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문제 정의
- 본 연구자들은 VCZ와 유사하게 항안드로겐 효과를 나타내는 내분비계 장애물질인 di(2-ethyl hexyl)phthalate(DEHP)에 의해 암컷 흰쥐의 사춘기 개시가 지연됨을 보고한 바 있다(Lee & Lee, 2006). 본 연구는 VCZ가 DEHP와 유사한 영향을 보이리라는 가정하에 현실적인 VCZ 노출 상황으로 여겨지는 저농도를 선택하여 암컷 흰쥐의 사춘기 개시에 미치는 효과를 조사한 것이다. 이를 위해, 저용량(10 mg/kg/day)의 VCZ를 비교적 단기간인 사춘기 이전(생후 21일)에서 질구 개방이 일어날 때까지 매일 투여하는 모델을 채택하였다.
제안 방법
- 생후 21일(35～40 g B.W.)된 미성숙 암컷 흰쥐에 VCZ(10 mg/kg/day; Sigma, USA)를 매일 복강 주사하였고, 대조군으로는 DMSO(200 μL/animal; Duksan, Korea)를 주사하였다.
- 본 연구는 VCZ가 DEHP와 유사한 영향을 보이리라는 가정하에 현실적인 VCZ 노출 상황으로 여겨지는 저농도를 선택하여 암컷 흰쥐의 사춘기 개시에 미치는 효과를 조사한 것이다. 이를 위해, 저용량(10 mg/kg/day)의 VCZ를 비교적 단기간인 사춘기 이전(생후 21일)에서 질구 개방이 일어날 때까지 매일 투여하는 모델을 채택하였다. 실험대상의 체중 변화와 생식기관의 성숙 정도를 관찰하였고, 생식기관의 성적인 성숙과 관련된 프로게스테론 수용체(PR)의 발현 양상을 조사하였다.
- 이를 위해, 저용량(10 mg/kg/day)의 VCZ를 비교적 단기간인 사춘기 이전(생후 21일)에서 질구 개방이 일어날 때까지 매일 투여하는 모델을 채택하였다. 실험대상의 체중 변화와 생식기관의 성숙 정도를 관찰하였고, 생식기관의 성적인 성숙과 관련된 프로게스테론 수용체(PR)의 발현 양상을 조사하였다.
- )된 미성숙 암컷 흰쥐에 VCZ(10 mg/kg/day; Sigma, USA)를 매일 복강 주사하였고, 대조군으로는 DMSO(200 μL/animal; Duksan, Korea)를 주사하였다. 동물들은 매일 오전 10시에 주사 후 체중을 측정하고 질구 개방 여부를 확인하였다. 질구 개방이 일어난 경우, 생리식염수를 사용한 질도말법(vaginal smear)으로 슬라이드에 도포한 질 상피세포를 현미경하에서 확인하고 오후 5시에 희생시켰다.
- 동물들은 매일 오전 10시에 주사 후 체중을 측정하고 질구 개방 여부를 확인하였다. 질구 개방이 일어난 경우, 생리식염수를 사용한 질도말법(vaginal smear)으로 슬라이드에 도포한 질 상피세포를 현미경하에서 확인하고 오후 5시에 희생시켰다. 희생 후 즉시 조직 무게를 측정하고 RNA를 추출하였다.
- 질구 개방이 일어난 경우, 생리식염수를 사용한 질도말법(vaginal smear)으로 슬라이드에 도포한 질 상피세포를 현미경하에서 확인하고 오후 5시에 희생시켰다. 희생 후 즉시 조직 무게를 측정하고 RNA를 추출하였다.
- 희생 후 채취한 난소와 자궁의 성적인 성숙 정도를 조사하기 위하여 paraformaldehyde(4%)에 고정한 조직을 ethanol로 탈수한 다음 파라핀 포매 후 5～7 μm 두께로 연속 절편을 얻었다.
- 1 μg의 total RNA를 주형으로 0.5 μg의 dT20 primer와 AccuPowerTM RT PreMix(Bioneer)를 사용하여 최종 반응 volume 20 μL로 역전사하였다.
- 희생 후 채취한 난소와 자궁의 성적인 성숙 정도를 조사하기 위하여 paraformaldehyde(4%)에 고정한 조직을 ethanol로 탈수한 다음 파라핀 포매 후 5～7 μm 두께로 연속 절편을 얻었다. 조직 절편들은 hematoxylin-eosin으로 대조 염색하여 광학현미경(Olympus)으로 관찰하였다.
대상 데이터
- 상명대학교 실험동물 사육장에서 일정한 온도와 광주기(18～22℃; 12시간 조명, 12시간 소등), 먹이와 물 섭취가 자유로운 상태(ad libitum)에서 사육한 Sprague-Dawley(SD) strain 흰쥐를 사용하였다. 생후 21일(35～40 g B.
데이터처리
- 실험 결과의 통계적 처리는 Student's t-test에 의해 이루어졌으며, P-value 0.05 이하를 통계적으로 유의하다고 판정하였다.
이론/모형
- 조직의 total RNA는 guanidium thiocyanate-phenol-chloroform extraction 방법(Chomczynski & Sacchi, 1987)에 따라 추출하였다.
- PCR 산물은 전기영동으로 분리하였고, ethidium bromide로 염색후 ImagerⅢ-1D main software(Bioneer)로 정량하였다. 정량을 위한 internal control PCR에서는 GAPDH primer를 사용하였다.
성능/효과
- 따라서 질구 개방일은 각각 생후 34.00±1.22일(대조군)과 38.20±1.92일(VCZ)이었다.
