참당귀(Angelica gigas Nakai)를 기능성 식품소재 및 의약품의 원료로 활용하기 위하여 참당귀 methanol 추출물에 대한 항산화, 항암 및 면역활성을 조사한 결과는 다음과 같다. 참당귀의 항산화력을 알아보기 위하여 0.1, 0.5 및 1 mg/mL의 농도로 당귀의 methanol 추출물을 처리한 후 수소 공여능, 환원력 및 hydroxyl radical 활성을 측정하였다. 그 활성은 모두 추출물의 농도에 의존적으로 높게 나타났으며, 특히 수소공여능은 1 mg/mL에서 대조군과 비교했을때 50% 정도의 활성을 나타내었다. 참당귀 methanol 추출물을 SW480세포에 처리한 결과 대조군에 비하여 농도 의존적으로 암세포의 성장을 억제하였으며, 암세포에 참당귀 methanol 추출물을 24시간 처리하여 hoechst 염색한 후 형광현미경으로 관찰한 결과 핵의 응축 및 DNA 분절이 관찰되었다. 또한 참당귀 methanol 추출물이 처리된 암세포에서는 대조군에 비하여 농도에 의존적으로 caspase-3의 활성이 증가하였다. 참당귀의 methanol 추출물은 생쥐의 비장으로부터 분리한 면역세포에 대하여 대조군과 비교하여 상이한 차이를 보이지 않았으며, 또한 대식세포인 RAW 264.7에서도 $NO_2$(Nitrite)를 함량이 증가되지 않았다. 따라서 이들 결과는 참당귀 methanol 추출물은 약한 항산화 활성을 가지며, 면역 활성에는 큰 관련이 없지만, SW480 암 세포에서 caspase dependent pathway에 의한 apoptosis를 유도함으로서 암세포의 사멸하는 것으로 판단되어진다.
참당귀(Angelica gigas Nakai)를 기능성 식품소재 및 의약품의 원료로 활용하기 위하여 참당귀 methanol 추출물에 대한 항산화, 항암 및 면역활성을 조사한 결과는 다음과 같다. 참당귀의 항산화력을 알아보기 위하여 0.1, 0.5 및 1 mg/mL의 농도로 당귀의 methanol 추출물을 처리한 후 수소 공여능, 환원력 및 hydroxyl radical 활성을 측정하였다. 그 활성은 모두 추출물의 농도에 의존적으로 높게 나타났으며, 특히 수소공여능은 1 mg/mL에서 대조군과 비교했을때 50% 정도의 활성을 나타내었다. 참당귀 methanol 추출물을 SW480세포에 처리한 결과 대조군에 비하여 농도 의존적으로 암세포의 성장을 억제하였으며, 암세포에 참당귀 methanol 추출물을 24시간 처리하여 hoechst 염색한 후 형광현미경으로 관찰한 결과 핵의 응축 및 DNA 분절이 관찰되었다. 또한 참당귀 methanol 추출물이 처리된 암세포에서는 대조군에 비하여 농도에 의존적으로 caspase-3의 활성이 증가하였다. 참당귀의 methanol 추출물은 생쥐의 비장으로부터 분리한 면역세포에 대하여 대조군과 비교하여 상이한 차이를 보이지 않았으며, 또한 대식세포인 RAW 264.7에서도 $NO_2$(Nitrite)를 함량이 증가되지 않았다. 따라서 이들 결과는 참당귀 methanol 추출물은 약한 항산화 활성을 가지며, 면역 활성에는 큰 관련이 없지만, SW480 암 세포에서 caspase dependent pathway에 의한 apoptosis를 유도함으로서 암세포의 사멸하는 것으로 판단되어진다.
The biological activities of methanol extracts of Angelica gigas Nakai, such as antioxidation, anticancer and immuno-activity, were investigated in relation to development of functional foods. Anti-oxidation activity in the methanol extracts were assessed by hydrogen donating activity, reducing powe...
