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문제 정의
- 그러나 함박잎새버섯의 효능에 관하여서는 보고된바 없다. 본 연구에서는 잎새버섯의 특이한 D-glucan 및 다양한 생리활성효과와 관련하여 함박잎새버섯의 생리활성촉진 효과를 확인하고 이를 당뇨에 의한 대사장애 예방을 위한 건강보조식품으로써 개발하고자 하였다. 이를 위해 당뇨를 가진 실험쥐에 대한 혈당과 지질함량 변화, 그리고 이에 대한 효능의 기전을 췌장의 조직에 대한 영향을 통해 함박잎새버섯의 새로운 기능성을 확인하였다.
가설 설정
- 1)Values are means±SD of 8 rats. Means with different superscripts within a row (a-d) indicate significant differences (p<0.
- 2)Values are mean±SD of 6 rats. Different superscripts within a column(a-b) indicate significant differences(p<0.
제안 방법
- 3) 에 55 ㎎/㎏의 농도로 대퇴부 근육에 주사하여 이루어졌다. 당뇨 유발 확인을 위해 STZ 투여 48시간 후 꼬리 정맥으로부터 취한 혈액의 공복시 혈당농도를 통해 이루어졌다. 혈당농도가 300 mg/dl 이상인 동물을 실험에 이용하였다.
- 당뇨 유발은 조 등[16]의 방법을 참조하여 체중이 290±10g 인 실험동물을 12시간 동안 금식시 킨 후 streptozotocin(STZ, Sigma Chem. Co. MO, USA) 을 0.1M citrate buffer(pH 4.3) 에 55 ㎎/㎏의 농도로 대퇴부 근육에 주사하여 이루어졌다. 당뇨 유발 확인을 위해 STZ 투여 48시간 후 꼬리 정맥으로부터 취한 혈액의 공복시 혈당농도를 통해 이루어졌다.
- 혈당농도가 300 mg/dl 이상인 동물을 실험에 이용하였다. 당뇨 유발이 확인된 실험쥐를 이용하여 Table 2에서처럼 정상군(NC: normal group), 고지방식이군(HF: high fat-treated group), 고지방식이와 더불어 당뇨유발 대조군(HFDM: STZ-induced diabetic and high fat-treated group), 고지방식 이와 당뇨 유발과 더불어 1% 함박잎새버섯분말 식이군(DAI: 1% hambag mushroom powder- and high fat-treated group after STZ-induced diabetic), 고지방식이와 당뇨 유발과 더불어 2% 함박잎새버섯분말 식 이군(DAH: 2% hambag mushroom powder- and high fat-treated group after STZ-induced diabetic) 등 군 당 마리씩 5군으로 나누어 6주간 사육하였다. 고지방 식이는 Table 2에서처럼 당뇨가 확인된 실험쥐에 10% 돈지(Lard)와 0.
- 25% sodium cholate를 함유한 식 이 사료 (PMI Nutrition International, LLC, Brentwood, Newhampshire, USA)을 통해 이루어졌다. 동물실험실의 온도는 20±5℃, 습도는 55~60%로 하였으며 12시간 light-dark cycle로 조정하였다.
- 파라핀 포매시켰다. 두께 4 um 크기로 절단하여 hema-toxylin-eosin (HE) 염색을 통해 광학현미경으로 관찰 촬영하였다.
- 그러나 이러한 추정을 뒷받침하기 위해서는 혈중 유리 지방산 농도 증가에 따른 당질이용을 감소시키는 것을 확인할 수 있는 생화학적 지표인 Glucose-6-phos-phate(G-6-P) 농도 및 당원합성효소 활성도 등의 측정이 필요하다[26]. 본 연구에서 이러한 고지방식이와 STZ에 의해증가된 혈당에 대한 함박잎새버섯분말에 영향을 투여 농도를 달리하여 조사하였다.
- 인슐린의존성 당뇨병을 유발한다. 본 연구에서는 STZ 에 의한 췌장의 베타세포에 대한 조직 손상을 확인하고 함박잎새분말투여에 의한 변화를 비교하였다. 이를 위해 6주간실험식이로 성장시킨 실험동물의 췌장 및 신장 조직을 HE로 염색하여 광학현미경 하에서 관찰하였으며 그 성적은 Fig.
- 인슐린 저항성은 인슐린비의존형 당뇨병의 중요한 병인으로 작용한다. 본연구에서는 췌장의 베타세포를 파괴시켜 인슐린분비를 저하시키는 인슐린의존형 당뇨를 유발하는 STZ를 투여와 동시에 고지방식이를 통해 혈당과 혈장지질에 대한 표고버섯 분말의 효과를 확인하였다(Table 4). 그러나 고지방식이를 투여한 HF군은 6주 후 혈당이 128.