- 생후 21일부터 주사를 시작하여 암컷 흰쥐의 사춘기 개시 지표로 널리 사용되는 질구 개방이 일어난 날을 조사한 결과, 총 주사일수는 대조군(14.00±1.22회)에 비해 VCZ군(17.20±1.92회)에서 유의하게 증가하였다(p<0.01, Fig. 1).
- 2). 대조군의 질구 개방일인 생후 34일에 질도말법으로 질 상피세포를 확인한 결과, 대조군에서는 발정주기에서 estrus 시기임을 나타내는 각질 세포들(cornified cells)이 나타났으나(Fig. 3 A, C), 질구 개방이 일어나지 않은 VCZ군은 상피세포를 채취할 수 없었다(Fig. 3 B, D). 조직 외형 관찰에서, 대조군의 난소는 VCZ군에 비해 크고 바깥쪽으로 잘 발달된 난포들이 위치하였고, 자궁 역시 대조군에서 더 발달된 상태를 보였다(Fig.
- 4 A, B). 난소와 자궁의 무게 역시 예상대로 대조군에 비해 VCZ 군에서 모두 유의하게 감소하였다(Fig. 4 C, D). 조직학적인 연구에서, 대조군의 난소는 성숙의 지표가 되는 그라프 난포와 황체가 다수 관찰되었으나, VCZ군에서는 작고 미성숙한 1차와 2차 난포들과 퇴화중인 난포(atretic follicle)들이 주로 관찰되었다(Fig.
- 5 A, B). 대조군의 자궁은 내강측 상피(luminal epithelium), 내막층과 근막층은 물론 외측 상피층까지 잘 발달된 상태이면서 동시에 분비선 수의 증가가 나타났으나, VCZ군의 자궁에서는 모든 세포층과 분비선의 발달이 미약한 상태(hypotrophy)였다(Fig. 5 C, D). 유전자 발현에 있어서 암컷 성성숙 개시의 지표가 되는 프로게스테론 수용체의 mRNA 수준을 조사한 결과, 난소에서 VCZ군이 대조군에 비해 유의하게 낮았으며, 자궁에서는 대조군과 VCZ군이 비슷한 수준으로 나타났다(Fig.
- 5 C, D). 유전자 발현에 있어서 암컷 성성숙 개시의 지표가 되는 프로게스테론 수용체의 mRNA 수준을 조사한 결과, 난소에서 VCZ군이 대조군에 비해 유의하게 낮았으며, 자궁에서는 대조군과 VCZ군이 비슷한 수준으로 나타났다(Fig. 6 A, B).
- 본 연구에서 생후 21일부터 VCZ (10 mg/kg/day)를 투여한 결과, 투여 후 38.20±1.92일에 질구 개방이 일어났으며(Fig. 1), 이러한 결과는 VCZ에 의해서 암컷 흰쥐의 평균 질구 개방일이 유의하게 지연됨을 의미한다.
- 비록 수컷에 비해 상대적으로 미약하겠지만 안드로겐 역시 암컷의 생식생리에서 그 자체 혹은 에스트로겐의 전구 물질로써 기능하므로(Palacios, 2007), VCZ에 노출된 암컷에서 일정 수준의 생식계 교란이 나타날 것으로 추정할 수 있다. 본 연구는 VCZ에 노출된 흰쥐 암컷에서 비교적 약한 생식 독성이지만, 신경내분비계 전반의 교란에 의해 초래되는 사춘기 개시 지연이 일어남을 보여주었다. 정상적인 사춘기가 일어나기 위해서는 성체에서 나타나는 GnRH-성선자극호르몬-성 스테로이드로 구성된 생식호르몬 축의 활성화가 일어나기 전에 다양한 중추 및 말초 신경들의 통합적 조절이 필요하다(Pawson et al.
- , 2002). 그러므로 본 연구 결과는 VCZ의 항안드로겐 효과에 의한 에스트로겐 생합성 저해로 인하여 사춘기가 지연된 것을 시사한다.
- 흥미롭게도 KiSS-1 뉴런에 leptin 수용체가 발현됨은 생식-대사 간의 밀접한 상호조절이 존재할 가능성을 보여준다(Tena-Sempere, 2006). 본 연구에서 생후 21일부터 대조군의 질구 개방이 일어나는 날까지 대조군과 VCZ 투여군의 체중을 측정한 결과, 대조군과 VCZ 투여군 사이에서 유의한 차이가 나타나지 않았는데(Fig. 2), 이는 체중 감소에 의해서 사춘기가 지연된 것이 아님을 의미한다. 그런데 생후 25일부터 DEHP를 복강 주사한 실험에서는 투여 2일 째부터 체중이 감소함이 보고되었는데(Lee & Lee, 2006), 이러한 차이는 VCZ가 DEHP보다 대사 독성은 적거나 없기 때문인 것으로 추정된다.
- , 2003) 보다 낮은 농도에서 수행되었다. 본 연구 결과는 NOAEL 수준 이하의 VCZ 노출에 의해서도 유의하게 암컷 사춘기 개시가 지연됨을 보인 것으로서, 적은 양의 VCZ 노출로도 인간과 실험동물의 생식계, 특히 암컷에도 영향을 미칠 수 있음을 시사한다.
후속연구
- 4, 5)는 VCZ에 의한 안드로겐 작용 결핍과 에스트로겐 생합성 저해로 난소와 자궁의 성장이 지연되었기 때문으로 추정된다. 난소내 프로게스테론 수용체의 발현 감소(Fig. 6)는 체내에서 대사된 VCZ 대사산물들인 M1과 M2가 안드로겐 수용체에 길항제로 작용하기 때문으로 추정되지만, 자궁에서는 발현 감소가 관찰되지 않는 점에서 보다 상세한 연구가 필요하다고 판단된다.
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