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문제 정의
- 변화와 전해질 저항의 변화에 영향을 주는 것으로 보고되고 있다(Bartlewski 등, 1999; Fazleabas 등, 1990). 따라서 본 연구에서는 질 점액 전해질 저항을 측정하여 교미 적기를 진단하고자 하였으며 측정하는 방법으로는 시판되는 배란 탐지기를 이용하였다. 그 결과 질 점액질의 전기 저항도는 비 발정기에는 낮은 상태를 유지하다가 배란이 일어나는 시점에 최고치에 도달하고 배란 후에는 다시 급격히 감소하는 경향을 보였다(Fig.
- 모두 갖춘 방법은 아직 제시되지 못하고 있다. 따라서 본연구에서는 발정주기에 따라 개의 질 점액 전해질 저항에 변화가 발생하는 것을 측정하는 배란 탐지기를 이용하여 질 점액 전해질의 저항도 측정이 정확한 배란 시기 진단에 얼마나 효율적인지 조사하고자 한다. 이러한 배란 탐지기를 이용하여 암캐의 질 내 점액의 전기적 저항을 측정함과 동시에 질 상피세포의 형태 관찰 방법이나 혈장의 progesterone 농도의 변화를 관찰하는 방법을 동시에 실시하여 질 점액 전해질 저항에 따른 질 상피세포의 변화와 혈중 progesterone 및 estrogen 농도의 변화 양상을 비교 분석한다.
- 또한 배란 탐지기를 이용해 측정된 배란일은 탐색적 개복술을 실시하여 난소에서의 배란상태를 확인하여 정확도를 비교하였다. 이러한 여러가지 배란 측정 방법의 병용 실시로 각 측정 방법간의 장점과 단점을 파악하고 정확도를 입증하여, 실제 임상 치료나 연구를 목적으로 하는 실험에서 배란일을 정확하게 측정하는 가장 적절한 방법을 찾고자 한다.
제안 방법
- 모든 실험 견은 실험 개시 1 주일 전에 구입하여 안정화 단계를 거쳤으며, 신체 검사.(체온, 체중, 피부병, 연령 예측), 약욕(클로로헥시딘이 포함된 개용 샴푸) 그리고 구충(하트가드; 이버멕틴과 피란텔, 바이엘동물약품, 독일)을 실시하였다. 물과 사료(우성사료, 성견용, 한국) 는 1일 2회 자유 급식 하였고, 독립된 케이지에서 사육하였으며 충분한 운동을 위해 하루 한번 산책을 실시하였다.
- 2 ㎎/㎏ Aceproma- zine(세 다젝트, Sam-woo, Korea)을 근육이 나 정 맥투여 후 수술 준비가 완료되면 Zoletil(Tiletamine/Zolazepam, Virbac, France)을 투여하고 수술을 실시하였다. 개복 후 양측 난소를 찾아내어 난소낭을 절개 후 난포의 배란 여부를 확인하였다. 후처지는 항생제 10 ㎎/㎏ Enrofloxacin(Baytril, Bayer, Germany) 과 소염 진통제로 2 ㎎/㎏ Meloxicam(Metacam, Boehringer Ingertheim, Germany)을 투여하였다.
- 난소의 실제 배란 상태를 확인하기 위해 개복술을 실시하여 배란 유무를 확진하였으며, 개복술 개시일은 배란 탐지기에 의해 배란일로 추정되는 날 개복술을 실시하였다. 배란은 출혈 점(Fig.
- 이러한 배란 탐지기를 이용하여 암캐의 질 내 점액의 전기적 저항을 측정함과 동시에 질 상피세포의 형태 관찰 방법이나 혈장의 progesterone 농도의 변화를 관찰하는 방법을 동시에 실시하여 질 점액 전해질 저항에 따른 질 상피세포의 변화와 혈중 progesterone 및 estrogen 농도의 변화 양상을 비교 분석한다. 또한 배란 탐지기를 이용해 측정된 배란일은 탐색적 개복술을 실시하여 난소에서의 배란상태를 확인하여 정확도를 비교하였다. 이러한 여러가지 배란 측정 방법의 병용 실시로 각 측정 방법간의 장점과 단점을 파악하고 정확도를 입증하여, 실제 임상 치료나 연구를 목적으로 하는 실험에서 배란일을 정확하게 측정하는 가장 적절한 방법을 찾고자 한다.