The biological activities of methanol extracts of Angelica gigas Nakai, such as antioxidation, anticancer and immuno-activity, were investigated in relation to development of functional foods. Anti-oxidation activity in the methanol extracts were assessed by hydrogen donating activity, reducing power and hydroxyl radical scavenging activity. Activities were dose-dependent over concentrations of 0.1, 0.5 and 1 mg/mL, with thehydrogen donating activity being over 50% at 1 mg/mL concentration. The methanol extracts inhibited the proliferation of SW480 cells in a dose-dependent manner, and chromatin condensation and apoptotic bodies were observed by fluorescence microcopy in the cells treated with the extracts for 24 hr. Caspase-3 activity was also increased in a dose-dependent manner in cells treated with the extracts relative to control cells. The extracts did not induce the proliferation of mouse spleen cells or NO production in macrophage cells (RAW 264.7). These results show that the methanol extract had slight anti-oxidative activity and did not increase immuno-activity, but inhibited proliferation of SW480 through apoptosis via a caspase dependent pathway.
The biological activities of methanol extracts of Angelica gigas Nakai, such as antioxidation, anticancer and immuno-activity, were investigated in relation to development of functional foods. Anti-oxidation activity in the methanol extracts were assessed by hydrogen donating activity, reducing power and hydroxyl radical scavenging activity. Activities were dose-dependent over concentrations of 0.1, 0.5 and 1 mg/mL, with thehydrogen donating activity being over 50% at 1 mg/mL concentration. The methanol extracts inhibited the proliferation of SW480 cells in a dose-dependent manner, and chromatin condensation and apoptotic bodies were observed by fluorescence microcopy in the cells treated with the extracts for 24 hr. Caspase-3 activity was also increased in a dose-dependent manner in cells treated with the extracts relative to control cells. The extracts did not induce the proliferation of mouse spleen cells or NO production in macrophage cells (RAW 264.7). These results show that the methanol extract had slight anti-oxidative activity and did not increase immuno-activity, but inhibited proliferation of SW480 through apoptosis via a caspase dependent pathway.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 참당귀를 기능성 식품소재 및 의약품의 원료로 사용하기 위한 기초자료를 얻기 위하여 당귀 methanol 추출물에 대한 항산화와 항암 효과 및 면역 활성과 같은 기능성을 탐색하였다.
제안 방법
5% CO2 incubator 에서 계대 배양하여 실험에 사용하였다. Monolayer 로 자란암세포주를 0.25% trypsin-EDTA 용액으로 처리하여 single cell 로 만든 후 세포의 최종 농도가 1x105 cell/mL 되도록 24 well plate 에 분주하고 37C, 5.5% CO2 incubator에서 24시간 배양 후 plate 에 세포의 부착을 확인하고 참당귀의 methanol 추출물은 각각의 농도별로 RPMI 1640배지로희석한 시료를 첨가하여 24시간 반응시킨 후 microplate reader(Titertek Multiscan Plus, Finland) 로 540 nm 에서 O.D 값을 측정하였다.
Nitrite 의 농도는 sodium, nitrite 를 32 pM까지 2배씩 희석하여 얻은 표준곡선과 비교하여 계산하였다.
본 실험에서 사용된 생쥐 (BALB/c, C57BL6) 는 대한실험동물센터(충북 음성군)에서 구입한 생후 8~12 주된 암컷을 사용하였고, 실험 전까지 고형사료와 1차 증류수를 공급하면서 사육실에서 사육하였다. 먼저 생쥐 (BALB/c, C57BL6) 를 경추탈골로 희생시킨 뒤 70%알코올로 소독하여 올려놓고 오른쪽 옆구리 쪽을 절개하여 spleen 을 떼어 낸 후 미리 준비해 둔 RPMI 1640배지가 들어 있는 petri dish 에 spleen 을 담고 핀셋을 이용하여 single 세포로만들고 4C, 1200 rpm 에서 6분간 3번 원심 침전하는 방법으로 세척하고 마지막에 10% FBS 를 첨가 한 RPMI 1640배지로 희석하여 실험에 사용하였다.
5% CO2 incubator 에서 24시간 배양하였다. 부착된 세포에 참당귀의 methanol 추출물을 농도별로 처리하고 24시간동안 반응시킨 후 염색물질인 hoechst 용액(5 ug/mL) 으로 염색하고 형광현미경(BH2-BH2-RPL-T3, Olympus optical CO. Ltd., Japan) 을 이용하여 핵의 형태변화를 정상군과 비교하였다.
