콩류 섭취가 유방암이나 골다공증, 그리고 심혈관계 질환 예방에 도움이 된다는 사실은 학계는 물론 일반인들에까지 큰 관심을 불러 일으키고 있다. 그러나 콩류, 특히 그 주성분인 genistein(GS)이 상기한 긍정적인 효과 외에도 여성의 생식계에 잠재적으로 부정적인 영향을 미칠 가능성에 대한 의문이 계속되어 왔다. 본 연구에서는 GS가 암컷 흰쥐의 사춘기 개시에 미치는 효과와 호르몬 수용체 등 이때의 다양한 생식 지표들의 변화들 조사하였다. GS(100mg/kg/day i.p.)를 생후 25일부터 사춘기 개시의 지표인 최초의 질구 개방(vaginal opening, VO)이 일어나는 날까지 투여하였다. 다음 날 희생시킨 후 난소와 자궁의 외양 변화와 조직 무게를 측정하여 GS가 이들 조직의 세포분열에 미치는 효과를 확인하였고, 조직절편의 현미경 관찰을 통해 해부학적인 변화 양상을 조사하였다. 한편 채취한 혈액내의 LH 수준은 방사면역측정법(RIA)로 측정하였다. 또한 자궁 성숙의 지표가 되는 프로게스테론 수용체(PR)의 mRNA 수준에 대한 정량적인 RT-PCR 조사를 수행하였다. GS 투여에 의해 질구 개방이 앞당겨짐이 확인되었고 ($35.3{\pm}0.7$ day in control group vs $31.2{\pm}0.6$ day in GS group, p<0.0l), 이 때 GS군의 체중이 대조군에 비해 유의하게 낮음을 관찰하였다. 난소와 자궁의 크기와 무게, 그리고 혈중 LH 수준이 GS군에서 유의하게 증가함이 관찰되었다. GS군의 난소에서는 성숙의 지표가 되는 그라프 난포(Graafian follicle)와 황체가 관찰되었으나 대조군의 난소는 미성숙한 난포들만이 관찰되었다. 자궁의 경우도 GS군에서는 내막층과 근막층은 물론 상피층까지 잘 발달된 과다 성장 상태와 함께 분비선 수의 증가가 나타났으나 대조군에서는 모든 세포층의 발달이 미약한 상태였다. 이러한 결과들은 GS의 에스트로겐 유사 효과에 기인하는 것으로 보인다. RT-PCR에서 난소와 자궁에서의 PR mRNA 수준은 GS 투여에 의해 발현 증가가 나타났다. 결론적으로, 본 연구는 사춘기 전 특정 시기에 단기적인 GS 투여에 의해 암컷 흰쥐의 생식계가 활성화되고, 그 결과 조기 사춘기가 유도될 수 있음을 시사한다.
