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문제 정의
- 이에 본 연구는 시중에서 유퉁되고 있는 MPS를 생쥐 섬 유아세포인 L929 세포주에 처리 하여 세포증식저해 검사를 실시하고 저해율이 높은 MPS 제품을 선별 하여 세포수준에서 독성을 평가하고 형태학적 변화는 광학현미경을 이용하여 관찰하였다. 이 결과를 기준으로 in vivo 실험으로는 실험토끼 눈에 점안 후 각막상피 (epithelium) 및 내피 (endothelium)의 조직학적 변화를 주사전자현미경 (scanning electron microscopy, SEM) 으로 비교 관찰하여 MPS의 안정성에 대한 중요성을 제시하고자 하였다.
제안 방법
- 이에 본 연구는 시중에서 유퉁되고 있는 MPS를 생쥐 섬 유아세포인 L929 세포주에 처리 하여 세포증식저해 검사를 실시하고 저해율이 높은 MPS 제품을 선별 하여 세포수준에서 독성을 평가하고 형태학적 변화는 광학현미경을 이용하여 관찰하였다. 이 결과를 기준으로 in vivo 실험으로는 실험토끼 눈에 점안 후 각막상피 (epithelium) 및 내피 (endothelium)의 조직학적 변화를 주사전자현미경 (scanning electron microscopy, SEM) 으로 비교 관찰하여 MPS의 안정성에 대한 중요성을 제시하고자 하였다.
- 본 실험에서 사용된 세포는 L929 세포주를 사용하였다. L929 세포주는 minimum essential medium alpha medium (Gibco, USA)에 10%의 우태아혈청 (fetal bovine serum : Gibco, USA)과 fungizone (30 |iL/mL) 및 antibiotics (10 μL/mL)를 첨가해 사용하였다. 세포배 양은 25 cn?의 배 양용 flask (Nunc, Denmark)에 일정량의 배양액을 넣어 37℃, 5%CC)2로 조정된 CO2항온기 (Forma, USA)에서 배양하였고, 배양액은 3일마다 교환하였다.
- 세포배 양은 25 cn?의 배 양용 flask (Nunc, Denmark)에 일정량의 배양액을 넣어 37℃, 5%CC)2로 조정된 CO2항온기 (Forma, USA)에서 배양하였고, 배양액은 3일마다 교환하였다. 배양한 세포를 0.25% trypsin-EDTA (Ethylene Diamine Tetraacetic Acid)를 처리하여 세포를 부유 시 킨 다음 혈구계산기 (hemocytometer)로 세포수를 계수한 후 5 X 103 cell/mL 세포를 96-well plate (Nunc, Denmark)에 200 pL/well 분주해 세포가 60~70% 정도 채워졌을 때 다목적용액 (MPS)을 배양액의 용적에 대해 25%의 농도로 48시간 동안 처리하여 세포증식의 저해 정도를 조사하였다.
- 배양액을 MTT200Rg/mL가 포함된 배양액으로 교환하고 3시간 반응시켰다. 3시간 후 배양액을 버리고 DMSO (dimethylsulfoxide : Sigma, USA)를 200nL/well씩을 넣어 15분간 실온 방치하여 푸른색 결정인 formazan을 용해시킨 후 ELISA plate reader (Bio-Tech, USA)로 570nm에서 흡광도를 측정하여 대조군과 비교하였다(Francois & Rita, 1986).
- 세포독성의 검정 기준은 호주의 뉴 사우스 웨일즈 (New South Wales) 대학의 부설 CRCERT (NSW, Australia)에서 시행한 세포증식저해 염색법을 사용한 짐재 독성 평가 보고서를 기준으로 하였다 (Stephan & Ulrike, 1993; Lynn, 1997). MPS를 48시간 처리하여 MTT 비색검정인 세포증식 저해율이 30% 이상이면 독성이 있는 것으로 판정하고 대조군은 배양액을 처리 하였다.
- 실험용토끼 9마리 (18안)를 대상으로 하여 토끼의 좌안에는 각각 ReNu® (3안), Opti-free express® (3안), Free-sol plus(3안)를 처리한 실험군과 음성 대조군으로 우안(9안)에는 보존제가 포함되지 않은 0.9% 멸균 생리식염수를 점안한 대조군으로 각각 분류하였다.
