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문제 정의
- 진행되지 못하고 있다. 본 연구는 전국에서 수집한 누룩 300여 점에서 분리한 효모 1,500여 균주를 대상으로 주류의 품질특성에 가장 중요한 효모의 알코올 발효능력, 향기생성 능력, 알코올 내성, 고온발효성, 침강성, 유기산 생성능력 등 실용적인 측면에서 주요한 특성들을 구명하여 현장에서 바로 응용할 수 있도록 DB화하는 과정에서 선발된 우수 효모 10균주의 입국(初0에서의 발효특성을 보고하여 우리나라 전통 누룩으로부터 분리한 wild type 효모를 사용하여 발효제로 입국(物7)을 사용하고 3단 사입하여 고 알코올 발효주이며 맑은 술로 불리우는 청주(淸酒)의 제조 가능성을 검토하고자 한다.
가설 설정
- yeast d : No detection.
제안 방법
- 동정하였다. 전국에서 수집한 300여 점의 누룩으로부터 알코올 발효성이 뛰어난 야생효모 10 균주를 선별하였으며 알코올 내성 , 내당성 및 침강성을 조사한 후 발효물을 제조하여 알코올 함량, 당도, pH, 유기산 및 휘발성 향기 성분을 조사하였고 선별된 10 균주를 Biolog를 이용하여 신속 간이 동정하였다. 알코올 내성은 ethanol 함량 18%까지는 모두 활성을 보였으나 20%이상에서는 효모 54-3, 90-2 그리고 91-5만이 활성을 나타냈으며 내당성은 모두 우수하였고 침강성은 효모 90-2가 83.
- 알코올 함량은 GC(Hewlett Packard 5890A, USA)를 사용하였고 column DB-ALC2(30m length x 0.53 mm I.d x 2 gm film thickness : J & W Scientific, USA), isothermal 50℃, Inlet 120℃, Detector FID 250℃ 그리고 carrier gas 로 helium을 사용하였으며 표준물질의 농도와 peak area의 log값으로부터 표준곡선을 작성하여 각각의 알코올 함량을 산출하였다. pH는 pH meter(Orion Model EA 940, USA) 를 사용하여 측정하였고。由仗는 Refractometer(ATAGO Pocket PAL-1, Japan)를 이용하여 측정하였으며 흡광도는 UV/V1S spectrophotometer (Diod-AiTay) HP 8453(Hewlett Packard, USA)U로 660 nm에서 absorbance를 측정하였다.
- d x 2 gm film thickness : J & W Scientific, USA), isothermal 50℃, Inlet 120℃, Detector FID 250℃ 그리고 carrier gas 로 helium을 사용하였으며 표준물질의 농도와 peak area의 log값으로부터 표준곡선을 작성하여 각각의 알코올 함량을 산출하였다. pH는 pH meter(Orion Model EA 940, USA) 를 사용하여 측정하였고。由仗는 Refractometer(ATAGO Pocket PAL-1, Japan)를 이용하여 측정하였으며 흡광도는 UV/V1S spectrophotometer (Diod-AiTay) HP 8453(Hewlett Packard, USA)U로 660 nm에서 absorbance를 측정하였다. 유기산은 시료를 0.
- pH는 pH meter(Orion Model EA 940, USA) 를 사용하여 측정하였고。由仗는 Refractometer(ATAGO Pocket PAL-1, Japan)를 이용하여 측정하였으며 흡광도는 UV/V1S spectrophotometer (Diod-AiTay) HP 8453(Hewlett Packard, USA)U로 660 nm에서 absorbance를 측정하였다. 유기산은 시료를 0.45 μm syringe filter(XPERTEK, USA)로 여 과한 후 HPLC(Jasco UV-975 UV/VIS detector, Tokyo, Japan)로 분석하였다. 분석조건은 Aminex HPX-87H(300 mm x 7.
- Koji 당화액 10 mL에 효모를 접종한 후 발효온도 5, 15, 25, 35℃로 4분화하여 각각의 온도에서 durham tube에 생기는 CO2 gas 생성 속도를 관찰하여 알코올 발효성을 측정하였다. 알코올 내성은 YPD(glucose 2%, yeast extract 0.