콩류 섭취가 유방암이나 골다공증, 그리고 심혈관계 질환 예방에 도움이 된다는 사실은 학계는 물론 일반인들에까지 큰 관심을 불러 일으키고 있다. 그러나 콩류, 특히 그 주성분인 genistein(GS)이 상기한 긍정적인 효과 외에도 여성의 생식계에 잠재적으로 부정적인 영향을 미칠 가능성에 대한 의문이 계속되어 왔다. 본 연구에서는 GS가 암컷 흰쥐의 사춘기 개시에 미치는 효과와 호르몬 수용체 등 이때의 다양한 생식 지표들의 변화들 조사하였다. GS(100mg/kg/day i.p.)를 생후 25일부터 사춘기 개시의 지표인 최초의 질구 개방(vaginal opening, VO)이 일어나는 날까지 투여하였다. 다음 날 희생시킨 후 난소와 자궁의 외양 변화와 조직 무게를 측정하여 GS가 이들 조직의 세포분열에 미치는 효과를 확인하였고, 조직절편의 현미경 관찰을 통해 해부학적인 변화 양상을 조사하였다. 한편 채취한 혈액내의 LH 수준은 방사면역측정법(RIA)로 측정하였다. 또한 자궁 성숙의 지표가 되는 프로게스테론 수용체(PR)의 mRNA 수준에 대한 정량적인 RT-PCR 조사를 수행하였다. GS 투여에 의해 질구 개방이 앞당겨짐이 확인되었고 ($35.3{\pm}0.7$ day in control group vs $31.2{\pm}0.6$ day in GS group, p<0.0l), 이 때 GS군의 체중이 대조군에 비해 유의하게 낮음을 관찰하였다. 난소와 자궁의 크기와 무게, 그리고 혈중 LH 수준이 GS군에서 유의하게 증가함이 관찰되었다. GS군의 난소에서는 성숙의 지표가 되는 그라프 난포(Graafian follicle)와 황체가 관찰되었으나 대조군의 난소는 미성숙한 난포들만이 관찰되었다. 자궁의 경우도 GS군에서는 내막층과 근막층은 물론 상피층까지 잘 발달된 과다 성장 상태와 함께 분비선 수의 증가가 나타났으나 대조군에서는 모든 세포층의 발달이 미약한 상태였다. 이러한 결과들은 GS의 에스트로겐 유사 효과에 기인하는 것으로 보인다. RT-PCR에서 난소와 자궁에서의 PR mRNA 수준은 GS 투여에 의해 발현 증가가 나타났다. 결론적으로, 본 연구는 사춘기 전 특정 시기에 단기적인 GS 투여에 의해 암컷 흰쥐의 생식계가 활성화되고, 그 결과 조기 사춘기가 유도될 수 있음을 시사한다.
There is growing concern that dietary soy intake is associated with protection of breast cancer. However, questions persist on the potential adverse effects of the main soy constituent genistein(GS) on female reproductive physiology. In this study, we examined whether prepubertal exposure to GS affe...
There is growing concern that dietary soy intake is associated with protection of breast cancer. However, questions persist on the potential adverse effects of the main soy constituent genistein(GS) on female reproductive physiology. In this study, we examined whether prepubertal exposure to GS affected on the onset of puberty and the associated reproductive parameters such as hormone receptor expressions in female rats. GS(100mg/kg/day) was administrated daily from postnatal day 25(PND 25) to the day when the first vaginal opening(VO) was observed, and the animals were sacrificed on the day after VO occurred. Gross anatomy and tissue weight were compared to test the GS's effect on the cell proliferation. Furthermore, histological studies were performed to assess the structural alterations in tissues. Specific radioimmunoassay(RIA) were carried out to measure serum LH levels. To determine the transcriptional changes in progesterone receptors(PR), total RNAs were extracted from ovary and uterus and were applied to semi-quantitative reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR). As a results, advanced VO was shown in the GS group(PND $31.2{\pm}0.6$) compared to the vehicle group (PND $35.3{\pm}0.7$). GS treatment significantly increased wet weight of ovaries and uteri compared to the vehicle group. Increased serum LH levels were also shown in the GS group. Graafian follicles and corpora lutea(CL) were observed only in the ovaries from GS treated animals. Similarly, hypertrophy of luminal and glandular uterine epithelium were found only in the GS group. Collectively, these effects were probably due to the estrogenic effects of GS. In the semi-quantitative RT-PCR studies, the transcriptional activities of PR in both ovary and uterus from GS-treated group were significantly higher than those from the vehicle group. The present studies demonstrated that acute exposure to GS, at levels comparable to the ranges of human exposure, during the critical period of prepubertal stage activates the reproductive system resulting precocious puberty in immature female rats.