- 본 연구에서는 STZ 에 의한 췌장의 베타세포에 대한 조직 손상을 확인하고 함박잎새분말투여에 의한 변화를 비교하였다. 이를 위해 6주간실험식이로 성장시킨 실험동물의 췌장 및 신장 조직을 HE로 염색하여 광학현미경 하에서 관찰하였으며 그 성적은 Fig. 1 과 같다. NC군 및 HF군의 경우에는 췌장 내분비선의 전형적인 형태를 보이고 있으며 혈관을 중심으로 분비 세포들의 기능적 배열이 정상적으로 나타나고 있으며 조직 세포의 어떠한 손상도 관찰되지 않았다.
- 본 연구에서는 잎새버섯의 특이한 D-glucan 및 다양한 생리활성효과와 관련하여 함박잎새버섯의 생리활성촉진 효과를 확인하고 이를 당뇨에 의한 대사장애 예방을 위한 건강보조식품으로써 개발하고자 하였다. 이를 위해 당뇨를 가진 실험쥐에 대한 혈당과 지질함량 변화, 그리고 이에 대한 효능의 기전을 췌장의 조직에 대한 영향을 통해 함박잎새버섯의 새로운 기능성을 확인하였다.
- 자실체를 수확하여 동결건조방법을 통해 분말로 만들었으며 영양소의 분말조성 성분은 Table 1과 같다.
- 체중, 식이 및 물 섭취량은 전 실험 기간을 통하여 매일 일정한 시간에 측정하였다. 식이효율(feed efficiency ratio, FER)은 같은 기간 동안의 체중증가량을 동일 기간의 식이 섭취량으로 나눈 값으로 하였다.
- 0 ml를 가하여 37C에서 10분간 반응시킨 후 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총콜레스테롤함량은 중성지 질의 경우와 동일한 용량비로 37C에서 5분간 반응, 500 nm에서 흡광도를 측정하여 계산식인 mg/dl = (표준용액의 흡광도/ 검액의 흡광도) X 300을 이용하여 산출하였다. HDL-콜레스테롤 함량은 혈청 0.
- 혈당은 16시간 절식시킨 후 꼬리부위 혈관에서 란셋으로 채혈하여 Gluco-Tester(Life Scan lnc.z USA)로 1 주마다 측정하였다.
대상 데이터
- 실험동물은 4주령의 Sprague-Dawley 종 수컷 흰쥐 (120±10g)를 구입하여 표준사료를 이용하여 1주간 적응시켰다. 당뇨 유발은 조 등[16]의 방법을 참조하여 체중이 290±10g 인 실험동물을 12시간 동안 금식시 킨 후 streptozotocin(STZ, Sigma Chem.
- 당뇨 유발 확인을 위해 STZ 투여 48시간 후 꼬리 정맥으로부터 취한 혈액의 공복시 혈당농도를 통해 이루어졌다. 혈당농도가 300 mg/dl 이상인 동물을 실험에 이용하였다. 당뇨 유발이 확인된 실험쥐를 이용하여 Table 2에서처럼 정상군(NC: normal group), 고지방식이군(HF: high fat-treated group), 고지방식이와 더불어 당뇨유발 대조군(HFDM: STZ-induced diabetic and high fat-treated group), 고지방식 이와 당뇨 유발과 더불어 1% 함박잎새버섯분말 식이군(DAI: 1% hambag mushroom powder- and high fat-treated group after STZ-induced diabetic), 고지방식이와 당뇨 유발과 더불어 2% 함박잎새버섯분말 식 이군(DAH: 2% hambag mushroom powder- and high fat-treated group after STZ-induced diabetic) 등 군 당 마리씩 5군으로 나누어 6주간 사육하였다.
데이터처리
- 모든 실험결과는 실험동물 6-8마리의 평균치와 표준편차로 나타내었으며, 유의성 검증은 SPSS(Statistical Package for Social Sciences, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) software package program을 이용하여 Duncan's multiple range test를 행하였다.
이론/모형
- 0 ml을 가하여 370에서 5분간 반응시킨 후 500 nm에서 흡광도를 측정하여 계산식인 mg/dl = (표준용액의 흡광도/검체용액의 흡광도) X 100을 통해 산출하였다. LDL-콜레스테롤함량은 Friedewald 등의 방법에 따라 계산식인 총콜레스테롤 - {HDL-콜레스테롤량 + (중성지질/5)}에 의하여 산출되었다.