- 알코올 내성은 YPD(glucose 2%, yeast extract 0.5%, bactopeptone 1%: Sigma, USA) 액체 배지에 효모 접종 직후 무수에탄올을 14, 16, 18, 20, 22%(v/v)가 되도록 각각 첨가하여 20也에서 72시간 배양한 후 660 nm에서의 흡광도를 측정하여 비교하였고 내당성은 20, 23, 26, 29% glucose가 함유된 각각의 YPD 액체배지를 이용하여 20。0에서 48시간 배양한 후 660 nm에서의 흡광도를 측정하여 비교하였다 [7].
- 침 강성 은 PDB(Potato dextrose broth, Difco, Detroit Michigan, USA) 액체배지를 이용하여 25也에서 48시간 진탕 배양한 후 원심 분리하여 각각을 A와 BS- 나누어 처리를 달리하였다. A는 pellepfl 증류수와 0.
- B는 pelle에 CaSO4 solution을 첨가하여 현탁한 후, 다시 원심분리를 하여 pellet에 CaSO4 buffer solution을 첨가하여 현탁하여 6분 동안 정치하였다. 각각을 10배로 희석하여 600 nm에서의 흡광도를 측정하여 비교하였다[1]. Flocculence, %= (A-B) x 100/A
- 미생물 동정은 BIOLOG社(USA)의 서로 다른 종류의 95개 carbon sources로 코팅된 96-well MicroPlate를 이용하여 MicroLogTM System, Release 4.2 database로 동정하였다. 배지 BUY(Biolog Uni versial Yeast Agar, USA) 에서 24시간 동안 배 양한 효모 균체 를 Inoculating Fluid인 sterile waters] 47%T의 농도로 희석하여 YT MicroPlate에 100 贝 per well로 접종한 후 2UC에서 48, 72시간 배양하여 동정하였다.
- 2 database로 동정하였다. 배지 BUY(Biolog Uni versial Yeast Agar, USA) 에서 24시간 동안 배 양한 효모 균체 를 Inoculating Fluid인 sterile waters] 47%T의 농도로 희석하여 YT MicroPlate에 100 贝 per well로 접종한 후 2UC에서 48, 72시간 배양하여 동정하였다.
- 휘발성 화합물 분석은 Hewlett Packard 6890N GC/ Hewlett Packard 5973N mass selective detector (MSD)(Hewlett Packard Co., Palo Alto, CA, USA)를 사용하였다. Columne DB-Wax(60 m length x 0.
- 25 μm film thickness : J & W Scientific, Folsom, CA, USA)를 사용하였고 Oven 온도는 4(%에서 5분간 유지한 후 200吃까지 3℃/mine 속도로 승온시켰으며 Injector 200℃, carrier gas는 helium을 사용하였고 flow rate는 2 mL/min 조건이었다. MSD 조건은 capillary direct interface temperature 250℃, ion source temperature 230℃, ionization voltage 70 eV, mass range 33-350 a.m.u, 그리고 scan rate 2.2 scan/sec였고 휘발성 화합물 동정은 retention indices(RI), mass spectra와 aroma properties를 비교하여 확인하였다.
- Koji 당화액 10 mL에 효모를 접종한 후 발효온도 5, 15, 25, 35℃ 각각에서 durham tubE] 생기는 CO2 gas 생성 속도를 관찰하여 알코올 발효성을 측정한 결과는 Fig. 1에 나타내었다. 35℃에서 효모 91-5, 271-4 그리고 272-7에서는 gas가 생성되지 않아 발효성을 확인할 수 없었으나 나머지 균주는 모두 2일만에 durham관에 gas가 가득 차 올랐고 25℃에서는 효모 18-2, 90-2, 98-2 그리고 99-5가 35℃와 동일하게 2일 만에 gas가 가득 찼으며 나머지는 모두 3, 4일이 경과하여 가득 차 올랐다.
