본 연구는 loop-mediated isothermal amplification(LAMP)을 이용하여 Clostridium difficile을 검출하고자 하였다. LAMP 수행을 위하여 선택적인 타깃 유전자로 C. difficile의 16S ribosomal RNA를 타깃으로 하여 primer set를 구성하였다. 5개의 primer set(BIP, FIP, B3, F3, LF, PF)를 이용하여 TcdA와 TcdB toxin이 모두 양성인 균주, TcdA와 TcdB toxin이 모두 음성인 균주와 식품 분리균주를 효과적으로 검출할 수 있었다. LAMP는 80분 이내의 시간이 필요하며 thermocycler와 같은 장비를 필요로 하지 않고 또한 결과를 직접 눈으로 확인할 수 있기 때문에 식품 생산 현장에서 활용될 수 있을 것이라고 생각되었다.
본 연구는 loop-mediated isothermal amplification(LAMP)을 이용하여 Clostridium difficile을 검출하고자 하였다. LAMP 수행을 위하여 선택적인 타깃 유전자로 C. difficile의 16S ribosomal RNA를 타깃으로 하여 primer set를 구성하였다. 5개의 primer set(BIP, FIP, B3, F3, LF, PF)를 이용하여 TcdA와 TcdB toxin이 모두 양성인 균주, TcdA와 TcdB toxin이 모두 음성인 균주와 식품 분리균주를 효과적으로 검출할 수 있었다. LAMP는 80분 이내의 시간이 필요하며 thermocycler와 같은 장비를 필요로 하지 않고 또한 결과를 직접 눈으로 확인할 수 있기 때문에 식품 생산 현장에서 활용될 수 있을 것이라고 생각되었다.
This study was conducted to develop a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method for the detection of Clostridium difficile. The tested target gene was 16S ribosomal RNA. Five different LAMP primer sets were designed, and LAMP was performed. All primer sets targeting the 16S rRNA gene (BIP...
This study was conducted to develop a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method for the detection of Clostridium difficile. The tested target gene was 16S ribosomal RNA. Five different LAMP primer sets were designed, and LAMP was performed. All primer sets targeting the 16S rRNA gene (BIP, FIP, B3, F3, LF, PF) were determined as positive in tcdA-positive, tcdB-postive ($A^+B^+$) and tcdA-negative, tcdB-negative ($A^-B^-$) Clostridium difficile strains. As the LAMP reaction took less than 80 min and did not require expensive machine such as thermocycler, it can be used as a rapid and simple detection method for foodborne pathogens.
This study was conducted to develop a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method for the detection of Clostridium difficile. The tested target gene was 16S ribosomal RNA. Five different LAMP primer sets were designed, and LAMP was performed. All primer sets targeting the 16S rRNA gene (BIP, FIP, B3, F3, LF, PF) were determined as positive in tcdA-positive, tcdB-postive ($A^+B^+$) and tcdA-negative, tcdB-negative ($A^-B^-$) Clostridium difficile strains. As the LAMP reaction took less than 80 min and did not require expensive machine such as thermocycler, it can be used as a rapid and simple detection method for foodborne pathogens.
* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.
문제 정의
본 연구는 loop-mediated isothermal amplification(LAMP)을 이용하여 Clostridium difficile을 검출하고자 하였다. LAMP 수행을 위하여 선택적인 타깃 유전자로 C.
본 연구에서는 최근 식중독 균으로 인정되고 있는 C. difficile에 대하여 LAMP에 의한 검출가능성을 타진하고자 16S rRNA 유전자를 타깃으로 하는 서로 다른 primer set를 구성하여 검출실험을 실시하였으며 이에 그 결과를 보고하고자 한다.
가설 설정
2)ID of primer sets tested. 3)Strain was isolated from beef.
제안 방법
1.5%(w/v) agarose gel로 Mupid-one(Advance Co., Ltd., Tokyo, Japan)을 이용하여 전기영동 하여 증폭산물을 분석하였다. UV transilluminator 위에 agarose gel을 올려 Gel print system(Core Bio Corp.
C. difficile를 사용하여 BHI에 혐기적 조건으로 37℃에서 24시간 배양한 배양액을 연속적으로 희석하여 101～105 cfu/mL의 농도로 조정하였다. 각 배양액과 희석액에서 1 mL를 취하여 DNA를 분리하고 LAMP를 수행하여 검출 한계 값을 구하였다.