- 췌장조직은 Degertekin 등[8]의 방법을 참조하여 6주 동안 사육된 실험흰쥐의을 분리하여 10% 중성 포르말린에 고정 및 파라핀 포매시켰다. 두께 4 um 크기로 절단하여 hema-toxylin-eosin (HE) 염색을 통해 광학현미경으로 관찰 촬영하였다.
- 중성지질, 총콜레스테롤, HDL.콜레스테롤 함량의 함량은 kit 시약 (AM 157S-K, AM 202-K, AM 203-K, Asanpharm Co., Hwasung, Korea)으로 Fridwald 둥[11]의 방법을 참조하여 측정하였다. 중성지질의 함량은 혈청 0.
성능/효과
- 1. 함박잎새버섯분말 투여에 의한 체중증가량은 당뇨를 가진 실험쥐의 2 배로 분말이 당뇨에 의해 유도된 체중감소의 병폐현상을 막아주는 주는 역할을 하는 것으로 추정된다.
- 2. 함박잎새버섯분말 투여는 혈당을 약 200 mg/dl 정도 감소한 당뇨를 가진 실험쥐 혈당의 약 50% 수준이었다.
- 3. 당뇨 유발에 의헤 증가된 Triglyceride, 총콜레스테롤, LDL-cholesterol의 함량은 함박잎새버섯분말 투여에 의해 용량-의존성 경향을 보이면서 감소되었다. 그러나 당뇨 유발에 의해 감소된 HDL-cholesterol 함량은 함박잎새버섯분말 투여에 의해 증가되었다.
- 4. 함박잎새버섯분말 투여에 의한 당뇨-유도성 췌장 손상 정도가 감소하였으며 이러한 효능이 당뇨 유발 실험쥐에 있어서 고혈당과 고혈지질을 조절하는 부분적인 기전으로 이해된다.
- 05). Triglyceride 함량은 대조군인 NC는 86.35+8.48 mg/ dl, HF군은 94.05+9.42 mg/dl이며 당뇨 유발된 HFDM군은 170.14+13.03 mg/dl으로 약 200% 정도 증가되었다 (p < 0.05). 그러나 잎새투여군인 DAI 및 DAII군에서 약 80% 및 67% 정도인 각각 136.
- 그러나 이러한 변화에도 불구하고 본 연구의 조건에서 고지방식이를 투여한 HF군의 혈당변화는 없었던 것으로 보아 glucose-fatty acid cycle의 활성화를 통한 인슐린 저항성이 발생을 유도하지 못한 것으로 사료된다. 고지방식이와 더불어 STZ을 처리한 HFDM군의 HDL cholesterol 함량은 37.12± 3.59 mg/dl으로 NC의 56.10±5.47 mg/dl 농도에 비해 약 35% 정도로 크게 농도가 낮아졌다 (p < 0.05). 일반적으로 인슐린 비의존성 당뇨인 경우 triglyceride가 높게 나타나고 HDLvholester이이 낮게 나타나는 지질 대사에 이상이 있는 것으로 알려졌다[2, 12, 21].
- 59 mg/dl으로 유의하게 감소하였다. 그러나 잎새 분말투여군인 DAI 및 DAII군에서 약 20-30% 정도 증가한 49.97±5.21 mg/dl, 52.85±7.49 mg/dl으로 HDL-cholesterol 함량이 확인되었으며 농도-의존적 경향은 없었다 (p > 0.05).
- 05). 그러나 잎새투여군인 DAI 및 DAII군에서 약 20-30% 정도인 각각 128.13±12.05, 107.84 +13.82 mg/dl의 총콜레스테롤 함량이 유의하게 감소했으며 특히 함박잎새버섯 투여용량-의존적 감소 경향을 보였다(P < 0.05). Triglyceride 함량은 대조군인 NC는 86.
- 05). 그러나 잎새투여군인 DAI 및 DAII군에서 약 80% 및 67% 정도인 각각 136.32+10.71 114.67±10.90 mg/dl의 Triglyceride 함량으로 유의하게 감소했으며 함박잎새버섯분말의 용량-의존적 경향을 보였다.
- 그러나 함박잎새버섯분말을 1%(DAI), 2%(DAII) 급여한 군들에서는 식이 섭취량이 NC보다 약 30% 정도 증가한 각각 223.27±6.18, 225.85±18.03 g/week이었지만 체중증가량은 각각 17.42±5.96, 17.65+8.70 g/week으로 NC의 42.92±1.83 g/week에 약 40% 정도로 감소하였다 (p , 특히 함박잎새버섯분말 투여에 의한 체중증가량은 HFDM의 2 배로 분말이 당뇨에 의해 유도된 체중감소의 병폐현상을 막아주는 주는 역할을 하는 것으로 추정된다.
