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문제 정의
- 비글개 6두에서 11회(임신견 7두, 비 임신견 4 두)의 발정 주기 및 임신 기간 동안 질 상피 세포검사 및 혈장 progesterone과 estradiol-17/? 농도를 측정하여 질 상피 세포상과 번식 호르몬의 관계를 조사하고 배란 및 교배 적기 판정을 위한 기초 자료를 제공하고자 본 실험을 실시하였다.
- 이상 보아온 바와 같이 발정 주기와 교배 적기 및 배란 시기를 판정하기 위한 많은 연구가 보고 되어지고 있는 가운데 국내에서 번식되고 있는 비 글개를 대상으로 질세포와 번식 호르몬 사이의 관계를 종합적으로 비교, 검토가 필요하다고 판단되었다. 따라서 본 연구는 비글개를 대상으로 검사 방법이 간단한 질 세포 검사를 수행하여 발정 주기 동안 질 세포상을 조사하고 혈장 progesterone 및 estradiol-17/3 농도를 측정하여 이들 사이의 상관관계를 규명함으로써 비글개의 번식에 대한 기 초적 자료를 제공하고자 실험을 실시하였다.
제안 방법
- 각 발정 주기의 길이와 발정 주기의 간격은 Mean土 SD 그리고 각 주기별 질세포의 비율과 혈장 progesterone 및 estradiol-17 fi 농도는 Mean土sem으로 산출하였다 발정 주기별 각 질세포의 비교는 SPSS의 GLM(General Linear Model) 그리고 각 그룹별 혈장 progesterone과 estradio卜178 농도의 비교는 Student's Mest를 이용하여 유의성을 검토하였다.
- 또한 배란 전에 난포벽이 황 체화되므로 배란 전에 혈중 progesterone 농도가증가하는 현상은 오로지 개에서만 관찰할 수 있다고 하였으며(Hayer 등, 1993; Bouchard 등, 1991; Concannon 등, 1977), Concannon 등(1977)은 LH surge 후 배란 현상은 혈중 progesterone의 농도가 증가하는 것과 밀접한 관련이 있다고 하였다. 또한, 혈중 progesterone 농도를 측정하여 배란 시기 를. 비교적 정확하게 파악할 수 있고 교배 적기를 판정하는데도 중요하다고 보고된 바 있으며(Post 등, 1990), 혈중 progesterone 농도를 측정하여 이를 기준으로 일정한 시간에 교배를 실시하여 높은수태율을 나타내었다고 보고되었다(Okens 등, 1993; Dietrich와 Moller, 1993; Post 등, 1990).
- 모든 개는 발정 출혈 개시 일부터 최초 교배 허 용 후 20일까지는 매일, 임신이 된 예는 최초 교배 허용 후 21일부터 분만 예정 6일전까지는 3일 간 격으로, 분만 예정 6일전부터 분만 후 10일까지는 매일 그리고 분만 이후에는 2주에 1회 채혈하였으며, 임신이 되지 않은 예는 최초 교배 허용 후 80 일째까지는 3일 간격으로, 이후에는 2주에 1회 채 혈하였다. 채혈 후 EDTA 병에 채취한 혈액은 4℃ 에서 1,500 g로 10분 동안 원심 분리하여 혈장을 분리한 후 혈장 progesterone2]- #이니7 3의 농도를 측정할 때까지 -20℃에 냉동 보관하였다.
- 모든 개는 발정 출혈이 관찰될 때까지 매일 발 정 출혈 및 외음부 종대 여부를 관찰하였으며, 발 정출혈 개시 일부터 발정이 종료될 때까지 매일 2 , 회 출혈색, 출혈량과 점도 및 교배 허용 여부를 관 찰하였다. 최초 교배 허용 후 1~2일에 동일종의 수 캐와 2일 간격으로 2회 자연 교배를 실시하였다.
- 실험 동물은 비글개 6두를 대상으로 11회의 발 정 주기를 관찰하였으며, 11회의 발정 주기 중 임 신이 되었던 예는 7회, 임신이 되지 않았던 예는 4 회이었다. 모든 개는 성성숙 전부터 사육하면서 발 정주기를 관찰하였으며 6두 중 2두는 3회의 발정 주기, 1두는 2회, 나머지 3두는 1회의 발정 주기를 나타내었다. 첫 발정 개시 시의 체중은 평균 10.
- 사료는 제한 급여하였고, 물은 자 유 음수토록 하였다. 모든 개는 실험 개시 전에 예 방 접종 및 구충을 실시하였다.
- 모든 개는 임신의 여부를 확인하기 위하여 최후 교배 후 25일에 초음파 진단기를 이용하여 임신 진단을 실시하였다. 초음파 검사 전에 복부의 전모 를 실시하였고, 진정이나 마취는 실시하지 않았다.
- 실험견은 실험 동물 사육실에서 1두씩 격리 사 육하였으며, 조명은 명암을 14 및 10 시간 주기로 맞추어 주었다. 사료는 제한 급여하였고, 물은 자 유 음수토록 하였다.
