약용곤충 무당벌레류 추출물의 항산화활성과 Cyclooxygenase-2 Promoter 억제활성 비교 Comparison of In Vitro Antioxidant Activity and Cyclooxygenase-2 Promoter Inhibitory Activity in Harmonia axyridis Pallas and Coccinella septempunctata $Linn\\dot{e}$원문보기
최근 곤충자원은 약용 및 식용으로 활용하려고 많은 연구가 되고 있으며 미래의 자원으로 발전할 수 있는 가능성은 충분하다. 본 연구는 곤충자원 중 칠성무당벌레와 무당벌레를 이용하여 생물학적 활성과 함께 약용 및 식용으로의 활용가능성을 알아보고자 하였다. 생물학적 활성을 알아보기 위하여 이들 추출물을 이용하여 항산화관련 실험인 DPPH, FRAP, linoleic acid산화 억제실험을 하였으며, 분자 염증에 관련된 유전자인 Cyclooxygenase-2(Cox-2)의 promoter의 유전자 발현의 억제 유무를 알아보았다. 항산화 효과에 있어서는 무당벌레의 DW추출물에서 높은 활성을 나타내었으며, Cox-2의 promoter 활성을 조사한 결과 DW 추출물에서 Cox-2의 promoter 활성을 약 25% 정도 억제하는 무당벌레의 DW추출물을 발견하였는데 추출물의 산업적인 활용가능성을 확인하기 위하여 보다 많은 연구가 필요하다.
최근 곤충자원은 약용 및 식용으로 활용하려고 많은 연구가 되고 있으며 미래의 자원으로 발전할 수 있는 가능성은 충분하다. 본 연구는 곤충자원 중 칠성무당벌레와 무당벌레를 이용하여 생물학적 활성과 함께 약용 및 식용으로의 활용가능성을 알아보고자 하였다. 생물학적 활성을 알아보기 위하여 이들 추출물을 이용하여 항산화관련 실험인 DPPH, FRAP, linoleic acid 산화 억제실험을 하였으며, 분자 염증에 관련된 유전자인 Cyclooxygenase-2(Cox-2)의 promoter의 유전자 발현의 억제 유무를 알아보았다. 항산화 효과에 있어서는 무당벌레의 DW추출물에서 높은 활성을 나타내었으며, Cox-2의 promoter 활성을 조사한 결과 DW 추출물에서 Cox-2의 promoter 활성을 약 25% 정도 억제하는 무당벌레의 DW추출물을 발견하였는데 추출물의 산업적인 활용가능성을 확인하기 위하여 보다 많은 연구가 필요하다.
Insect resources have been widely recognized that seven millions of insects exhibit it own biological activity by whole body or its metabolic intermediates. In order to investigate antioxidant activity and compare the cyclooxygenase-2 promoter activity from insect extract, we tested in vitro antioxi...
Insect resources have been widely recognized that seven millions of insects exhibit it own biological activity by whole body or its metabolic intermediates. In order to investigate antioxidant activity and compare the cyclooxygenase-2 promoter activity from insect extract, we tested in vitro antioxidant assays and cyclooxygenase-2 promoter assay in Coccinella septempunctata Linne and Harmonia axyridis extracts have the anti-oxidant and cyclooxygenase-2 inhibition activities, we examined the anti-oxidant assays including DPPH, FRAP and linoleic acid, ana inhibition of cyclooxygenase-2 expression using a cyclooxygenase-2 promoter-inserted stable cell line. We found that Harmonia axyridis Pallas extract had potentials to anti-oxidant activity and inhibited about 25% of cyclooxygenase-2 transcription activity. These findings indicate that Coccinella septempunctata Linne and Harmonia axyridis Pallas extracts could be an useful insect resource for agrobiotechnological purposes.