- 1 mL를 결막낭에 점적하고 약 1초간 눈을 감은 상태로 유지시켰다. In vivo 실험으로는 실험용토끼 9마리 (18안)를 대상으로 3군으로 분류하여 좌안에는각 MPS 제품(9안), 우안(9안)은 대조군으로 보존제가 포함되지 않은 0.9% 멸균생리식염수를 100 μL/1 회, 3회/1 일, 14일 동안 점안하였다.
- Rose bengal staining은 각막의 고사된 상피 세포에 선택적으로 염색되는 생체 염색 방법 이다. 0.25% Rose bengal (Sigma, USA) 용액을 이용하여 실험용 토끼눈의 결막 위쪽에 점적하여 염색액이 골고루 퍼지도록 염색한 후 대조군과 MPS를 14일간 점안한 후의 각막의 손상된 상태를 디지털 카메라(Sony P-100, Japan) 로 촬영하였다.
- 48시간 동안 배양하였다가 도립 위상차 현미경 (Nikon TS-100, Japan)으로 세포형태를 200배로 관찰하고 사진 촬영을 실시하였다.
- MPS를 24시간 처리한후 처리용액을 제거한 뒤 plastic Thermanox * cover slip만 떼어내었다. 형태학적 관찰을 위해 70% 에탄올에서 10분 동안 고정한 후 핵과 세포질을 H&E stain 으로 대조 염색하였다. 염색 후 알코올 탈수과정을 통해 투명 화 과정을 거 친 후 Canada balsam (Sigma, USA)으로 봉입하여 영구표본을 제작하였다.
- 형태학적 관찰을 위해 70% 에탄올에서 10분 동안 고정한 후 핵과 세포질을 H&E stain 으로 대조 염색하였다. 염색 후 알코올 탈수과정을 통해 투명 화 과정을 거 친 후 Canada balsam (Sigma, USA)으로 봉입하여 영구표본을 제작하였다. H&E stain으로 염색된 세포는 광학현미경 (Olympus CH40, Japan) 하에서 관찰( X200)하여 핵 응축 (pyknotic nuclei) 또는 세포자연사 소체 (apoptotic body)로 보이는 세포들을 촬영하였다.
- 염색 후 알코올 탈수과정을 통해 투명 화 과정을 거 친 후 Canada balsam (Sigma, USA)으로 봉입하여 영구표본을 제작하였다. H&E stain으로 염색된 세포는 광학현미경 (Olympus CH40, Japan) 하에서 관찰( X200)하여 핵 응축 (pyknotic nuclei) 또는 세포자연사 소체 (apoptotic body)로 보이는 세포들을 촬영하였다.
- 농도별로 처리한 실험용 토끼눈의 형태적 검사를 위해 가토를 고정틀에 고정 후 근이완제 인 2% xylazine® (Bayer Korea, Korea) 1 mL와 전신마취제 인 ketamine hydrochloride® (Yuhan Corporation, Korea) 1 mL를 섞어서 토끼의 대퇴부에 근육주사 하였다. 안구를 적출한 후 각막을 2.
- 1 M cacodylate buffers. 20분간 3회에 걸쳐 세척한 후, 4℃ 에서 1% osmium tetroxide (0.1 M cacodylate buffer, pH 7.4)로 실온에서 2시간 정도 후고정하고 후고정하여 산화된 시료들을 일련의 50~ 100%의 graded ethyl alcohol series로 탈수시킨 뒤 isoamyl acetate로 20분간 치환하여 이후 liquid C0에 의한 임계점건조(CPD: critical point drying)과정을 거쳐 aluminum stub에 고정하고 약 10nm의 gold ion particle로 coating시 켜서 DSM 940A 주사전자현미경 (Hitachi S-4300형, Japan)으로 각막 상피와 내피의 조직표면을 촬영하여 관찰하였다.
- L929 세포주에 MPS를 농도별로 48시간 처리한 후 도립 위상차 현미경을 이용하여 X200로 관찰하였다. 대조군과 달리 MPS 처리군은 세포형태가 고착된 L929 세포주의 일반적인 모양인 방추사 형태가 점차 타원형 또는 원형 모양으로 위축되었고, 부착성세포인데 반해 액상으로 상층부에 부유하였다.