- 누룩으로부터 분리한。拠효모 io 균주의 청주제조 가능성을 위해 발효에 관여하는 몇 가지 특성을 조사한 후 신속 간이 동정하였다. 전국에서 수집한 300여 점의 누룩으로부터 알코올 발효성이 뛰어난 야생효모 10 균주를 선별하였으며 알코올 내성 , 내당성 및 침강성을 조사한 후 발효물을 제조하여 알코올 함량, 당도, pH, 유기산 및 휘발성 향기 성분을 조사하였고 선별된 10 균주를 Biolog를 이용하여 신속 간이 동정하였다.
- lactic acid를 첨가하여 pH를 3.7로 맞춘 후 20。(3에서 7 일간 발효하여 제조하였으며 누룩으로부터 분리한 효모 균체 접종량은 PDA배지 (Potato dextrose agar, Difco, Detroit Michigan, USA), 29℃, 24시간으로 2차 계대 배양한 후 멸균한 0.85% NaCl에 현탁하였고 Turbidimeter(BIOLOG USA)를 이용하여 590 nm에서의 absorbance를 측정하여 2 X 107/mL 농도로 조절하여 접종하였다.
- 선별 효모의 알코올 생성능력을 비교하기 위하여 초기 koji 당화액 배지의 당도를 16 OBrix로 하여 발효 후 최대 알코올 함량이 8%(v/v) 정도가 될 것을 예상하였다. 일주일 발효 후 얻어진 발효액에서 측정한 알코올 함량은 효모 91-2 가 7.
대상 데이터
- 실험에 사용된 효모는 본 연구원에서 누룩으로부터 분리하여 보존하고 있는 균주를 사용하였으며 대조군은 일본양조협 회 1 QS-(Saccharomyces cerev曲ae)효모를 사용하였다 (Table 1). Koj食己 (주)두산으로부터 냉동된 상태로 공급받아 사용하였다.
- 1). Koj食己 (주)두산으로부터 냉동된 상태로 공급받아 사용하였다.
성능/효과
- 전국에서 수집한 300여 점의 누룩으로부터 알코올 발효성이 뛰어난 야생효모 10 균주를 선별하였으며 알코올 내성 , 내당성 및 침강성을 조사한 후 발효물을 제조하여 알코올 함량, 당도, pH, 유기산 및 휘발성 향기 성분을 조사하였고 선별된 10 균주를 Biolog를 이용하여 신속 간이 동정하였다. 알코올 내성은 ethanol 함량 18%까지는 모두 활성을 보였으나 20%이상에서는 효모 54-3, 90-2 그리고 91-5만이 활성을 나타냈으며 내당성은 모두 우수하였고 침강성은 효모 90-2가 83.03%로 매우 좋게 나타났다. 야생효모를 이용하여 발효물을 제조한 후의 알코올 함량은 대조군 7.
- 03%로 매우 좋게 나타났다. 야생효모를 이용하여 발효물을 제조한 후의 알코올 함량은 대조군 7.42%보다 높게 나타난 것이 3 균주였으며 유기산은 효모 272-7이 대조군과 거의 같은 함량을 보였고 acetic acid 함량이 적은 균주는 total acid 함량 또한 적게 나타났다. 발효물에서의 휘발성 향기성분은 alcohol류가 4종, ester류가 11종 그리고 acid 류가 1종 확인되었다.
- 42%보다 높게 나타난 것이 3 균주였으며 유기산은 효모 272-7이 대조군과 거의 같은 함량을 보였고 acetic acid 함량이 적은 균주는 total acid 함량 또한 적게 나타났다. 발효물에서의 휘발성 향기성분은 alcohol류가 4종, ester류가 11종 그리고 acid 류가 1종 확인되었다. Higher alcohol과 휘발성분의 대부분을 차지한 ester류는 대조군이 월등히 높았고 효모 54-3과 91-2에서 대조군 면적비율의 중간 이상으로 나타났다.