- 실험 견은 외음부 종창과 출혈이 관찰된 날부터 3일 간격으로 질 상피세포 도말 검사, 호르몬 검사를 위한 혈액 채취, 배란 탐지기를 이용한 질 내 전해질 저항을 측정하였다. 또한 전기 저항이 급격히 증가하는 시점부터 1일 1회 배란 탐지기를 이용한 질 내 전해질 저항을 측정하였다.
- (체온, 체중, 피부병, 연령 예측), 약욕(클로로헥시딘이 포함된 개용 샴푸) 그리고 구충(하트가드; 이버멕틴과 피란텔, 바이엘동물약품, 독일)을 실시하였다. 물과 사료(우성사료, 성견용, 한국) 는 1일 2회 자유 급식 하였고, 독립된 케이지에서 사육하였으며 충분한 운동을 위해 하루 한번 산책을 실시하였다. 실험에 공시한 개는 세포학적 검사와 호르몬 검사를 통하여 무 발정기인 것만을 대상으로 하였다.
- 발정 판정을 위하여 발정 전기 개시일부터 발정 후기 개시일까지 일주일에 2번 질 도말 검사를 실시하였다. 질 상피세포 도말 검사는 생리식염수를 묻힌 멸균된 면봉을 이용하여질 점막을 채취한 후 슬라이드에 도말하여 건조시킨 후 메탄올에 10초 고정 후 Diff-Quick 염색액으로 염색한 후 광학현미경(Nikon, Japan) 400x 배 시야에서 질 상피세포의 형태학적인 변화를 관찰하였다.
- 발정기의 혈중 progesterone과 estrogen 농도의 변화를 비교4하였다. Progesterone 농도 변화는 개체간의 차이가 있지만 발정주기 동안 낮은 증가 곡선으로 증가하면서 발정 3일까지는 변화를 보이지 않다가 배란이 이루어지는 시점에서부터 유의적 0605)을 증가하여 약 3 ng/ml를 나타내고 교배 적기에는 약 7 ng/ml를 나타내었다{Fig.
- 발정이 확인된 암캐의 질 점액질의 전기 저항도를 배란 탐지기로 측정하였다. 발정기의 암캐 4마리의 질 점액질 전기저항도는 비발정기에 120 unit 이하의 저항도를 나타내 다가 배란이 일어나는 시점에 최고치에 도달하였으며, 배란 후 급격히 감소하는 경향을 보였다.
- 배란 탐지기 (Ovulation detector, Draminski, A&T, Fig. 1)는 질 내 점액의 변화와 배란에 따라 발생하는 전기 저항의 변화의 차이로 측정하였다. 용이한 측정을 위하여 개를 낮은 테이블 위에 놓고, 음순을 벌리고 부드럽게 탐지봉 길이의 3/5 정도 깊이로 밀어 넣었다.
- 배란 탐지기를 이용하여 질 점액질의 전기 저항도가 급격히 상승하다가 감소하는 날 배란 확인을 위한 개복술을 시행하였다. 수술 하루 전 절식을 실시하고 수술 30분 전 유연과 서맥을 방지하기 위해서 0.
- 배란 탐지기의 측정으로 발정기로 판정된 암캐 4마리를 개복술을 통하여 육안적으로 배란점을 확인하고 배란점들이 확인된 개의 질 상피세포의 상태를 비교하였다. 그 결과 배란이 확인된 4마리 암캐 중 2마리 암캐(A와 B)의 질 상피세포 상태가 발정기로 판정되는 무핵 각화상피세포로 관찰되었다.
- 배란은 출혈 점(Fig. 5)을 관찰하여 판정하였으며, 교배 적기는 배란측정기의 peak가 나타난 후 2~3일 후로 추정하였다.
