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문제 정의
- 본 연구에서는 암컷 흰쥐 시상하부에서의 GS 투여 효과와 이에 관여하는 ER 아형(ERα과 ERβ)을 조사하였다.
제안 방법
- 조직의 total RNA는 guanidium thiocyanate-phenol-chloroform extraction method(Chomczynski & Sacchi, 1987)에 따라 추출하였다. 1 ㎍의 total RNA를 주형으로 하고 0.5 ㎍의 dT20 primer와 AccuPowerTM RT PreMix(Bioneer)를 사용하여 역전사하였다. PCR 반응은 1 ㎕의 역전사 산물을 주형으로 하여 각각의 전사물에 해당하는 primer들과 Taq DNA polymerase(Takara)를 사용하였으며, 최종 반응 volume은 20 ㎕였다.
- 주사할 부위의 털을 제거한 뒤 피부를 절개하고, 치과용 드릴로 주입할 부위의 두개골을 천공하였다. GS(3.4 ㎍/10 ㎕; LC laboratories, USA) 또는 vehicle(0.9% saline solution with 0.3 ㎍/㎕ ascorbic acid)을 제3뇌실(0.92 ㎜ posterior and 1.4 ㎜ right to bregma; 3.2 ㎜ below the dura)로 주입하였다. 주입은 26-gauge cannula와 연결된 Hamilton microsyringe(10 ㎕)를 사용하여 5초당 0.
- 5 ㎍의 dT20 primer와 AccuPowerTM RT PreMix(Bioneer)를 사용하여 역전사하였다. PCR 반응은 1 ㎕의 역전사 산물을 주형으로 하여 각각의 전사물에 해당하는 primer들과 Taq DNA polymerase(Takara)를 사용하였으며, 최종 반응 volume은 20 ㎕였다. Table 1은 본 실험에서 사용된 primer들의 염기서열과 annealing 온도를 표시한 것이다.
- 이를 위해 실험동물로는 에스트로겐성 물질의 입력 효과가 잘 나타나면서도 생식주기 단계의 혼동을 피할 수 있는 미성숙한 사춘기 직전 암컷 흰쥐모델(생후 30일)을 사용하였다. 또한 경구 투여나 복강 및 피하주사 투여에 의한 전신적인 효과(systemic effect)를 배제하고, 시상하부 특이적인 작용을 조사하기 위해 GS를 제3뇌실내 미세주입하는 모델을 사용하였다.
- 생후 30일된 암컷 흰쥐를 Zoletil50(5 ㎎/㎏; Virbac, France)을 1회 복강 주사하여 마취시키고, stereotaxic apparatus(Stoelting. USA)에 고정하였다. 주사할 부위의 털을 제거한 뒤 피부를 절개하고, 치과용 드릴로 주입할 부위의 두개골을 천공하였다.
- PCR 산물은 전기영동으로 분리하였고 ethidium bromide로 염색한 후 Imager Ⅲ-1D main software(Bioneer)로 정량하였다. 정량을 위한 internal control PCR로는 GAPDH primer를 사용하여 수행하였다.
- USA)에 고정하였다. 주사할 부위의 털을 제거한 뒤 피부를 절개하고, 치과용 드릴로 주입할 부위의 두개골을 천공하였다. GS(3.
대상 데이터
- 상명대학교 실험동물 사육장에서 18～22℃로 일정하게 유지되는 온도와 일정한 광주기(12시간 조명, 12시간 소등) 그리고 먹이와 물의 접근을 자유롭게 한 상태(ad libitum)에서 사육한 Sprague-Dawley(SD) strain 흰쥐를 사용하였다. 실험동물의 사육 및 처치는 식품의약품안전청(KFDA) 가이드라인에 따라 상명대학교 실험동물위원회의 승인하에 수행되었다.
- 본 연구에서는 암컷 흰쥐 시상하부에서의 GS 투여 효과와 이에 관여하는 ER 아형(ERα과 ERβ)을 조사하였다. 이를 위해 실험동물로는 에스트로겐성 물질의 입력 효과가 잘 나타나면서도 생식주기 단계의 혼동을 피할 수 있는 미성숙한 사춘기 직전 암컷 흰쥐모델(생후 30일)을 사용하였다. 또한 경구 투여나 복강 및 피하주사 투여에 의한 전신적인 효과(systemic effect)를 배제하고, 시상하부 특이적인 작용을 조사하기 위해 GS를 제3뇌실내 미세주입하는 모델을 사용하였다.
데이터처리
- 실험 결과의 통계적 처리는 Student's t-test에 의해 이루어졌으며, P-value 0.05 이하를 통계적으로 유의하다고 판정하였다.
이론/모형
- 조직의 total RNA는 guanidium thiocyanate-phenol-chloroform extraction method(Chomczynski & Sacchi, 1987)에 따라 추출하였다.
- 주입은 26-gauge cannula와 연결된 Hamilton microsyringe(10 ㎕)를 사용하여 5초당 0.5 ㎕ 속도로 하였으며, 투여용량은 이전 논문들을 참고하여 결정하였다(Misztal et al., 2008; Lee & Lee, 2010).