Insect resources have been widely recognized that seven millions of insects exhibit it own biological activity by whole body or its metabolic intermediates. In order to investigate antioxidant activity and compare the cyclooxygenase-2 promoter activity from insect extract, we tested in vitro antioxidant assays and cyclooxygenase-2 promoter assay in Coccinella septempunctata Linne and Harmonia axyridis extracts have the anti-oxidant and cyclooxygenase-2 inhibition activities, we examined the anti-oxidant assays including DPPH, FRAP and linoleic acid, ana inhibition of cyclooxygenase-2 expression using a cyclooxygenase-2 promoter-inserted stable cell line. We found that Harmonia axyridis Pallas extract had potentials to anti-oxidant activity and inhibited about 25% of cyclooxygenase-2 transcription activity. These findings indicate that Coccinella septempunctata Linne and Harmonia axyridis Pallas extracts could be an useful insect resource for agrobiotechnological purposes.
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문제 정의
Cox-2 억제 제 또한 치료제로서 일부 기업에서 생산을 하고 있는 실정이다. 본 연구는 약용곤충을 이용하여 Cfox-2의 활성 억제제 를 스크리닝 하기 위하여 유전자의 promoter 부분을 이용하여 Cox-2의 transcripticsi을 억제 할 수 있는지를 알아보았다. 실험 결과 칠성무당벌레와 무당벌레의 DW추출물과 DMSO추출물에서 약 25% 정도의 억제효과를 알 수 있었다 (Fig.
DPPH를 이용한 활성 실험 결과, 무당벌레의 DW추출물 에서 상대적으로 다른 용매 추출물에 비하여 높은 활성이 나타났으며, 칠성무당벌레와 무당벌레의 다른 군에서는 20% 이하로 낮은 활성을 나타내었다. 시간에 따른 활성의 정도를 FRAP assay로 확인해 보았다. 실험 결과 DPPH 활성과 마찬가지로 무당벌레의 DW추출물에서 높은 활성을 보였다.
거미줄의 이용과 이들이 만들어내는 강력한 소화제의 연구는 그 대표적인 예로 들 수 있다(18). 이러한 이용 가능한 곤충자원의 활용이라는 측면에서 딱정 벌레과의 하나인 무당벌레류를 이용하여 이들의 생물학적 활성을 항산화 및 염증과 관련하여 알아보고자 하였다.
그러나 번식 면에서 무당벌레는 사육하기가 쉬워 약용 및 식용으로 가치가 있을 때 산업적으로 활용하기가 매우 유효하다. 이에 본 연구는 생물학적으로 유용한 자원으로 무당벌레 추출물의 생물학적 활성 중 특히 항산화활성과 분자염증에 대표적인 분자표적인 Cyclooxygenase- 25] 활성을 promoter assay system의 일종인 stable cell line에 의한 비교실험을 수행하였다.
제안 방법
Cox-2의 활성을 알아보기 위하여 유전자의 promoter 부분을 활용하였다. Promoter 부분을 luciferase activity를 확인할 수 있는 pGL3 (Prcanega) vector의 EcoRl과 Xho 1 site에 cloning 한 후 glioma cell(U-118MG, ATCC, Manassas, VA) 에 lifopectamine으로 tranfection한 뒤], G418으로 serial dilution 하여 single cell만 나타나도록 single colony를 선별 하였고, stable cell line으로 안정화시켰다.
Linoleic acid의 산화 억제실험은 과산화지질을 기질로 하여 이를 억제하는 방법을 이용하였다. 과산화지질 (Linoleic acid)에 의해 Fe"가 I11로 산화가 되고 이때 F*의 반응물인 ammonium thiocyaimte 을 넣어 이를 ELISA reader 에서 정량하였다.
Cox-2의 활성을 알아보기 위하여 유전자의 promoter 부분을 활용하였다. Promoter 부분을 luciferase activity를 확인할 수 있는 pGL3 (Prcanega) vector의 EcoRl과 Xho 1 site에 cloning 한 후 glioma cell(U-118MG, ATCC, Manassas, VA) 에 lifopectamine으로 tranfection한 뒤], G418으로 serial dilution 하여 single cell만 나타나도록 single colony를 선별 하였고, stable cell line으로 안정화시켰다. 이후 무당벌레와 칠성무당벌레의 추출물(1mL)을 넣은 다음 24시간 37℃ 5 % CO2 incubator 에서 배양을 하여, luciferase assay 에 의하여 Victor3 (PerkiImer)를 사용하여 활성을 확인 하였다 (15) .
Diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) agsay는 radical 소거 활성 능측정방법으로 매우 간단하면서도 강력한 측정 방법으로 많이 이용되어진다. 각 추출물의 시료에 0.2 mM DPPH picaylhydrazyD를 1/20의 비율로 해서 실온서 30분간 incubation한 후 517 nm (Victor3, PerkinElmer, Turku, Finland) 에서 흡광도를 측정하였다. DPPH radical 소거활성 비율 (% inhibition)은 아래와 같이 계산하였다 (12).
대표적인 항산화제로는 vitamin C와 E7} 알려져 있으며, 식/음료로의 첨가제로 많이 사용되어 지고 있다(192Q21). 본 실험은 곤충자원의 이용을 극대 화하기 위하여 먼저 칠성무당벌레와 무당벌레의 추출물을 이용하여 항산화 실험을 실시하였다. DPPH, FRAP, linoleic acid 활성/억제 실험은 매우 간단하면서도 항산화와 관련되어 널리 알려진 실험이다.
산화스트레스에 의한 대표적인 질병의 하나인 천식 (asthma)에 있어서 염증은 매우 중요한 문제인데 최근 천식의 발병 원인중의 상당수는 대기오염에 의한 산화물(SOx, NOx)에 의해 발생한다고 한다 본 연구는 칠성무당벌레와 무당벌레의 추출물을 이용하여 항산화 실험과 연관 지어 염증관련 분자 표적 유전자인 Cox-2의 promoter 영역의 활성억제를 비교하여 보았다. 면역질환의 경우 가장 널리 알려진 표적유전자 중의 하나인 Cox-2는 관절염 (arthritis) 치료제의 중요한 타깃으로 알려져 있으며, 최근 위암과 관련된 많은 연구결과가 보고되고 있다(25, 26, 27).
Promoter 부분을 luciferase activity를 확인할 수 있는 pGL3 (Prcanega) vector의 EcoRl과 Xho 1 site에 cloning 한 후 glioma cell(U-118MG, ATCC, Manassas, VA) 에 lifopectamine으로 tranfection한 뒤], G418으로 serial dilution 하여 single cell만 나타나도록 single colony를 선별 하였고, stable cell line으로 안정화시켰다. 이후 무당벌레와 칠성무당벌레의 추출물(1mL)을 넣은 다음 24시간 37℃ 5 % CO2 incubator 에서 배양을 하여, luciferase assay 에 의하여 Victor3 (PerkiImer)를 사용하여 활성을 확인 하였다 (15) . Luciferase assay는 Promega 사의 Luciferase Assay System (E1500, Promega)을 사용하였다(15).
칠성무당벌레 (Coccine septempunctata Linn6)는 2004 년 9월 14일 충남 영동군 양산면 일대에서, 무당벌레 (Harmonia axyridis Pallas)는 전북 무주군 설천면 일대에서 채집을 하였다. 채집에 관련된 전문 장비 및 분류는 대전대학교 곤충생리학교실의 주도로 수행 하였으며, 채집된 개체는 실험실로 운반 후 1달간 자연 건조시켰다. 그 후, 4가지 용매 즉 증류수(distilled water; DW), dimethyl sulfoxide (DMSO), ethyl alcohol, methyl alcohol을 이용하여 24시간동안 추출과정을 거 쳤으며, DW 추출물은 섭씨 60。(:에서 열수 추출을 하였다.