- 정상각막에 각각의 MPS를 투여한 후, 채취한 실험용토끼의 각막상피와 내피를 주사전자현미경 (SEM)을 이용하여 각각 500, 1,000,3,000배의 확대배율로 관찰 하였다.
대상 데이터
- 본 실험에서 사용된 세포는 L929 세포주를 사용하였다. L929 세포주는 minimum essential medium alpha medium (Gibco, USA)에 10%의 우태아혈청 (fetal bovine serum : Gibco, USA)과 fungizone (30 |iL/mL) 및 antibiotics (10 μL/mL)를 첨가해 사용하였다.
- 본 동물실험은 식품의약품안전청의 기준에 준하여 실험을 실시하였으며, 모든 실험동물은 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals[Department of Healty, Education, and Welfare Publication (National Institute of Health) 85-23, 1985]에 준하여 취급하였다. 각막과 외안부에 이상이 없는 성숙한 실험용토끼 (2.5 — 3.0 kg), New Zealand White Rabbit (Damool Science, Daejeon) 9 마리를 구입하였다. 사육 환경은 온도 18±2℃, 습도 60±10%, 환기 회수는 11~12회/hr, 조명은 12hr/day를 유지하였다.
- 사육 환경은 온도 18±2℃, 습도 60±10%, 환기 회수는 11~12회/hr, 조명은 12hr/day를 유지하였다. 이를 기준으로 본 대학 동물 사육실에서, 사료는 다물사이 언스 (Damool Science, Daejeon)에서 공급받은 실험동물용 사료로 음용수와 함께 자유로이 섭취토록 하여 2주일 동안 순응기간을 거친 후 실험을 실시하였다. 실험동물은 개별적으로 수용하여 개체구분을 실시하였으며, 모든 실험동물은 실험물질의 점안 하루 전 안저검사기로 안구를 검사하여 이상이 없는 실험동물만 선별하여 사용하였다.
- 이를 기준으로 본 대학 동물 사육실에서, 사료는 다물사이 언스 (Damool Science, Daejeon)에서 공급받은 실험동물용 사료로 음용수와 함께 자유로이 섭취토록 하여 2주일 동안 순응기간을 거친 후 실험을 실시하였다. 실험동물은 개별적으로 수용하여 개체구분을 실시하였으며, 모든 실험동물은 실험물질의 점안 하루 전 안저검사기로 안구를 검사하여 이상이 없는 실험동물만 선별하여 사용하였다.
- 현재 시판중인 MPS를 제품별 ReNu * (Baush & Lomb, USA), Opti-free express * (Alcon, USA), Free-sol plus® (Hanamedicon, Korea)를 시중에서 구입하여 사용하였다. 제품별 구성성분은 다음과 같다 (Table 1).
- 그 중 현재 가장 널리 이용되는 합성보존제 인 polyhexamethylene biguanide (PHMB)는 세포 증식 저해 및 임상적으로도 각결막에 자극감을 주는 등여러가지 부작용을 야기하고 있다. 본 연구에서 조사된 MPS 제품 중에서 ReNu®와 Free-sol plus®는 PHMB를 사용하였으며, Opti-free express®는 polyquaternium-1과 ALDOX™ (myristamidopropyl dimethylamine, MAPD)의 보존제 성분을 사용하고 있다.
이론/모형
- MTT assay는 Mosmann (1983)의 방법에 따라 시 행하였다. MTT (3-[4, 5-dimethylthiazol-2-yl]-2, 5- diphenyl tetrazoIium bromide : Sigma, USA) assay는 세포소기관 중 미토콘드리아의 효소 (succinate dehydrogenase)의 활성도를 조사해 세포활성을 측정하는 방법으로 용해성 노란색에 불용성의 보라색 MTT tetrazolium 이 succinate dehydrogenase에 의해 불용성의 보라색 MTT formazan으로 환원되는 정도를 흡광도로 측정하는 방법으로 trypan blue에 의한 dyeexclusion 방법보다 민감하여 세포사 진행과정의 초기 시점에서 세포의 생존율을 보다 정확히 측정할 수 있는 장점이 있다.
- 세포독성의 검정 기준은 호주의 뉴 사우스 웨일즈 (New South Wales) 대학의 부설 CRCERT (NSW, Australia)에서 시행한 세포증식저해 염색법을 사용한 짐재 독성 평가 보고서를 기준으로 하였다 (Stephan & Ulrike, 1993; Lynn, 1997). MPS를 48시간 처리하여 MTT 비색검정인 세포증식 저해율이 30% 이상이면 독성이 있는 것으로 판정하고 대조군은 배양액을 처리 하였다.