- 수술 하루 전 절식을 실시하고 수술 30분 전 유연과 서맥을 방지하기 위해서 0.02—0.04 ㎎/㎏ Atropine(Atropine, Je-il, Korea)을 투여하고 전 마취제 0.1~0.2 ㎎/㎏ Aceproma- zine(세 다젝트, Sam-woo, Korea)을 근육이 나 정 맥투여 후 수술 준비가 완료되면 Zoletil(Tiletamine/Zolazepam, Virbac, France)을 투여하고 수술을 실시하였다. 개복 후 양측 난소를 찾아내어 난소낭을 절개 후 난포의 배란 여부를 확인하였다.
- 탐지봉 삽입 후 2~3회 반회전 혹은 완전 회전하여 질 속의 점액이 탐지기 센서에 완전히 묻히도록 하였다. 스위치를 누르고, 1.5 ~2초 후에 나온 수치를 읽어 저항이 피크로 기록되면 배란으로 진단하고 1~2일 후를 교배적기로 판정하였다.
- 실험에 공시한 개는 세포학적 검사와 호르몬 검사를 통하여 무 발정기인 것만을 대상으로 하였다. 실험 견은 외음부 종창과 출혈이 관찰된 날부터 3일 간격으로 질 상피세포 도말 검사, 호르몬 검사를 위한 혈액 채취, 배란 탐지기를 이용한 질 내 전해질 저항을 측정하였다. 또한 전기 저항이 급격히 증가하는 시점부터 1일 1회 배란 탐지기를 이용한 질 내 전해질 저항을 측정하였다.
- 따라서 본연구에서는 발정주기에 따라 개의 질 점액 전해질 저항에 변화가 발생하는 것을 측정하는 배란 탐지기를 이용하여 질 점액 전해질의 저항도 측정이 정확한 배란 시기 진단에 얼마나 효율적인지 조사하고자 한다. 이러한 배란 탐지기를 이용하여 암캐의 질 내 점액의 전기적 저항을 측정함과 동시에 질 상피세포의 형태 관찰 방법이나 혈장의 progesterone 농도의 변화를 관찰하는 방법을 동시에 실시하여 질 점액 전해질 저항에 따른 질 상피세포의 변화와 혈중 progesterone 및 estrogen 농도의 변화 양상을 비교 분석한다. 또한 배란 탐지기를 이용해 측정된 배란일은 탐색적 개복술을 실시하여 난소에서의 배란상태를 확인하여 정확도를 비교하였다.
- 일주일에 2번 질 도말 검사를 실시하였다. 질 상피세포 도말 검사는 생리식염수를 묻힌 멸균된 면봉을 이용하여질 점막을 채취한 후 슬라이드에 도말하여 건조시킨 후 메탄올에 10초 고정 후 Diff-Quick 염색액으로 염색한 후 광학현미경(Nikon, Japan) 400x 배 시야에서 질 상피세포의 형태학적인 변화를 관찰하였다. 질 상피세포의 형태학적 변화에 따라 방기 저 세포(parabasal cell), 중간세포(intermediate cell), 표제세 포(superficial cell) 그리고 무핵 세포(anucleated cell)로 구분하였으며 각 출현 빈도에 따라 발정 주기를 다음과 같이 분류하였다<Christie와 Bell, 1972; Post, 1985).
- 혈중 progesterone과 estrogen 농도는 ELISA 방법에 의해 측정하였다. 혈액 채취는 발정전기 첫날부터 3일에 한번씩 요골측 피하정맥이나 경정맥에서 혈액을 0.5~1 ml를 채취한 후항응고제가 처리된 튜브에 담아 잘 섞은 후 실험실로 운반하여 1.5 ml tube 옮긴 후 원심분리기를 이용하여 500 xg(l, 500 rpm)로 5 분간 원심분리 시켜 tube 상층의 혈장만을 분리하였다. 이렇게 분리한 혈장은 호르몬 분석 전까지 영하 30℃에 보관하거 나 측정 에 바로 사용하였다.