DNA는 BHI에 배양한 C. difficile 배양액을 AccuPrepⓇ Genomic DNA Extraction kit(Bioneer Co., Daejeon, Korea)를 이용하여 추출하였다. 공급자가 제시한 방법에 따라 DNA를 분리하였다.
본 연구는 loop-mediated isothermal amplification(LAMP)을 이용하여 Clostridium difficile을 검출하고자 하였다. LAMP 수행을 위하여 선택적인 타깃 유전자로 C. difficile의 16S ribosomal RNA를 타깃으로 하여 primer set를 구성하였다. 5개의 primer set(BIP, FIP, B3, F3, LF, PF)를 이용하여 TcdA와 TcdB toxin이 모두 양성인 균주, TcdA와 TcdB toxin이 모두 음성인 균주와 식품 분리균주를 효과적으로 검출할 수 있었다.
, Tokyo, Japan)을 이용하여 전기영동 하여 증폭산물을 분석하였다. UV transilluminator 위에 agarose gel을 올려 Gel print system(Core Bio Corp., Seoul, Korea)으로 최종 확인하였다.
difficile를 사용하여 BHI에 혐기적 조건으로 37℃에서 24시간 배양한 배양액을 연속적으로 희석하여 101～105 cfu/mL의 농도로 조정하였다. 각 배양액과 희석액에서 1 mL를 취하여 DNA를 분리하고 LAMP를 수행하여 검출 한계 값을 구하였다. 또한 시간 별로 CCFA에 분주하여 성장시킨 후 균수를 측정하여 검출 한계 값을 보정하였다.
, Daejeon, Korea)를 이용하여 추출하였다. 공급자가 제시한 방법에 따라 DNA를 분리하였다.
difficile은 TcdA positive, TcdB positive genotype과 TcdA negative, TcdB negative genotype을 가지는 균주였다. 그리고 detection limit를 관찰하기 위하여 균주를 대상으로 101-5 cfu/mL 수준으로 십진 희석하여 각각 분리한 DNA를 대상으로 16S rRNA primer set로 LAMP를 수행하였다. 그 결과, detection limit는 6.
각 배양액과 희석액에서 1 mL를 취하여 DNA를 분리하고 LAMP를 수행하여 검출 한계 값을 구하였다. 또한 시간 별로 CCFA에 분주하여 성장시킨 후 균수를 측정하여 검출 한계 값을 보정하였다.
difficile의 16S rRNA를 target region으로 하는 염기서열을 National center for biotechnology information(NCBI)에서 검색하였다. 이 염기서열을 이용하여 LAMP primer set(BIP, FIP, B3, F3, LF, and PF)를 구성하기 위하여 Primer Explorer V4 software program and Primer3 Input(version 0.4.0, DNA STAR, Inc., Madison, WI, USA) program을 이용하였으며 설계한 primer set를 Bioneer사(Bioneer Co.)에 의뢰하여 합성하였다(Table 1, Fig 1).
대상 데이터
C. difficile의 16S rRNA를 target region으로 하는 염기서열을 National center for biotechnology information(NCBI)에서 검색하였다. 이 염기서열을 이용하여 LAMP primer set(BIP, FIP, B3, F3, LF, and PF)를 구성하기 위하여 Primer Explorer V4 software program and Primer3 Input(version 0.
Clostridium difficile(KCTC 5009, NCCP 10868, NCCP 10898)와 C. difficile 32(isolation from beef)를 Brain Heart Infusion(BHI; Oxoid, Hampshire, England)을 이용하여 37℃에서 48시간 혐기적으로 배양한 후 CCFA(Cefoxitin-Cycloserine-Fructose Agar; Oxoid)에 도말하여 형성된 단일 콜로니를 실험에 사용하였다.
성능/효과
difficile의 16S ribosomal RNA를 타깃으로 하여 primer set를 구성하였다. 5개의 primer set(BIP, FIP, B3, F3, LF, PF)를 이용하여 TcdA와 TcdB toxin이 모두 양성인 균주, TcdA와 TcdB toxin이 모두 음성인 균주와 식품 분리균주를 효과적으로 검출할 수 있었다. LAMP는 80분 이내의 시간이 필요하며 thermocycler와 같은 장비를 필요로 하지 않고 또한 결과를 직접 눈으로 확인할 수 있기 때문에 식품 생산 현장에서 활용될 수 있을 것이라고 생각되었다.