성능/효과
- 위의 ICV GS 투여 실험에서 저자들은 시상하부 요인들에 대해서는 조사하지 않았으므로, 결과 해석상에 한계가 있다. 한편, 본 연구진이 이전에 수행한 성체 흰쥐에 ICV 경로로 GS를 투여한 결과와 본 실험에서 사춘기 전 흰쥐에 투여한 결과를 비교해 보면, (i) GAD67와 KiSS-1의 경우 두 실험모델에서 동일하게 유의한 상승을, (ii) GPR54의 경우 성체에서는 유의한 상승, 사춘기전 동물에서는 상승 경향이지만 유의성이 없었고, (iii) GnRH의 경우 성체에서는 유의한 상승, 사춘기전 동물에서는 유의한 하락이었다. GnRH 발현상의 차이는 이전 실험에 사용한 성체가 생식주기상으로 Proestrus 상태였고, 금번 실험에 사용한 생후 30일 흰쥐의 경우 Diestrus 상태에 가깝다는 점과 투여기간(3시간 vs 2시간)의 차이에 따른 것으로 추론된다.
- 한편, 본 연구진이 이전에 수행한 성체 흰쥐에 ICV 경로로 GS를 투여한 결과와 본 실험에서 사춘기 전 흰쥐에 투여한 결과를 비교해 보면, (i) GAD67와 KiSS-1의 경우 두 실험모델에서 동일하게 유의한 상승을, (ii) GPR54의 경우 성체에서는 유의한 상승, 사춘기전 동물에서는 상승 경향이지만 유의성이 없었고, (iii) GnRH의 경우 성체에서는 유의한 상승, 사춘기전 동물에서는 유의한 하락이었다. GnRH 발현상의 차이는 이전 실험에 사용한 성체가 생식주기상으로 Proestrus 상태였고, 금번 실험에 사용한 생후 30일 흰쥐의 경우 Diestrus 상태에 가깝다는 점과 투여기간(3시간 vs 2시간)의 차이에 따른 것으로 추론된다. 따라서 향후 GS 투여 조건을 더욱 세분화하고, ER 특이적인 유사체를 병용투여하는 조사가 필요하다고 사료된다.
- 결론적으로, 본 연구는 사춘기전 암컷 흰쥐에서 GS의 미량 단기노출에 의해 시상하부내의 GnRH 조절시스템이 직접 변화됨을 보여주었으며, 이러한 GS의 시상하부 특이적 효과에 ERβ 경로가 관여할 가능성을 강력히 시사한다.
- 본 연구에서는 GS icv 투여에 의해 시상하부 ERβ 발현이 유의하게 상승하지만 ERα 발현은 변화가 없음을 관찰하였으며, 면역조직화학법을 사용한 조사결과도 이와 일치한다(data not shown).
- 시상하부 ER 아형들의 발현 변화에 관하여, GS 미세주입 군에서 ERα 발현은 대조군에 대비하여 유의한 변화가 없었으나(1:1.180±0.390 AU, Fig. 3A), ERβ 발현은 GS 투여에 의해 대조군 대비 유의하게 상승하였다(1:4.209±0.796 AU, p<0.01, Fig. 3B).
- 이 결과는 위치한 부위에 따라 kisspeptin 뉴런들의 반응이 상이하며, GS에 의한 KiSS-1 유전자 활성 조절이 ERα 경로로 방해되고, 따라서 GnRH 뉴런 활성도 변화할 가능성을 시사한다.
- 선행 연구에서 본 연구자들은 사춘기 전에 GS를 경구 투여했을 때 암컷 흰쥐의 생식계가 활성화되어 조기 사춘기가 유도되고, 암컷 성체에 GS를 뇌실내(intracerebroventricular, ICV) 미세주입했을 때 kisspeptin-GnRH 뉴런 회로의 활성화가 일어남을 관찰하였다(Lee & Lee, 2006a; Lee & Lee, 2010). 이러한 결과들은 GS 노출에 따라 암컷 사춘기 개시 시점이 변화할 수 있으며, 적어도 시상하부가 GS의 표적조직이 될 수 있고, GS의 에스트로겐성 효과가 전형적인 장기적인 것이 아닌 단기적으로 나타날 수 있음을 보여준 것이다. 한편, 본 연구자들은 GS 경구 투여에 의한 흰쥐 자궁과 난소에서의 에스트로겐 수용체(estrogen receptor, ER) 발현이 아형-ERα와 ERβ-별로 상이함을 관찰하였다(Lee & Lee, 2006b).
후속연구
- GnRH 발현상의 차이는 이전 실험에 사용한 성체가 생식주기상으로 Proestrus 상태였고, 금번 실험에 사용한 생후 30일 흰쥐의 경우 Diestrus 상태에 가깝다는 점과 투여기간(3시간 vs 2시간)의 차이에 따른 것으로 추론된다. 따라서 향후 GS 투여 조건을 더욱 세분화하고, ER 특이적인 유사체를 병용투여하는 조사가 필요하다고 사료된다.
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