대상 데이터
칠성무당벌레 (Coccine septempunctata Linn6)는 2004 년 9월 14일 충남 영동군 양산면 일대에서, 무당벌레 (Harmonia axyridis Pallas)는 전북 무주군 설천면 일대에서 채집을 하였다. 채집에 관련된 전문 장비 및 분류는 대전대학교 곤충생리학교실의 주도로 수행 하였으며, 채집된 개체는 실험실로 운반 후 1달간 자연 건조시켰다.
이론/모형
이후 무당벌레와 칠성무당벌레의 추출물(1mL)을 넣은 다음 24시간 37℃ 5 % CO2 incubator 에서 배양을 하여, luciferase assay 에 의하여 Victor3 (PerkiImer)를 사용하여 활성을 확인 하였다 (15) . Luciferase assay는 Promega 사의 Luciferase Assay System (E1500, Promega)을 사용하였다(15).
성능/효과
DPPH를 이용한 활성 실험 결과, 무당벌레의 DW추출물 에서 상대적으로 다른 용매 추출물에 비하여 높은 활성이 나타났으며, 칠성무당벌레와 무당벌레의 다른 군에서는 20% 이하로 낮은 활성을 나타내었다. 시간에 따른 활성의 정도를 FRAP assay로 확인해 보았다.
In vitro antioxidant assay 실험 결과 무당벌레의 DW추출 물이, Cox-2의 경우에 있어서는 DW추출물과 DMSO추출 물에서 상대적으로 활성이 높게 나타났다. 특히 항산화 활성증 FRAP assay 실험에서는 시간에 따른 지속적인 활성의 증가를 보여준 무당벌레의 DW추출물의 경우는 분리정제 에 상당한 어려움이 예상되지만, 이 부분은 앞으로 산업화 과정에서 매우 중요한 요인이 될 것으로 판단된다.
따라서 항산화물질이 분리/정제되면 상당한 수준의 항산화능을 나타낼 수 잇을 것으로 판단된다. Linoleic add 산화 억제에 대한 활성의 경우, 시간에 따른 활성은 칠성무당벌레와 무당벌레의 DW 추출물을 제외하고 26시간을 기점으로 하여 42시간이 경과하여 산화가 줄어드는 것을 알 수 있었다. 칠성 무당벌레 추출물의 경우 시간에 따른 산화 속도의 차이는 있으나 methanol 추출물에서 가장 높은 활성을 나타내었다.
실험 결과 DPPH 활성과 마찬가지로 무당벌레의 DW추출물에서 높은 활성을 보였다. 무당벌레의 DW 추출물 이외의 추출물에서는 시간에 따른 활성정도가 positive control로 사용한 butylated hydroxytoluene (BUT)보다 상대적으로 낮았으나 specific activity는 BHT 보다 높게 나타나는 것을 알 수 있었다. 다른 군에서는 시간에 따른 활성 정도가 조금씩 증가하는 것을 알 수 있었지만 그 활성 정도는 미미한 수준을 나타내었다(Fig.
시간에 따른 활성의 정도를 FRAP assay로 확인해 보았다. 실험 결과 DPPH 활성과 마찬가지로 무당벌레의 DW추출물에서 높은 활성을 보였다. 무당벌레의 DW 추출물 이외의 추출물에서는 시간에 따른 활성정도가 positive control로 사용한 butylated hydroxytoluene (BUT)보다 상대적으로 낮았으나 specific activity는 BHT 보다 높게 나타나는 것을 알 수 있었다.
실험 결과 추출물의 용매에 따른 활성의 정도가 기복이 매우 심하게 나오는 것을 알 수 있었다. 이는 추출 용매의 물리/화학적인 성질에 기인한다고 판단이 되어 진다.
본 연구는 약용곤충을 이용하여 Cfox-2의 활성 억제제 를 스크리닝 하기 위하여 유전자의 promoter 부분을 이용하여 Cox-2의 transcripticsi을 억제 할 수 있는지를 알아보았다. 실험 결과 칠성무당벌레와 무당벌레의 DW추출물과 DMSO추출물에서 약 25% 정도의 억제효과를 알 수 있었다 (Fig. 3).