- 개복 후 양측 난소를 찾아내어 난소낭을 절개 후 난포의 배란 여부를 확인하였다. 후처지는 항생제 10 ㎎/㎏ Enrofloxacin(Baytril, Bayer, Germany) 과 소염 진통제로 2 ㎎/㎏ Meloxicam(Metacam, Boehringer Ingertheim, Germany)을 투여하였다.
대상 데이터
- 물과 사료(우성사료, 성견용, 한국) 는 1일 2회 자유 급식 하였고, 독립된 케이지에서 사육하였으며 충분한 운동을 위해 하루 한번 산책을 실시하였다. 실험에 공시한 개는 세포학적 검사와 호르몬 검사를 통하여 무 발정기인 것만을 대상으로 하였다. 실험 견은 외음부 종창과 출혈이 관찰된 날부터 3일 간격으로 질 상피세포 도말 검사, 호르몬 검사를 위한 혈액 채취, 배란 탐지기를 이용한 질 내 전해질 저항을 측정하였다.
- 견은 자연 발정을 유도하였다. 이 중 6마리가 자연 발정이 유도되어 실험에 공시하였다. 모든 실험 견은 실험 개시 1 주일 전에 구입하여 안정화 단계를 거쳤으며, 신체 검사.
- 임상적으로 건강하다고 판정된 체중 4~8 kg, 1~3년 령잡종견(Mongrel) 암캐 12 마리를 실험에 공시하였으며, 모든 실험 견은 자연 발정을 유도하였다. 이 중 6마리가 자연 발정이 유도되어 실험에 공시하였다.
데이터처리
- 본 실험에서는 progesterone과 estrogen의 각 실험값의 백분율은 arc-sine을 이용하여 전환한 후 통계 프로그램 인 Analysis of Variance (ANOVA)로 분석하였으며, p<0.05일 때 유의적 차이를 인정하였다.
이론/모형
- 혈중 progesterone과 estrogen 농도는 ELISA 방법에 의해 측정하였다. 혈액 채취는 발정전기 첫날부터 3일에 한번씩 요골측 피하정맥이나 경정맥에서 혈액을 0.
- 이렇게 분리한 혈장은 호르몬 분석 전까지 영하 30℃에 보관하거 나 측정 에 바로 사용하였다. 호르몬 농도는 Assay Designs (Simplify Your Science®, Assay Designs, U.S.A.)의 proges- terone과 estrogen kit를 사용하였다.
성능/효과
- Progesterone과 질 점액의 전해질 저항간의 상호 연관성을 비교한 결과 전해질 저항이 peak에 도달하고 progesterone 농도가 서서히 증가하여 3~7 ng/ml 사이에 존재하는 배란 시점이 일치하였다(Fig. 6).
- 개의 질 상피세포의 상태를 비교하였다. 그 결과 배란이 확인된 4마리 암캐 중 2마리 암캐(A와 B)의 질 상피세포 상태가 발정기로 판정되는 무핵 각화상피세포로 관찰되었다. 반면 나머지 2마리 암캐(C와 D)는 각각 다량의 적혈구가 나타나는 발정전기와 백혈구와 다량의 parabasal cell이 나타나는 질 도말 검사 소견으로 비 발정기로 판정되는 질 상피세포를 나타냈다.
- 따라서 본 연구에서는 질 점액 전해질 저항을 측정하여 교미 적기를 진단하고자 하였으며 측정하는 방법으로는 시판되는 배란 탐지기를 이용하였다. 그 결과 질 점액질의 전기 저항도는 비 발정기에는 낮은 상태를 유지하다가 배란이 일어나는 시점에 최고치에 도달하고 배란 후에는 다시 급격히 감소하는 경향을 보였다(Fig. 3). 질 점액의 전해질 저항에 대한 보고들은 있지만 전해질 저항 원리를 이용한 배란 탐지기에 대한 보고는 아직 미비한 실정이다.