- 측정한 결과는 Table 2에 나타내었다. 알코올 내성은 ethanol 16%에서 효모 98-2의 활성이 대조군보다 더 좋게 나타났고 선별된 10개의 효모 모두 활성을 보였으며 ethanol 18%에서는 효모 192-2와 271-4는 활성을 보이지 않았고 나머지 효모는 모두 활성을 보였으나 16%보다 감소하게 나타났으며 효모 272-7이 가장 높았고 ethanol 20% 이상에서는 효모 54-3, 90-2 그리고 91-5만이 활성을 보였고 특히 효모 91-5는 대조군의 3배 이상의 활성을 나타냈으며 Kim[7] 등이 보고한 에탄올 20%에서의 내성과 활성이 비슷하게 나타났다. 내당성은 효모 18-2만이 특이적으로 낮은 활성을 보였으며 효모 54-3과 192-2는 glucose 함량이 증가함에 따라 감소하게 나타났고 나머지는 모두 비슷한 활성을 보였으며 Kim[7] 등이 보고한 glucose 20%에서의 내당성과 활성이 비슷하게 나타났다.
- 내당성은 효모 18-2만이 특이적으로 낮은 활성을 보였으며 효모 54-3과 192-2는 glucose 함량이 증가함에 따라 감소하게 나타났고 나머지는 모두 비슷한 활성을 보였으며 Kim[7] 등이 보고한 glucose 20%에서의 내당성과 활성이 비슷하게 나타났다. 침강성은 효모 90-2가 83.3%로 very flocculent yeast(>80%)로 나타났고 효모 54-3, 98-2 그리고 271-4가 nonflocculent yeast(<20%) 범주에 속했으며 나머지는 모두 moderately yeast(20~60%)로 나타났다. 발효물의 향은 효모 18-2와 91-5가 과일 향이 나면서 신선한 느낌으로 대조군과 유사하였으며 과일 향 대신 단 향이 나면서 신선한 느낌을 주는 효모는 54-3과 192-2였고 나머지 6개 효모를 이용한 발효물에서는 각각 단 향, 신선한 느낌, 부드러운 느낌과 함께 공통적으로 신 향이 느껴졌다.
- 3%로 very flocculent yeast(>80%)로 나타났고 효모 54-3, 98-2 그리고 271-4가 nonflocculent yeast(<20%) 범주에 속했으며 나머지는 모두 moderately yeast(20~60%)로 나타났다. 발효물의 향은 효모 18-2와 91-5가 과일 향이 나면서 신선한 느낌으로 대조군과 유사하였으며 과일 향 대신 단 향이 나면서 신선한 느낌을 주는 효모는 54-3과 192-2였고 나머지 6개 효모를 이용한 발효물에서는 각각 단 향, 신선한 느낌, 부드러운 느낌과 함께 공통적으로 신 향이 느껴졌다.
- 함량이 8%(v/v) 정도가 될 것을 예상하였다. 일주일 발효 후 얻어진 발효액에서 측정한 알코올 함량은 효모 91-2 가 7.7%S_ 가장 높았고 효모 98-2와 18-2가 7.46% 이상으로 대조군의 알코올 함량 7.42%보다 높게 나타나 우수한 알코올 생성능력을 보였으며 다음으로 효모 90-2와 99-5가 7.12% 이상으로 높게 나타났고 나머지 효모 5 균주 모두 6.0% 이상의 알코올 함량으로 우수한 알코올 생성능을 보였다. 발효물의 pH와 당도를 측정한 결과 pH 4.
- 0% 이상의 알코올 함량으로 우수한 알코올 생성능을 보였다. 발효물의 pH와 당도를 측정한 결과 pH 4.21-4.41, 당도 9.2시 0.7 OBrix로 근사하게 나타났으며 특이하게 효모 91-5만이 pH는 3.97로 낮게, 당도는 18.5 °Brix로 높게 나타났다.
- 발효물의 유기산으로는 citric, malic, succinic, lactic, acetic acid가 검출되었고(Table 3), 효모간의 차이는 있었지만 그 중 malic과 succinic acid의 함량이 가장 높은 경향을 나타내었다. 전체 유기산 중 가장 많은 함량을 보인 succinic acid는 효모 272-7이 11.