무당벌레 추출물 의 경우도 iwthanol 추출물에서 가장 좋은 활성을 나타내었다. 특히 DMSO 추출물의 경우 26시간 경과 후 산화물의 양이 매우 증가하는 것으로 나타나지 만 42시간 경과후 상대적으로 큰 폭의 감소를 보이는 것으로 나타났다. 실험 군별 활성 정도가 가장 높게 나타난 군은 칠성무당벌레와 무당벌레의 methanol 추출물이었다(Fig.
후속연구
흔히 약용으로 사용되는 곤충류는 보존이나 보관시 이들 약용성분의 변화가 예상된다. 따라서 서식지의 차이, 개체 차이, 계절적인 차이 등도 활성에 많은 차이를 나타내며 이러한 기초적인 결과도 생물활성과 유용성분의 분리정제 에 많은 영향을 미치게 되리라 추측된다.
이런 경우 최초 유기성 용매를 이용한 다음 이를 제거한 후 다시 물을 이용하여 녹이거나 농축 하여 사용을 하게 된다. 본 실험에서의 활성은 DW를 이용한 추출물에서 가장 좋은 활성을 볼 수 있었는데 이는 추후 이들 추출물의 산업적 이용시 이점으로 작용하는 한편 유용한 물질 분리에는 그만큼 어려움이 있을 것으로 사료된다. 흔히 약용으로 사용되는 곤충류는 보존이나 보관시 이들 약용성분의 변화가 예상된다.
참고문헌 (27)
Cudjoe, E., Wiederkehr, T.B. and Brindle, I.D. (2005) Headspace gas chromatography-mass spectrometry: a fast approach to the identification and determination of 2-alkyl-3- methoxypyrazine pheromones in ladybugs. Analyst., 130, 152-155
Sivagnaname, N., and Kalyanasundaram, M. (2004) Laboratory evaluation of methanolic extract of Atlantia monophylla (Family: Rutaceae) against immature stages of mosquitoes and non-target organisms. Mem. Inst. Oswaldo. Cruz., 99, 115-118
Wang, C. and St, Leger, RJ. (2005) Developmental and transcriptional responses to host and nonhost cuticles by the specific locust pathogen Metarhizium anisopliae var. acridum. Eukaryot. Cell., 4, 937-947
Li, N.G., Osakovskii, V.L. and Ivanova, S.S. (2003) Chemical composition and cryoprotective activity of ethanol extract from winter caterpillars Aporia crataegi L. Izv. Akad. Nauk. Ser. BioI., 5, 547-552
Kurioka, A. and Yamazaki, M. (2002) Purification and identification of flavonoids from the yellow green cocoon shell (Sasamayu) of the silkworm, Bombyx mori. Biosci. Biotechnol. Biochem., 66, 1396-1399
Nakatani, T., Konishi, T., Miyahara, K. and Noda, N. (2004) Three novel cantharidin-related compounds from the Chinese blister beetle, Mylabris phalerata Pall. Chem. Pharm. Bull., 52, 807-9
Kou, J., Ni, Y., Li, N., Wang, J., Liu, L. and Jiang, ZH. (2005) Analgesic and anti-inflammatory activities of total extract and individual fractions of Chinese medicinal ants Polyrhachis lamellidens. BioI. Pharm. Bull., 28, 176-180
Ma, Y., Wang, X., Zhao, Y., Kawabata, T. and Okada, S. (1997) Inhibitory effects of Chinese ant extract (CAE) on nephrotoxicity induced by ferric-nitrilotriacetate (Fe-NTA) in Wistar rats. Res. Commun. Mol. Pathol. Pharmacol., 96, 169-178
Haubruge, E., Vanlerberghe-Masutti, F., Collignon, P. and Francis, F., (2002) The use of random amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis for studies of genetic variation in populations of Coccinella septempunctata in Belgium. Meded. Rijksuniv. Gent. Fak. Landbouwkd. Toegep. BioI. Wet., 67, 557-561
Raudonis, L., Surviliene, E. and Valiuskaite, A. (2004) Toxicity of pesticides to predatory mites and insects in apple-tree site under field conditions. Environ. Toxicol., 19, 291-295
Schlesier, K., Harwat, M, Bohm, V. and Bitsch, R (2002) Assessment of antioxidant activity by using different in vitro methods. Free. Radic. Res., 36, 177-187