- 4B). 따라서 estrogen 농도는 배 란 3일전과 배 란기의 농도가 유사하여 배 란기의 정확한 판정이 어려울 것을 보였다. 일반적으로 혈중 호르몬 농도 변화를 측정하는 방법은 정확도는 높지만 혈액 채취 시간을 정확히 맞추는 것이 결과의 정확도에 영향을 준다는 문제점과 잦은 혈액 채취 빈도 및 비교적 고가의 검사 비용이 요구되는 문제점들이 있다.
- 측정하였다. 발정기의 암캐 4마리의 질 점액질 전기저항도는 비발정기에 120 unit 이하의 저항도를 나타내 다가 배란이 일어나는 시점에 최고치에 도달하였으며, 배란 후 급격히 감소하는 경향을 보였다. 질 점액질 전기 저항도 변화는 각 개체간에 차이가 나타났으나, 배 란 시 전기 저항도가 4마리 암캐에서 각각 1, 050, 1, 107, 1, 160 그리고 1, 737 unit으로 모두 최고치를 나타내었다(Fig.
- 그밖에 발정기에 estrogen 농도가 감소하면서 LH peak 2일 후 progesterone 농도가 높아진다는 보고(Jeffcoate와 England, 1997; Bouchard 등, 1991)와 배란시 progesterone 농도는 5 ng/ml 이상 (Kutzler, 2007; Jeffcoate와 Lindsay, 1989)이라는 보고가 있다. 본 연구에서 발정 단계에 따른 progesterone 농도는 개체 간의 차이는 인정되지만 발정 주기 동안 낮은 증가 곡선으로 상승하다가 배란이 일어나는 시점부터 증가하기 시작하여 교배적기에는 약 7 ng/ml로 높은 progesterone 농도를 나타내어 개의 교배 적기 판정에 유용한 지표가 되는 것으로 보인다(Fig. 4A). 그러나 배란기의 estrogen 농도는 그 전과 후에 비해 유의적(p<0.
- 그러나 외음부 종창과 장액혈액상 삼출물 확인에 의한 진단 방법은 변화 징후에 대한 진단 기준이 불명확하여 진단이 주관적일 수 있는 문제점이 있고 질 상피세포 도말 검사법은 간편하고 비용이 적게 드는데 비해 정확도가 낮은 편이다(Bell 등, 1973). 본 연구에서도 질 상피세포 도말검사에 의한 배란일 일치 정도는 50% 로 비교적 낮은 정확도를 보였다(Fig. 2).
- 발정기의 암캐 4마리의 질 점액질 전기저항도는 비발정기에 120 unit 이하의 저항도를 나타내 다가 배란이 일어나는 시점에 최고치에 도달하였으며, 배란 후 급격히 감소하는 경향을 보였다. 질 점액질 전기 저항도 변화는 각 개체간에 차이가 나타났으나, 배 란 시 전기 저항도가 4마리 암캐에서 각각 1, 050, 1, 107, 1, 160 그리고 1, 737 unit으로 모두 최고치를 나타내었다(Fig. 3).
후속연구
- 또한 질 상피세포 도말 검사법과 유사하게 질 바깥쪽부터 묻어서 들어가기 때문에 정확한 질 점액 전해질 저항을 측정하려면 미리 튜브를 삽입하고 이를 통과하여 점액에 직접 닿도록 하는 방법을 이용하는 등 효율성을 높이기 위한 방법을 적용할 필요가 있다. 또한 품종이나 연령에 따른 다양성도 고려하여야 할 것이다. 이러한 질 점액 전해질 저항 정도를 측정하는 배란 탐지기를 질 상피세포 도말 검사법과 혈중 progesterone 농도 측정법을 병용한다면 교배 적기의 정확성을 높일 수 있을 것이다.
- 또한 품종이나 연령에 따른 다양성도 고려하여야 할 것이다. 이러한 질 점액 전해질 저항 정도를 측정하는 배란 탐지기를 질 상피세포 도말 검사법과 혈중 progesterone 농도 측정법을 병용한다면 교배 적기의 정확성을 높일 수 있을 것이다.
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