There is growing concern that dietary soy intake is associated with protection of breast cancer. However, questions persist on the potential adverse effects of the main soy constituent genistein(GS) on female reproductive physiology. In this study, we examined whether prepubertal exposure to GS affected on the onset of puberty and the associated reproductive parameters such as hormone receptor expressions in female rats. GS(100mg/kg/day) was administrated daily from postnatal day 25(PND 25) to the day when the first vaginal opening(VO) was observed, and the animals were sacrificed on the day after VO occurred. Gross anatomy and tissue weight were compared to test the GS's effect on the cell proliferation. Furthermore, histological studies were performed to assess the structural alterations in tissues. Specific radioimmunoassay(RIA) were carried out to measure serum LH levels. To determine the transcriptional changes in progesterone receptors(PR), total RNAs were extracted from ovary and uterus and were applied to semi-quantitative reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR). As a results, advanced VO was shown in the GS group(PND $31.2{\pm}0.6$) compared to the vehicle group (PND $35.3{\pm}0.7$). GS treatment significantly increased wet weight of ovaries and uteri compared to the vehicle group. Increased serum LH levels were also shown in the GS group. Graafian follicles and corpora lutea(CL) were observed only in the ovaries from GS treated animals. Similarly, hypertrophy of luminal and glandular uterine epithelium were found only in the GS group. Collectively, these effects were probably due to the estrogenic effects of GS. In the semi-quantitative RT-PCR studies, the transcriptional activities of PR in both ovary and uterus from GS-treated group were significantly higher than those from the vehicle group. The present studies demonstrated that acute exposure to GS, at levels comparable to the ranges of human exposure, during the critical period of prepubertal stage activates the reproductive system resulting precocious puberty in immature female rats.
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문제 정의
본 연구는 GS가 암컷 흰쥐의 사춘기 개시에 미치는 효과를 측정하기 위해, 인간이 섭취하는 범위에 들어가는 생리적인 농도(100mg/kg B.W.)를 사춘기 전(생후 25일) 흰쥐에 질구개방이 일어날 때까지 매일 투여하는 모델을 채택하였고, 생식 기관의 성숙 상태를 조사하였고, 생식 기관의 성숙과 관련된 프로게스테론 수용체(PR)의 발현 양상을 조사하였다.
, 1999). 본 연구에서는 사춘기 직전의 비교적 단기간 GS에 노출될 경우 사춘기 개시가 유의하게 빨라짐을 보여준 것으로 앞서 언급한 바처럼 GS에 대한 노출 시기가 주요한 관건으로 추정된다. 이 결과는 인간의 경우에 적용될 경우 유전적 소인이 없이 촉진되는 성적 조숙 현상의 설명중 하나가 될 수 있을 것이다.
제안 방법
생후 25일(53〜58g)의 미성숙한 암컷 흰쥐에 GS(100mg/ kg B.W., Biospectrum)를 매일 복강 주사하였고, 대조군으로는 com oil(Sigma, USA)을 개체 당 200 μL씩 복강 주사하였다. 동물들은 매일 오전 10시에 질구 개방 여부를 확인하였으며, 질구 개방이 일어난 경우 생리식염수를 사용한 질도말법(vaginal smear)으로 슬라이드에 도포한 질 상피세포를 현미경하에서 확인하였으며 다음 날 오후 5시에 희생시켰다.
, Biospectrum)를 매일 복강 주사하였고, 대조군으로는 com oil(Sigma, USA)을 개체 당 200 μL씩 복강 주사하였다. 동물들은 매일 오전 10시에 질구 개방 여부를 확인하였으며, 질구 개방이 일어난 경우 생리식염수를 사용한 질도말법(vaginal smear)으로 슬라이드에 도포한 질 상피세포를 현미경하에서 확인하였으며 다음 날 오후 5시에 희생시켰다. 희생 후 즉시 조직 무게를 측정한 후 RNA를 추출하였고, 혈액은 원심분리(4℃, 1500xg, 15분)하여 혈장을 얻은 후 LH 방사 면역 측정법을 시행하기 전까지 -20 ℃에 보관하였다.
