효과가 높게 나타난 사실을 관찰할 수 있었다. 특히, 녹차 EGCG의 처리가 정상 세포에는 거의 영향을 미치지 않았는데 이 사실은 녹차 EGCG처리에 의해 암세포를 선택적으로 사멸시킬 수 있을 것이라는 점을 시사한다.
후속연구
특히, 녹차 EGCG의 처리가 정상 세포에는 거의 영향을 미치지 않았는데 이 사실은 녹차 EGCG처리에 의해 암세포를 선택적으로 사멸시킬 수 있을 것이라는 점을 시사한다. 이상의 결과로 미루어 혈액암의 방사선 치료시 녹차 EGCG를 병행 처리하면 저선량의 방사선조사로도 정상세포의 손상을 최소화하면서 효과적으로 암세포를 사멸을 유도할 수 있을 것으로 기대된다. 방사선과 녹차 EGCG의 병행 처리효과가 다른 암세포에 대해서도 In vivo 처리에서도 동일한 효과를 나타내는지에 대해서는 더 많은 연구가 진행되어야 할 것이다.
이상의 결과로 미루어 혈액암의 방사선 치료시 녹차 EGCG를 병행 처리하면 저선량의 방사선조사로도 정상세포의 손상을 최소화하면서 효과적으로 암세포를 사멸을 유도할 수 있을 것으로 기대된다. 방사선과 녹차 EGCG의 병행 처리효과가 다른 암세포에 대해서도 In vivo 처리에서도 동일한 효과를 나타내는지에 대해서는 더 많은 연구가 진행되어야 할 것이다.
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