분리한 비장세포는 5x106 cell/mL으로 희석한 다음 96well plate에 넣고 여기에 ConA 및 LPS를 첨가 또는 무첨가 후 식용사포닌을 농도별로 희석한 것을 넣고 48시간 5%, CO2 incubator 에 배양한 후 각 조건에 따른 증식정도를측정하였다. 비장세포 증식측정은 cell titer 96ⓡ aqueous one solution cell proliferation assay 를 사용하여 각각 배양된배양액 100 pL 에 cell titer 15 pL씩 첨가하여 4~8시간 동안다시 5%, CO2 incubator 에 배양한 다음 490 nm 에서 O.
비장세포 증식측정은 cell titer 96ⓡ aqueous one solution cell proliferation assay 를 사용하여 각각 배양된배양액 100 pL 에 cell titer 15 pL씩 첨가하여 4~8시간 동안다시 5%, CO2 incubator 에 배양한 다음 490 nm 에서 O.D. 값을 측정하였다(23).
5 mL 의 trichloroacetic acid(10%, w/v) 을 첨가하여 섞은 후 3000rpm 으로 10분간 원심분리하였다. 상층액의 1 mL 을 취해 시험관에 담고 1 mL의 증류수와 0.2 mL 의 Fea3(0.1%, w/v) 을 첨가하여 흡광도 700 nm 에서 환원력을 측정하였다.
시료들의 환원력은 Yildirim 등의 방법(18)의 방법을 약간 변형하여 측정하였다. 즉 참당귀 methanol 추출물을 각 농도별로 1 mL 에 2.
암세포를 각 well당 1×105 개씩 넣고 24시간 경과 후 60, 80 및 100 ug/mL 농도로 첨가하여 24시간 동안 배양후 위상차 현미경 (Diaphot 300, Nikon, Japan) 을 이용하여대조군과 시료처리군의 형태학적 변화를 비교 관찰 하였다.
참당귀 methanol 추출물이 인체 암세포주의 사멸에 있어 apoptosis 와 관련하는 지를 확인하기 위해 bis-benzimide (Hoechst 33258) 염색 후 핵의 형태변화를 관찰하였다(21). SW480 세포를 0.
참당귀의 methanol 추출물이 SW480세포의 사멸에 있어서 apoptosis 를 유도하는지를 알아보기 위하여 SW480 세포에 농도별로 24시간 처리하여 hoechst 염색한 후 형광현미경으로 관찰한 결과는 Fig. 6과 같다. 대조군이 균일한 핵의 형태를 보이는데 반하여 시료를 처리한 암세포의 경우는농도가 증가할수록 핵이 응축되고, DNA 분절등과 같은 형태학적 관찰이 나타나 세포가 apoptosis 에 의해 사멸되는 것으로 판단된다.
참당귀의 항산화력을 알아보기 위하여 0.1, 0.5 및 1 mg/mL 의 농도로 당귀의 methanol 추출물을 처리한 후 수소공여능, 환원력 및 hydroxyl radical 활성을 측정하였다. 그활성은 모두 추출물의 농도에 의존적으로 높게 나타났으며, 특히 수소공여능은 1 mg/mL 에서 대조군과 비교했을때 50% 정도의 활성을 나타내었다.
대상 데이터
본 실험에 사용된 SRB(sulforhodamine B), TCA(trichloro acetic acid) 및 bis-benzimide(Hoechst 33258) 은 Sigma(USA) 사 제품을, Tris-HCl buffer는 Aldrich사 제품을 구입하여실험에 사용하였다.
이용하였다. 본 실험에서 사용된 생쥐 (BALB/c, C57BL6) 는 대한실험동물센터(충북 음성군)에서 구입한 생후 8~12 주된 암컷을 사용하였고, 실험 전까지 고형사료와 1차 증류수를 공급하면서 사육실에서 사육하였다. 먼저 생쥐 (BALB/c, C57BL6) 를 경추탈골로 희생시킨 뒤 70%알코올로 소독하여 올려놓고 오른쪽 옆구리 쪽을 절개하여 spleen 을 떼어 낸 후 미리 준비해 둔 RPMI 1640배지가 들어 있는 petri dish 에 spleen 을 담고 핀셋을 이용하여 single 세포로만들고 4C, 1200 rpm 에서 6분간 3번 원심 침전하는 방법으로 세척하고 마지막에 10% FBS 를 첨가 한 RPMI 1640배지로 희석하여 실험에 사용하였다.