- 전체 유기산 중 가장 많은 함량을 보인 succinic acid는 효모 272-7이 11.88 mg/mL로 대조군보다 0.64 mg/ mL 높게 검출되어 가장 많게 나타났고 10 mg/mL 이상인 효모는 98-2와 99-5였으며 다음으로 많은 함량을 보인 malic acid는 효모 192-2가 9.48 mg/mL로 대조군보다 0.95 mg/ mL 높게 검출되었다. Lactic acid는 0.
- 85 mg/mL 수준으로 대조군과 비슷한 함량을 보였다. Acetic acid는 효모 271-4가 2.56 mg/mL로 가장 높게 검줄되었고 효모 91-5와 54-3이 0.47과 0.72 mg/mL로 가장 낮게 나타났으며 전체 유기산 함량은 효모 272-7이 21.16 rr电/ ml로 가장 많았으나 대조군 보다는 0.62 mg/mL 적게 나타났고 acetic acid 함량이 가장 적었던 효모 91-5와 54-3이 1.68과 8.31 m&/mL로 가장 적게 나타났다.
- 발효물의 휘발성 향기 성분을 Solid Phase Microextraction (SPME)을 이용하여 추출하고 gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS)로 확인한 결과 33개의 휘발 성분이 확인되었다(Table 4). 그 중 16개의 휘발 성분이 동정 되었는데 작용기별로 보면 alcohol류가 phenethyl alcohol을 포함하여 4종, estet류가 isobutyl acetate를 포함하여 11종 그리고 acid류가 1종이었다.
- 4). 그 중 16개의 휘발 성분이 동정 되었는데 작용기별로 보면 alcohol류가 phenethyl alcohol을 포함하여 4종, estet류가 isobutyl acetate를 포함하여 11종 그리고 acid류가 1종이었다. 휘발성 향기성분의 면적비율(peak area%)은 alcohol류 88.
- 그 중 16개의 휘발 성분이 동정 되었는데 작용기별로 보면 alcohol류가 phenethyl alcohol을 포함하여 4종, estet류가 isobutyl acetate를 포함하여 11종 그리고 acid류가 1종이었다. 휘발성 향기성분의 면적비율(peak area%)은 alcohol류 88.71 ~96.26%, ester류 1.85-9.43% 그리고 acid류 0~0.16%로 alcohol류의 면적비율이 월등히 높았고 다음이 ester류로 나타났다. Isobutyl alcohol과 isoamyl alcohole.
- 58%로 가장 적게 나타났다. Ester류는 대조군이 9.43%로 월등히 높았고 효모 54-과 91-2에서 5.4와 5.28%로 중간 이상을 보였으며 효모 91-5는 1.85%로 가장 적게 나타났고 estei류 중 가벼운 과일 향으로 top note에 성숙감과 둥근 모양을 나타내는 isoamyl acetate는 효모 54-3과 99-5에서만 검출되었고 청주의 향기성분으로 알려진 [8] 강하고 보급력이 있는 fruitywiney odor를 나타내는 ethyl caproate는 대조군에서 월등히 높았으며 효모 54-3과 91-2에서 0.26%이상으로 나타났다. Acetic acid는 ester 면적비율이 가장 적었던 효모 91-5에서 0.
- 26%이상으로 나타났다. Acetic acid는 ester 면적비율이 가장 적었던 효모 91-5에서 0.16%로 가장 높게 나타났고 효모 54-3에서 0.04%로 가장 적게 나타났으며 대조군에서는 검출되지 않았다.
- Higher alcohol과 휘발성분의 대부분을 차지한 ester류는 대조군이 월등히 높았고 효모 54-3과 91-2에서 대조군 면적비율의 중간 이상으로 나타났다. BI0L0G로 신속 간이 동정한 결과 효모 54-3 외 6 균주가 S. cerevisiae, 효모 192-24 271-4는 Z. cidri 그리고 효모 91-5는 / sydowiorum으로 동정되었다
- Isobutyl alcohol과 isoamyl alcohole. 대표되는 higher alcohole 효모 99-5에서 4.05% 로 가장 많은 면적비율로 나타났고 효모 272-7이 1.58%로 가장 적게 나타났다. Ester류는 대조군이 9.
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