- 초음파 검사 전에 복부의 전모 를 실시하였고, 진정이나 마취는 실시하지 않았다. 실험견을 앙와위로 보정한 후 acoustic gel을 복부 에 바르고 탐촉자를 피부에 밀착시켜 상복부와 하 복부 사이를 이동하면서 초음파 검사를 실시하였다.
- 임상 증상의 관찰 및 번식 호르몬 농도 측정에 의한 발정 주기는 Guyant(1988) 및 Concannon과 Lein(1989)의 기술에 준하여 발정 전기, 발정기, 발정 휴 지기, 무발정기로 구분하였다. 즉, 발정 전기는 발 정 출혈 개시 일부터 최초 교배 허용 전 날까지, 발 정기는 최초 교배 허용 일부터 최후 교배 허용 일까 지, 발정 휴지기는 임신견의 경우 최후 교배 허용 다음날부터 분만일까지, 비 임신견의 경우 최후 교배허용 다음날부터 혈장 progesterone 농도가 1.0 ng/ ml이하로 하강할 때로 하였으며, 그 이후부터 다음 발 정 출혈 개시 전 날까지를 무발정기로 구분하였다.
- 질세포 검사는 발정 출혈 개시일 부터 최초 교배 허용 후 20일까지는 매일, 최초 교배 허용 후 21 일째 부터 다음 발정 출혈 개시일 까지는 주 1회 실시하였다.
- 질세포의 구분은 Schutte(1967a)의 기술에 준하여 각각의 슬라이드의 5개 이상 시야에서 200개의 질세포를 검경한 후 세포질의 각화 유무 및 세포 핵의 형태에 따라 5가지 세포로 분류한 다음 이를다시 비 각화 상피 세포(parabasal cell, small intermediate cell, large intermediate c이 1)와 각화 상피 세 포(superficial cell 그리고 anuclear cell)로 대별하였으며, Bell과 Christie(1971)의 기술에 준하여 슬 라이드상의 적혈구와 백혈구 출현 정도를 Table 1 과 같이 0부터 5까지 6등급으로 분류하였다.
- 모든 개는 발정 출혈이 관찰될 때까지 매일 발 정 출혈 및 외음부 종대 여부를 관찰하였으며, 발 정출혈 개시 일부터 발정이 종료될 때까지 매일 2 , 회 출혈색, 출혈량과 점도 및 교배 허용 여부를 관 찰하였다. 최초 교배 허용 후 1~2일에 동일종의 수 캐와 2일 간격으로 2회 자연 교배를 실시하였다.
- 혈장 progesterone 농도 측정은 progesterone kit (Coat-A-Count® Progesterone, Diagnostic Products Corporation, Los Angeles, USA)를 사용하여, 추출 하지 않은 100 #1의 혈장을 duplicated. 하여 Gamma counter(EG & G Wallace, Finland)로 측정하였다. 즉, progesterone 항체가 부착된 각각의 시험관 에 표준액, quality control 또는 시료를 100μ1씩 분주한 다음 label hormone(l25I-progesterone) 1ml를 각각 넣어 실온에서 3시간동안 incubation 하였다.
대상 데이터
- 실험 동물은 비글개 6두를 대상으로 11회의 발 정 주기를 관찰하였으며, 11회의 발정 주기 중 임 신이 되었던 예는 7회, 임신이 되지 않았던 예는 4 회이었다. 모든 개는 성성숙 전부터 사육하면서 발 정주기를 관찰하였으며 6두 중 2두는 3회의 발정 주기, 1두는 2회, 나머지 3두는 1회의 발정 주기를 나타내었다.
- 초음파 검사에는 6.5 MHz 탐촉자(convex형 multiprobe; 5.5 MHz, 6.5 MHz, 7.5 MHz)와 7.5 MHz 탐 촉자(lineai.형 multi-probe; 7.5 MHz, 8.5 MHz, 10.0 MHz)가 장착된 SonoAce 8800(Medison Co, Korea)을 이용하였다.
이론/모형
- Estradiol-17 B 농도는 Estradiol-17 B kit(Coat- A-Count® Estradiol, Diagnostic Products Corporation, Los Angeles, USA)를 이용하여 progesterone 분석과 같은 방법으로 Gamma counter(EG & G Wallace, Finland)로 측정하였다. 변이 계수인 intra- assay는 9.
- 임상 증상의 관찰 및 번식 호르몬 농도 측정에 의한 발정 주기는 Guyant(1988) 및 Concannon과 Lein(1989)의 기술에 준하여 발정 전기, 발정기, 발정 휴 지기, 무발정기로 구분하였다. 즉, 발정 전기는 발 정 출혈 개시 일부터 최초 교배 허용 전 날까지, 발 정기는 최초 교배 허용 일부터 최후 교배 허용 일까 지, 발정 휴지기는 임신견의 경우 최후 교배 허용 다음날부터 분만일까지, 비 임신견의 경우 최후 교배허용 다음날부터 혈장 progesterone 농도가 1.