하였다(20). 즉, 세포배양은 RPMI 1640 배지로만든 배양액에 각각 10% FBS(fetal bovine serum) 가 첨가된것으로 사용하였으며, 세포는 37C, 5.5% CO2 incubator 에서 계대 배양하여 실험에 사용하였다. Monolayer 로 자란암세포주를 0.
참당귀 추출물의 면역활성을 측정하기위하여 B 세포와 T 세포같은 면역세포들이 많이 존재하고 하고 있는 비장세포를 이용하였다. 본 실험에서 사용된 생쥐 (BALB/c, C57BL6) 는 대한실험동물센터(충북 음성군)에서 구입한 생후 8~12 주된 암컷을 사용하였고, 실험 전까지 고형사료와 1차 증류수를 공급하면서 사육실에서 사육하였다.
참당귀(Angelica gigas Nakai)는 2005년 6월 경상북도 영천에서 수확한 것을 순천 소재 한약 도매상을 통해 구입하여 당귀 건재뿌리 100 g 을 분쇄한 후 methanol(v/v; 20times) 로 80℃ 3시간동안 추출을 3회 반복하여 가압 농축한 시료 (7.0 g)를 실험에 사용하였다
데이터처리
Data values are expressed as mean±SD of triplicate determinations. Significant differences were compared with control at *p<0.05 and **p<0.01 by Student t-test.
이론/모형
안정된 NO 산화물인 NO2-(nitrite)는 Griess 반응을 이용하여 측정하였다 (24). RAW 264.
암세포 증식억제 효과는 한국 세포주 은행으로부터 분양받은 SW480(colon cancer cells) 암세포주에 대하여 SRB 측정법으로 하였다(20). 즉, 세포배양은 RPMI 1640 배지로만든 배양액에 각각 10% FBS(fetal bovine serum) 가 첨가된것으로 사용하였으며, 세포는 37C, 5.
참당귀 methanol 추출물의 각 농도별에 대한 수소공여능 Blois 방법(17)에 대한 a,a‘-diphenyl-P-picrylydrazine(DPPH)의 환원성을 이용하여 517 nm에 UV/Vis-spectrophotometer로 측정하였다.
성능/효과
5 및 1 mg/mL 의 농도로 당귀의 methanol 추출물을 처리한 후 수소공여능, 환원력 및 hydroxyl radical 활성을 측정하였다. 그활성은 모두 추출물의 농도에 의존적으로 높게 나타났으며, 특히 수소공여능은 1 mg/mL 에서 대조군과 비교했을때 50% 정도의 활성을 나타내었다.
6과 같다. 대조군이 균일한 핵의 형태를 보이는데 반하여 시료를 처리한 암세포의 경우는농도가 증가할수록 핵이 응축되고, DNA 분절등과 같은 형태학적 관찰이 나타나 세포가 apoptosis 에 의해 사멸되는 것으로 판단된다.
따라서 상기의 결과를 종합하여 볼 때 당귀 methanol 추출물은 합성 항산화제인 0.1% BHT 에 비하여 항산화 활성이 크지는 않았지만, 추출물이 처리되지 않은 대조군에비하여 약간의 효과가 있음을 알 수가 있었다.
따라서 상기의 결과를 종합하여 볼 때 참당귀의 methanol 추출물은 면역활성에는 크게 관련이 없을 것으로 생각된다.
따라서 이들 결과는 참당귀 methanol 추출물은 약한 항산화 활성을 가지며, 면역 활성에는 큰 관련이 없지만, SW480 암 세포에서 caspase dependent pathway 에 의한 apoptosis 를유도함으로서 암세포의 사멸하는 것으로 판단되어진다.
또한 hydroxyl radical 활성을 측정한 결과는 Fig. 3과 같이 참당귀의 methanol 추출물의 농도가 증가함에 따라 hydroxyl radical 활성이 증가하는 경향을 보였으나, 합성 항산화제와 비교하여 낮은 활성을 보였다.