- 본 동물실험은 식품의약품안전청의 기준에 준하여 실험을 실시하였으며, 모든 실험동물은 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals[Department of Healty, Education, and Welfare Publication (National Institute of Health) 85-23, 1985]에 준하여 취급하였다. 각막과 외안부에 이상이 없는 성숙한 실험용토끼 (2.
성능/효과
- 이러한 구성성분 중에서 특히 세포의 증식에 영향을 미칠 수 있는 성분은 주로 보존제와 소독제 (disinfectant) 이다. 이상적인 보존제의 사용은 우리 눈에 세포독성을 미치지 않는 최소농도로 항미생물에 대한 최대효과를 발휘하는 것이라고 할 수 있다. 이에 다양한 보존제 종류의 항미생물 효과에 대한 많은 연구들이 이루어지고 있으나 이러한 보존제 성분이 우리 눈의 세포독성에 영향을 미치는 연구는 미미한 실정이다.
- MPS를 L929 세포주에 배양액의 25% 농도로 96- well plate에서 48시간 동안 배양한 후 처리하여 대조 군과 비교한 결과에서는 세포증식 저해가 각각(A) 54%, (B) 73%,(C) 36%로 세포증식 저해가 30%를 넘는 것으로 나타났다 (Fig. 1).
- H&E staining 결과, 대조군에서는 핵의 모양대로 둥글게 염색되었고 핵과 세포질의 구분이 되었으며, L929 세포주의 일반적인 모양인 방추형의 세포형태도 그대로 염색되었다. 각 MPS 처리군은 Opti-free express®, ReNu®, Free-sol plus® 순으로 세포형태변화가 있었으며 특히, Opti-free express®, ReNu®는 섬유아세포의 특징인 방추형에서 타원형 또는 원형의 형태로 위축되고 핵의 응축과 분절화양상을 관찰할 수 있었다(Fig.
- H&E staining 결과, 대조군에서는 핵의 모양대로 둥글게 염색되었고 핵과 세포질의 구분이 되었으며, L929 세포주의 일반적인 모양인 방추형의 세포형태도 그대로 염색되었다. 각 MPS 처리군은 Opti-free express®, ReNu®, Free-sol plus® 순으로 세포형태변화가 있었으며 특히, Opti-free express®, ReNu®는 섬유아세포의 특징인 방추형에서 타원형 또는 원형의 형태로 위축되고 핵의 응축과 분절화양상을 관찰할 수 있었다(Fig. 3).
- 실험 시작 전에 0.25% Rose bengal로 염색한 결과 모든 실험동물의 각막은 정상상태로 관찰되었고, 각 제품의 MPS를 14일간 점안한 후 0.25% Rose bengal staining하여 각막 표면을 관찰한 결과, 각막상피 조직 세포의 부분적인 탈락 및 괴사가 일어났음을 알 수있었다(Fig. 4).
- 반면에 ReNu®, Opti-free express * 와 Free-sol plus®를 처리한 각막상피를 각각 X500 (Fig. 5A,B,C), x 1,000 (Fig. 6A, B, C), x 3,000 (Fig. 7A, B, C)배로 관찰한 결과는 모두 비슷한 양상의 형태로 나타났는데 중층의 편평한 층이 여러 겹 벗겨진 형태로 각질화된 모습이 나타났고, 다각형 모자이크배열 형태의 균일도가 많이 감소하였으며, 표면에 세포돌기와 미세융모들이 불규칙하게 분포하였고 조직세포의 손상으로 인한 세포간극의 변형 및 중층편평상피층의 다각형 형태가 소실된 것으로 관찰되었다.
- ReNu®를 처리한 각막내피는 확대배율 500배로 관찰했을 때, 전체적으로 조직표면의 일부가 주름져 있으며 (Figs. 8A, 10A), 확대배율 1,000배, 3,000배로 확대관찰한 결과 육각형의 특징적인 각막내피 구조가 파괴되고 세포질의 손상을 관찰할 수 있었다(Fig. 9A). 특히 세포생존율이 가장 낮았던 Opti-free express®를 처리한 각막의 조직표면은 확대배율 500배로 관찰한결과 부분적으로 조직면이 한쪽으로 치우쳐 밀리면서 벗겨지고(Fig.