- 질세포 검사는 Guyant(1988) 및 손 등(1997)의 방법에 준하여 멸균 면봉에 생리 식염수를 묻힌 후 질내에 삽입하여 질전정에서 질분비물을 채취 한 후 2장의 슬라이드 글라스에 직접 도말하였다. 질 도말 표본을 자연 건조시킨 후 각각의 질세포비율과 각화지 수(cornified index(CI))를 산출하기 위해 Wright's 염색을 실시하였다.
- 질세포 검사는 Guyant(1988) 및 손 등(1997)의 방법에 준하여 멸균 면봉에 생리 식염수를 묻힌 후 질내에 삽입하여 질전정에서 질분비물을 채취 한 후 2장의 슬라이드 글라스에 직접 도말하였다. 질 도말 표본을 자연 건조시킨 후 각각의 질세포비율과 각화지 수(cornified index(CI))를 산출하기 위해 Wright's 염색을 실시하였다.
- 질세포의 각화지수(Cornification index; CI)의 산출은 Schutte(1967a)와 Post(1985)의 기술에 준하여 각화된 세포의 비율을 백분율로 환산하여 CI를 산출하였다. CI의 산출 공식은 다음과 같다.
성능/효과
- 결과를 종합하면 본 연구에서 비글개의 배란은 혈장 estradiol-17peak 이후 3일 및 혈장 progesterone 농도가 4.0 ng/ml 이상으로 처음 상승한 날 에 일어나며, 교배 적기는 CI가 90% 이상으로 증 가한 후 2일 이후와 혈장 progesterone 농도가 2~ 25 ng/ml인 시기로 생각된다.
- 발정 전기에는 superficial cell, anuclear cell 및 적혈구가 각각 39.2±3.0%, 31.3±1.5% 및 3.8±0.1로 높은 수준을 나타내었고 발정기에도 superficial cell, anuclear cell 및 적혈구가 각각 35.5±2.2%, 42.5± 2.7% 및 2.5±0.2로 높은 수준을 나타내었다. 발정 휴지기에는 비 각화 세포 및 백혈구가 각각 82.
- 또한 발정기에는 각화 상피 세포가 주종을 이루며 각화 상피 세포 중에서도 무핵 각화 상피 세포가 50%이상을 차지하게 된다(Hayer 등, 1993; Allen, 1992; Post 등, 1990). 본 연구에서도 Table 2에서 보는 바와 같이 발정 전기에는 비 각화 상피 세포가 점차적으로 증가하여 발정기에는 superficial cell, anuclear cell이 주종을 이루었으며, 발정 휴지기에는 각화 상피 세포의 수는 지속적으로 감소하여 비 각화 상피 세포가 주를 이룸과 동시에 백혈구가 출현하였다. 그리고 무발정기에는 비 각화 상피 세포인 parabasal cell과 small intermediate cell 이 주종을 이루었다.
- 이상의 결과를 종합하면, 비글개에 있어서 혈장progesterone 농도와 질상피 세포상의 변화를 바탕으로 배란시기를 추정한 결과, CI가 90% 이상으로 증가한 후 2일에 배란이 일어나며 이때 혈장 progesterone 농도는 처음으로 4.0 ng/ml 이상으로 증 가하였다. CI peak 후 CI가 90% 이상으로 지속되는 기간을 최상의 교배 적기로 예상할 수 있으며이때 혈장 progesterone 농도는 2~25 ng/ml 이었다.
- 혈장 progesterone 농도가 최초로 4.0 ng/ml 이상으로 증가한 날을 기준(Day 0)으로 하였을 때 발정 주기 중 혈장 progesterone 및 estradiol-17日의농도의 변화상은 Fig. 1에서와 같이 발정 전기부터 Day 35일까지 임신의 경우와 비 임신의 경우 사이에 유의성 있는 차이가 인정되지 않았지만 Day 35 일 이후부터 Day 63일까지 혈장 progesterone 농도는 임신 예가 비 임신 예보다 더 높은 치를 나타내었다. 이 결과는 임신 예와 비 임신 예의 혈장 progesterone 농도를 비교해보면 임신 예의 혈장 progesterone 농도가 비임신 예에 비해 높게 유지 되는 기간이 길다는 보고(Fayrer-Hosken 등, 1994; Concannon과 Lein, 1989)와 일치하였다.
- CI peak 후 CI가 90% 이상으로 지속되는 기간을 최상의 교배 적기로 예상할 수 있으며이때 혈장 progesterone 농도는 2~25 ng/ml 이었다. 혈장 progesterone 농도를 측정하여 배 란시 기 와 교 배적기를 정확히 판정할 수 있으며, 질세포 검사 역시 검사 방법이 간단하고 비용이 저렴하여 배란 시기 및 교배 적기 판정에 유용하게 사용할 수 있는 방법임을 확인하였다.
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