그 결과, detection limit는 6.0×101 cfu/mL로 측정되었으며 tube 상으로 관찰하였을 때도 증폭산물을 확인할 수 있었다.
한편, 소매점 분쇄육에서 분리한 12균주 중 8균주가 환자에게 발견되는 ribotype 027과 80%의 유사성이 있다고 하였으며, 또한 소고기에서 분리한 31균주는 8개의 ribotype을 가지고 있었는데 7종은 사람에게 발견되는 것이었다고 하였다(7). 또한 애리조나 주에서 식육에 대한 조사 결과 88 시료중 37개 시료에서 C. difficile이 검출되었다고 하였으며 분리 균주 중 25균주는 ribotype 078에 속하였으며 ribotype 027에 속하는 것도 4균주라고 하였다(8). 이와 같이 C.
본 연구에서 16S rRNA 유전자를 바탕으로 구성된 5개의 target sequence에서 C. difficile의 TcdApositive, TcdBpositive( A+B+)와 TcdA-negative, TcdB-negative(A-B-)의 genotype 균주와 분리 균주 모두에서 양성으로 나타났으며 detection limit는 101 cfu/mL로 매우 낮게 측정되었다. 따라서 16S rRNA를 타깃으로 하는 LAMP는 toxin 생성 여부에 상관없이 모든 C.
difficile 1종에서 추출한 genomic DNA를 16S rRNA 유전자 sequence를 이용하여 구성한 5종의 primer set의 LAMP 수행 결과를 Table 2에 나타내었다. 실험에 사용된 primer set 중 16S rRNA를 타깃으로 하여 구성된 primer set 5개 중 5종 모두에 대해서 C. difficile 4종이 증폭되었다(Fig. 2). 증폭된 C.
후속연구
5개의 primer set(BIP, FIP, B3, F3, LF, PF)를 이용하여 TcdA와 TcdB toxin이 모두 양성인 균주, TcdA와 TcdB toxin이 모두 음성인 균주와 식품 분리균주를 효과적으로 검출할 수 있었다. LAMP는 80분 이내의 시간이 필요하며 thermocycler와 같은 장비를 필요로 하지 않고 또한 결과를 직접 눈으로 확인할 수 있기 때문에 식품 생산 현장에서 활용될 수 있을 것이라고 생각되었다.
difficile의 TcdApositive, TcdBpositive( A+B+)와 TcdA-negative, TcdB-negative(A-B-)의 genotype 균주와 분리 균주 모두에서 양성으로 나타났으며 detection limit는 101 cfu/mL로 매우 낮게 측정되었다. 따라서 16S rRNA를 타깃으로 하는 LAMP는 toxin 생성 여부에 상관없이 모든 C. difficile을 분리할 수 있을 것으로 생각되며, 검출한계도 realtime PCR 수준으로 매우 낮으므로 신속 검출 기술로 활용이 가능할 것으로 생각되었다. 또한 분석시 고가의 장비를 필요로 하지 않으며 검출 결과를 눈으로 직접 확인할 수 있으며 고도의 분석기술을 요구하지 않기 때문에 식품 생산 현장에서 활용될 수 있을 것이라고 생각되었다.
difficile을 분리할 수 있을 것으로 생각되며, 검출한계도 realtime PCR 수준으로 매우 낮으므로 신속 검출 기술로 활용이 가능할 것으로 생각되었다. 또한 분석시 고가의 장비를 필요로 하지 않으며 검출 결과를 눈으로 직접 확인할 수 있으며 고도의 분석기술을 요구하지 않기 때문에 식품 생산 현장에서 활용될 수 있을 것이라고 생각되었다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
Clostridium difficile이 햄버거 패티 등을 조리 시 일반적인 조리시간이나 온도에 사멸되지 않고 존재할 가능성이 있는 이유는 무엇인가?
원인 식품으로는 고기, 야채, 즉석식품 등 다양한 식품이 제시되고 있다(9,10). 또한 C. difficile은 열 저항을 가지는 포자를 형성하기 때문에 햄버거 패티 등을 조리 시 일반적인 조리시간이나 온도에 사멸되지 않고 존재할 가능성이 있으며 조리된 즉석편의 식품이나 냉장 식품, 샐러드에서도 포자 상태로 존재하고 있다가 germinate 되어 CDAD 식중독의 원인이 될 수 있다(11,12).