Pulido, R., Bravo, L. and Saura-Calixto, F. (2000) Antioxidant activity of dietary polyphenols as determined by a modified ferric reducing/antioxidant power assay. J. Agric. Food. Chem., 48, 3396-3402
Spinella, F., Rosano, L., Di, Castro V., Nicotra, M.R., Natali, P.G. and Bagnato, A. (2004) Inhibition of cyclooxygenase-1 and -2 expression by targeting the endothelin a receptor in human ovarian carcinoma cells. Clin. Cancer. Res. 10, 4670-4679
Botha, B.M. and McCrindle, C.M. (2000) An appropriate method for extracting the insect repellent citronellol from an indigenous plant (Pelargonium graveolens L'Her) for potential use by resource-limited animal owners. J. S. Afr. Vet. Assoc., 71, 103-105
Craig, C.L. (2004) Broad patterns of speciation are correlated with the evolution of new silk proteins in spiders but not in the lepidoptera. Biomacromolecules., 5, 739-743
Jaxa-Chamiec, T., Bednarz, B., Drozdowska, D., Gessek, J., Gniot, J., Janik, K., Kawka-Urbanek, T., Maciejewski, P., Ogorek, M., Szpajer, M., and MIVIT Trial Group. (2005) Antioxidant effects of combined vitamins C and E in acute myocardial infarction. The randomized, double-blind, placebo controlled, multicenter pilot Myocardial Infarction and VITamins (MIVIT) trial. Kardiol. Pol., 62, 344-350
Misso, N.L., Brooks-Wildhaber, J., Ray, S., Vally, H. and Thompson, P.J. (2005) Plasma concentrations of dietary and nondietary antioxidants are low in severe asthma. Eur. Respir. J., 26, 257-264
EI-Demerdash, F.M., Yousef, M.I. and Zoheir, M.A. (2005) Stannous chloride induces alterations in enzyme activities, lipid peroxidation and histopathology in male rabbit: Antioxidant role of vitamin C. Food, Chem, Toxicol., 43, 1743-1752
Bae, Y.S., Kang, S.W., Seo, M.S., Baines, I.C., Tekle, E., Chock, P.B. and Rhee, S.G. (1997) Epidermal growth factor (EGF)-induced generation of hydrogen peroxide. Role in EGF receptor-mediated tyrosine phosphorylation. J. BioI. Chem., 272, 217-221
Han, H J., Lee, Y J., Park, J Y., Kim, E J., Lee, J H. and Taub, M L. (2005) Effect of EGF on H20:z-induced inhibition of alpha-MG uptake in renal proximal tubule cells: involvement of MAPK and AA release. J. Cell. Physiol., 20, 217-225
MacNee, W. (2001) Oxidative stress and lung inflannnation in airways disease. Eur. J. Pharmacol., 429, 195-207
Shafiq, N., Malhotra, S., Pandhi, P. and Nada, R. (2005) Comparative gastrointestinal toxicity of selective cyclooxygenase (COX-2) inhibitors. Indian. J. Exp. BioI., 43, 614-619
Biswas, P.S., Banerjee, K., Kim, B., Kinchington, P.R. and Rouse, B.T. (2005) Role of inflammatory cytokineinduced cycloxygenase 2 in the ocular immunopathologic disease herpetic stromal keratitis. J. Virol., 79, 10589-10600
Luth, P., Herold, M. and Mur, E. (2005) The medical reason for the prescription of COX-2 selective cyclo oxygenase inhibitor rofecoxib for the treatment of rheumatoid arthritis. Wien. Med. Wochenschr., 155, 211-216
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