- 9A). 특히 세포생존율이 가장 낮았던 Opti-free express®를 처리한 각막의 조직표면은 확대배율 500배로 관찰한결과 부분적으로 조직면이 한쪽으로 치우쳐 밀리면서 벗겨지고(Fig. 8B) 방수와 각막실질간의 샘 장벽 (liaky barrier)으로서 중요한 역할을 하는 세포간극이 손상된 것을 확대관찰을 통해 알 수 있었다(Figs. 9B, 10B).
- 보존제는 관리용액에 첨가될 때 갖춰야 할 기본 요건들이 있는데, Remington's Pharmaceutical Sciences (Gennaro, 1985)에서는 다음과 같은 조건을 들고 있다. 첫째 광범위 영역에서의 항균작용을 나타내야 하며, 둘째 작용의 신속성이 이뤄지고 지속성이 유지되어야 하며, 셋째 알레르기 반응이나 자극 및 독성 이 없어야 하고, 넷째 포함된 다른 화합물 상호간의 화합적으로 안정된 상태를 유지하며, 마지막으로 화합물이 잘 용해되어야 한다는 것이다. 또한 점안제가 아닌 관리용액에 첨가될 때의 보존제는 렌즈에 흡수되지 않아야 하고 렌즈 자체에 물리적 변형이나 변수 불안정성, 자극이나 독성반응의 원인이 되어서는 안 된다.
- 10))과 CRCERT(NSW, Australia)에서 행한 세포증식 저해 염색법을 사용한 잠재독성 평가보고서 기준과 CIVA VISION CORPORATION에서 제시한 기준을 바탕으로 한 세포독성검정평가에서 볼때 MPS의 보존제 성분은 세포증식 저해율이 있음을 보고 하였고 (Pfister & Burstein, 1976; Robert, 1988) 세포증식 저해율이 높게 나온 제품들에는 특히 PHMB 가 포함되어 있어 PHMB가 독성의 원인이 됨을 유추할 수 있다. 본 연구에서도 이 보존제 성분이 포함된 ReNu®와 Free-sol plus® 제품의 세포수준 평가결과, 증식 저해율이 나타났으며, 백색 가토안의 각막상피 및 내피조직의 형태학적 관찰로 확인할 수 있었다. 각막은 외부로 노출되어 있기 때문에 장기간 동안 콘택트렌즈와 관리용액과의 접촉이 계속되어 각막의 조직학적인 구조에서 제일 바깥층인 상피조직 세포의 증식이 억제되며 생리학적으로 가장 중요한 내피조직의 손상이 유발될 수 있으며, 이는 각막의 생리학적 역할을 방해하는 장애 원인이 되어 심각한 부작용을 나타낼 수 있다.
- 본 연구에서 세포수준의 증식저해율 및 형태학적 관찰 결과 가장 독성이 크게 나타났으며, 임상적으로도 가장 자극감을 많이 호소했던 Opti-free express®제품에서는 최근 문제 시 되고 있는 가시아메메바 각막 염에 대한 탁월한 효과를 가지는 ALDOXTM성분이 polyquatemium과 함께 사용하고 있는데 이 성분은 양이온성 amidoamine으로서 stearamidopropyl dimethylamine, 7V-[3-(dimcthylamino) propyl] cotadecananide 또는 N, Ae-dimethyl-TVetetradecanoyl-l, 3-propylenediamine으로 알려져 있는 보존제 성분으로 이 제품에 5 mg/L을 포함하고 있다. (Rearme et al.
- , 2003). 그러나 MAPD 성분이 추가된 신제품에서 세포적 수준에서의 증식저해율 검정과 in vivo 실험에서 각막 상피와 내피 조직의 형태학적 변화를 관찰한결과, 저해율이 높았고 형태적 변화도 많은 것으로 관찰되었다.
후속연구
- 따라서 보존제의 효능성에 대한 연구와 함께 이 성분에 대한 세포독성 관련 농도 범위 및 안정성에 대한 연구 또한 지속적으로 이루어져야 하며, 이러한 보존제 성분의 활용에 따른 부작용에 대한 각막세포 차원의 밀도 있는 연구가 필요하다고 생각된다.
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