Clostridium difficile이란 무엇인가?
Clostridium difficile은 혐기성 그람 양성 간균으로 아포를 생성하며 설사 입원 환자의 주요한 원인균이다. 1978년 항생제와 연관된 C.
염기서열 분석에 이용되는 유전자는 무엇이 있는가?
염기서열 분석은 미생물 동정의 최종적인 방법이 되며 이 때 이용되는 유전자는 16S rRNA, 16S-23S rRNA ITS(internally transcribed spacer), 65 kDa heat-shock protein gene(hsp65), RNA polymerase-subunit gene(rpoB)이다(13). 이 중 16S rRNA 유전자는 모든 박테리아에 존재하며 보존부위 및 변이부위를 가지고 있어 미생물 계통분류에 이상적인 유전자로 미생물 동정에도 많이 연구되었다(14).
참고문헌 (22)
Larson HE, Price AB, Honour P, Borriello SP. 1978. Clostridium difficile and the aetiology of pseudomembranous colitis. Lancet 1: 1063-1066.
Lee YJ, Choi MG, Lim CH, Jung WR, Cho HS, Sung HY, Nam KW, Chang JH, Cho YK, Park JM, Kim SW, Chung IS. 2010. Change of Clostridium difficile colitis during recent 10 years in Korea. Korean J Gastroenterol 55: 169-174.
Ricciardi R, Rothenberger DA, Mandoff RD, Baxter NN. 2007. Increasing prevalence and severity of Clostridium difficile colitis in hospitalized patients in the United States. Arch Surg 142: 624-631.
Pepin J, Valiquette L, Cossette B. 2005. Mortality attributable to nosocomial Clostridium difficile-associated disease during an epidemic caused by hyper virulent strain in Quebec. CMAJ 173: 1037-1042.
Tae CH, Jung SA, Song HJ, Kim SE, Choi HJ, Lee M, Hwang Y, Kim H, Lee K. 2009. The first case of antibiotic-associated colitis by Clostridium difficile PCR ribotype 027 in Korea. J Korean Med Sci 24: 520-524.
McDonald LC. 2009. Surveillance for Disease and Sources of Infection: Initiatives at the Federal Level and International. Division of Healthcare Quality Promotion, Centers for Disease Control and Prevention. Atlanta, GA, USA.
FDA. 2010. Draft Guidance for Industry and Food and Drug Administration Staff－Establishing the Performance Characteristics of In Vitro Diagnostic Devices for the Detection of Clostridium difficile. November 29, 2010. Food and Drug Administration, New Hampshire, MD, USA.
Gould LH, Limbago B. 2010. Clostridium difficile in food and domestic animals: a new foodborne pathogen? Clin Infec Dis 51: 577-582.
Lawley R. Clostridium difficile-a food safety hazard? http://www.foodsafetywatch.com/public/617.cfm
Patel JB, Leonard DG, Pan X, Musser JM, Berman RE, Nachamkin I. 2000. Sequence-based identification of Mycobacterium species using the MicroSeq 500 16S rDNA bacterial identification system. J Clin Microbiol 38: 246-251.
Braun V, Hundsberger T, Leukel P, Sauerborn M, von Eichel-Steiber C. 1996. Definition of the single integration site of the pathogenicity locus in Clostridium difficile. Gene 181: 29-38.
Mori Y, Nagamine K, Tomita N, Notomi T. 2001. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochem Biophys Res Commun 289: 150-154.
Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K, Amino N, Hase T. 2000. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucl Acid Res 28: e63.
Kato H, Yokoyama T, Kato H, Arakawa Y. 2005. Rapid and simple method for detecting the toxin B gene of Clostridium difficile in stool specimens by loop-mediated isothermal amplification. J Clin Microbiol 43: 6108-6112.
Noren T, Alriksson I, Andersson J, Akerlund T, Unemo M. 2011. Rapid and sensitive loop-mediated isothermal amplification test for Clostridium difficile detection challenges cytotoxin B cell test and culture as gold standard. J Clin Microbiol 49: 710-711.
AI-Helper
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.