대조군과 실험군에서 얻은 난소와 자궁의 성적인 성숙정도를 조사하기 위하여 paraformaldehyde(4%)에 고정한 조직을 ethanol로 탈수한 다음 파라핀으로 포매 한 후 5〜 7μm 두께로 연속 절편을 얻었다. 조직 절편들은 hematoxylin-eosin으로 대조 염색하여 광학현미경 (Olympus) 하에서 관찰하였다.
두께로 연속 절편을 얻었다. 조직 절편들은 hematoxylin-eosin으로 대조 염색하여 광학현미경 (Olympus) 하에서 관찰하였다.
extraction method (Chomzynski & Sacchi, 1987)에 따라 추출하였다. 1 μg의 total RNA를 주형으로 하고 0.5 μg의 dT20 primer 와 AccuPower™ RT PreMix(Bioneer)를 사용하여 역전사하였다. PCR 반응은 1μL의 역전사 산물을 주형으로 하여 각각의 전사물에 해당하는 primer들과 Taq DNA polymerase(Takara)를 사용하였으며, 최종 반응 volume은 20μL이었다.
Table 1은 본 실험에서 사용된 primer들의 염기서열과 annealing 온도를 표시하였다. PCR 산물은 전기영동으로 분리하였고 ethidium bromide로 염색 후 ImagerⅢ-1D main software(Bioneer)로 정량하였다. 정량을 위한 internal control PCR로는 GAPDH를 수행하였다.
PCR 산물은 전기영동으로 분리하였고 ethidium bromide로 염색 후 ImagerⅢ-1D main software(Bioneer)로 정량하였다. 정량을 위한 internal control PCR로는 GAPDH를 수행하였다.
대상 데이터
상명대학교 실험동물 사육장에서 18〜22℃로 일정하게유지되는 온도와 일정한 광주기(12시간 조명, 12시간 소등) 그리고 먹이와 물의 접근을 자유롭게 한 상태(ad libitum)에서 사육한 Sprague-Dawley(SD) strain 흰쥐를 사용하였다.
데이터처리
실험 결과의 통계적 처리는 Student's t-test에 의해 이루어졌으며 P-value 0.05 이하를 통계적으로 유의하다고 판정하였다.
이론/모형
혈중 LH 수준은 double antibody RIA reagent를 사용하여 측정하였다(Lee et al., 1994). Iodination용 펩타이드인 NIDDK-rLH-I-9과 Na-I125(luCi, NEN)를 chloramine T 방법으로 표지하였다.
, 1994). Iodination용 펩타이드인 NIDDK-rLH-I-9과 Na-I125(luCi, NEN)를 chloramine T 방법으로 표지하였다. 흰쥐 LH에 대한 항혈청은 NIDDK-rLH-S-10, reference 펩타이드는 NIDDK-rLH-RR-2를 사용하였다.
조직의 total RNA는 guanidium thiocyanate-phenol-chlo-roform extraction method (Chomzynski & Sacchi, 1987)에 따라 추출하였다. 1 μg의 total RNA를 주형으로 하고 0.
성능/효과
암컷 흰쥐의 사춘기 개시 지표로 널리 사용되는 질구 개방의 경우 GS군에서는 주사 개시 후 7일째로 생후 31.2±0.6일, 그리고 대조군에서는 주사 개시 후 11일째인 생후 35.3±0.7 일에 일어나 GS에 의해 유의하게(p<0.01) 성적인 성숙이 촉진됨이 확인되었다(Fig. 1). 질구 개방이 일어난 다음날 희생시키기 전 체중을 비교한 결과 대조군에 비해 GS 군에서 유의한 감소가 나타났다(대조군, 93.
1). 질구 개방이 일어난 다음날 희생시키기 전 체중을 비교한 결과 대조군에 비해 GS 군에서 유의한 감소가 나타났다(대조군, 93.0±3.5g vs GS 군, 85.5± 3.6g, p<0.01, Fig. 2). 혈중 LH 수준은 GS 투여에 의해 2배 가까이 증가하는 경향을 보였다(Table 2).