및 DNA 분절이 관찰되었다. 또한 참당귀 methanol 추출물이 처리된 암세포에서는 대조군에 비하여 농도에 의존적으로 caspase-3의 활성이 증가하였다.
5과 같다. 시료를 처리하지 않은 대조군은 세포증식에 있어 세포막을유지하며, plate 의 기벽에 부착되어 세포모양을 유지하고있으나, methanol 추출물 24시간 처리시 농도에 의존하여핵의 응축과 더불어 세포가 배양용기에서 떨어져 배지에부유하는 것을 관찰할 수 있었다.
참당귀 methanol 추출물을 SW480세포에 처리한 결과대조군에 비하여 농도 의존적으로 암세포의 성장을 억제하였으며, 암세포에 참당귀 methanol 추출물을 24시간 처리하여 hoechst 염색한 후 형광현미경으로 관찰한 결과 핵의 응축 및 DNA 분절이 관찰되었다. 또한 참당귀 methanol 추출물이 처리된 암세포에서는 대조군에 비하여 농도에 의존적으로 caspase-3의 활성이 증가하였다.
9와같다. 참당귀 methanol 추출물의 NO2-생성능은 대조군과차이를 보이지 않았으며, 1 ug/mL 이상의 농도에서는 오히려 감소하는 경향을 나타내었다.
8과 같다. 참당귀의 methanol 추출물 1 Ug/mL 의 농도까지는 대조군과 비교하여 상이한 차이를 보이지 않았으며 오히려 그 이상의 농도에서는 면역 세포의 증식을 감소시키는 경향을 보였으며 이는 참당귀의 methanol 추출물의 농도가 10 ug/mL 이상에서는 세포에 대한 독성을 나타내었다. Con A 및 LPS 의 혼합 첨가 시에도 비장 세포에 참당귀 methanol 추출물을 단독 첨가한 처리 구와 유사한 결과를 나타내었다.
참당귀의 methanol 추출물에 대한 세포 사멸이 caspase 와관련하는지를 알아보기 위하여 참당귀의 methanol 추출물을 처리한 대장암 세포주에 대하여 caspase-3의 활성을 측정한 결과, 참당귀의 methanol 추출물이 caspase-3의 활성을대조군에 비하여 농도에 의존적으로 증가시켜 참당귀 methanol 추출물은 SW480 세포에 대하여 적어도 caspase dependent pathway 경로에 따라 apoptosis 를 유도함을 알수 있었다 (Fig. 7).
참당귀의 methanol 추출물은 생쥐의 비장으로부터 분리한 면역세포에 대하여 대조군과 비교하여 상이한 차이를보이지 않았으며, 또한 대식세포인 RAW 264.7에서도 NO2- (Nitrite) 를 함량이 증가되지 않았다.
참당귀의 methanol 추출물을 농도별로 처리하여 금속이온 (Fe3+→Fe2+) 을 환원시키는 환원력을 측정한 결과 환원력은 농도에 의존적으로 증가하였으나 positive control과 비교하였을 때 그 활성은 크게 나타나지 않았다(Fig. 2).
1과 같다. 참당귀의 methanol 추출물의 농도를 1^, 500 및 1000 ug/mL로 처리하였을때 positive control 로 사용된 BHT와 비교하여 낮은 활성을나타내었으며, 최고농도인 1 mg/mL에서는 50% 정도의 DPPH free radical 소거 효과를 보였다. 이는 Lee 등(25)의당귀로부터 분리한 coumarinr계 decursinol angelate와 decursin 에 대해 항산화 활성을 구명한 바와 같이 참당귀 methanol 추출물에는 decursinol angelate 와 decursin 물질이함유되어 활성을 나타났을 것으로 생각된다.
참당귀의 methanol 농도가 증가할수록 SW480 세포의 성장을 억제시켰다. 특히, 80 pg/mL 농도에서 60% 이하의 성장 억제 효과를 보이는 것을 알 수 있었다. 또한 Yim 등(28)은 당귀로부터 분리한 decursin 을 인체 전립선암세포주인 DU145 의 32.
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