혈중 LH 수준은 GS 투여에 의해 2배 가까이 증가하는 경향을 보였다(Table 2). GS 군에서 질구개방이 일어난 날 질도말법으로 질 상피세포를 확인한 결과, 질구 개방이 일어나지 않은 대조군은 상피세포를 채취할 수없었으며(Fig. 3 A&C), GS 군에서는 발정 주기에서 estrus 시기임을 나타내는 각질 세포들(comified cells; Urbanski & Ojeda, 1985))이 나타났다(Fig. 3 B&D). 조직 외형 관찰에서, GS 군의 난소는 대조군에 비해 크고 바깥쪽으로 잘 발달된 난포들이 위치하였고, 자궁 역시 GS 군에서 더 발달된 상태를 보였다(Fig.
3 B&D). 조직 외형 관찰에서, GS 군의 난소는 대조군에 비해 크고 바깥쪽으로 잘 발달된 난포들이 위치하였고, 자궁 역시 GS 군에서 더 발달된 상태를 보였다(Fig. 4 A&B). 또한 GS 군의 난소와 자궁의 무게가 대조군에 비해 모두 유의하게 증가함이 확인되었다(Fig.
4 A&B). 또한 GS 군의 난소와 자궁의 무게가 대조군에 비해 모두 유의하게 증가함이 확인되었다(Fig. 4 C&D). 조직학적인 연구에서, 대조군의 난소는 작고 미성숙한 1차와 2차 난포들이 주로 관찰된 것에 비해 GS 군에서는 난소 성숙의 지표가 되는 그라프 난포와 황체가 다수 관찰되었다(Fig.
4 C&D). 조직학적인 연구에서, 대조군의 난소는 작고 미성숙한 1차와 2차 난포들이 주로 관찰된 것에 비해 GS 군에서는 난소 성숙의 지표가 되는 그라프 난포와 황체가 다수 관찰되었다(Fig. 5 A&B). 자궁의 경우, GS 군에서는 내강즉 상피(luminal epithelium), 내 막층과 근막층은 물론 상피층까 지 잘 발달된 과다 성장(hypertrophy) 상태와 함께 분비 선 수 의 증가가 나타났으나 대조군에서는 모든 세포층과 분비선의 발달이 미약한 상태 였다(Fig.
5 C&D). 유전자 발현에 있어서 암컷 성성숙 개시의 지표가 되는 프로게스테론 수용체의 mRNA 수준을 조사한 결과 난소와 자궁 모두 GS 군이 대조군에 비해 유의하게 높았다(Fig. 6 A&B).
, 2002). 본 연구 결과는 사춘기 개시 이전의 GS 투여 역시 난소와 자궁에서의 PR 유전자 발현을 촉진함을 나타낸 것이다. 한편 ER 유전자 발현에 미치는 영향은 조직 특이적인 것으로 보인다.
결론적으로, 본 연구는 사춘기 전 특정 시기에 단기적인 GS 투여에 의해 암컷 흰쥐의 성호르몬 조절 축이 활성화되어 그 결과로 조기 사춘기가 유도됨을 보여준 것으로, 아동기의 식이습관에 의해서 사춘기 개시가 조절될 가능성을 시사한다. GS가 인간의 건강에 대단히 유익하다고 알려진 콩류의 주성분이라는 점에서 향후 GS의 투여 시기, 농도와 효과에 대한 다양하고도 세밀한 연구가 계속되어야할 것으로 사료된다.
후속연구
시사한다. GS가 인간의 건강에 대단히 유익하다고 알려진 콩류의 주성분이라는 점에서 향후 GS의 투여 시기, 농도와 효과에 대한 다양하고도 세밀한 연구가 계속되어야할 것으로 사료된다.
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