- 14 mg/dl이었다. 그러나증가된 LDL-cholesterole 함박잎새버섯분말를 처리한 DAI 및 DAII군은 각각 50.90+6.28 mg/dl, 32.06±4.78 mg/ dl으로 60%와 약 40% 수준으로 감소되었으며 특히 함박잎새버섯분말의 농도-의존적 감소가 확인되었다 (p < 0.05). HDL-cho-lesterol 함량은 NC의 경우 56.
- 이러한 고지방식이와 STZ에 의한 혈당 농도는 투여 후 48시간이내 빠르게 상승하였다. 대부분의 연구에서 일반적으로 STZ 투여 후 48 시간이내에 혈당이 약 200-300 mg/dl 정도인 대조군보다 약 2-3배 상승 다른 연구 [16] 결과와 비교할 때 본 연구에서의 혈당이 약 4배 이상 매우 높은 혈당치가 유도된 것이 확인되었다. 이러한 HFDM군에서의 높은 혈당은 비록 고지방식이 자체에 의해서는 혈당의 농도 증가를 유발하지 않지만 STZ와 같이 처리되었을 때에는 고지방식이가 혈당을 증가시키는 상승작용을 하는 것으로 사료된다.
- 특히 pglucane 식이로부터 위나 소장에서 당흡수를 억제하는 것으로 확인되었다μ8]. 따라서 함박잎새버섯의 혈당에 대한 조절은 본 연구에서 확인된 췌장의 손상 감소와 더불어 Pglucan에 의한 효능으로 추정된다. 그러나 본 연구에서 비록함박잎새버섯에 의한 췌장 손상이 감소뿐 아니라 p-glucan 에 의해 혈당이 조절과 더불어 고혈지질에 대한 함박잎새버섯의 효능은 P-glucan 성분에 의해 소장으로 배출되는 담즙산의 변화를 유도하여 지질흡수의 중요기전이 miceUes 형성을 방해시키는 것으로 추정되기 때문에 이에 대한 추가적인 실험을 통해 확인이 필요하다.
- 05). 또한 6주 동안 주마다 측정치도 높거나 낮아 NC군과 HF군의 평균 혈당은 유의한 차이가 없었다. 이는 본 연구에서 고지방식이 자체로만 당뇨 유발 효과가 없는 것으로 추정된다.
- 이와 더불어 인슐린의존성 및 인슐린 비의존성 당뇨 모두에서는 LDL-cholesterol이 증가하고 HDLYholesterol이 감소한다고 알려졌다[2, 7, 12]. 본 연구에서는 STZ를 처리하여 인슐린의존성 당뇨를 유발한 결과, LDL-cholesterol 함량의 유의한 증가와 HDL-cholesterol 함량의 유의한 감소로 보고된 바와 같이 유사한 경향을 보였다. 그러나 이러한 변화는 함박잎새버섯분말 투여에 의해 HDLcholester이인 경우 약 30% 증가, LDLYholesterol인 경우 약 40% 감소되었다.
- 이는 함박잎새버섯분말이 당뇨와 고지방식이로 유발된 높은 혈당을 감소시키는 것으로 추정된다. 이러한 함박잎새버섯분말에 의한 혈당감소는 투여 후 초기 1-2 주에는 약 10-20% 정도 감소시 켰으나 투여 기간이 많아질수록 혈당감소율은 컸으며 6주후에는 약 50% 정도감소되었다. 그러나 버섯분말의 투여량에 대한 혈당감소율의 차이는 없는 것으로 확인되었다.
- 이와 같이 고지방식이를 투여한 HF군에서 Triglyceride, 총콜레스테롤, HDL cholesterol과 LDL cholesterol의 함량은 NC군의 함량과 비교하여 6주 후 LDLvholesterol과 HDL-cholesterol 함량에 있어서 유의한 변화가 확인되었다. 그러나 이러한 변화에도 불구하고 본 연구의 조건에서 고지방식이를 투여한 HF군의 혈당변화는 없었던 것으로 보아 glucose-fatty acid cycle의 활성화를 통한 인슐린 저항성이 발생을 유도하지 못한 것으로 사료된다.
- 83 g/week인 NC의 20%에 불과하였다. 즉 일반적으로 잘 알려진 식이섭취량은 증가하지만 체중증가량은 감소하는 당뇨의 병폐 현상이 본 연구에서도 확인되었다. 이러한 현상은 STZ 당뇨를 유발시킨 쥐에서 포도당 이용이 현저히 저하되고 체외 배출에 기인하는 것으로 알려졌다[7].
- 이러한 이상지혈증은 비정상적인 지질과 지단백(lipoprotein) 등인데 대부분이 인슐린의존성 또는 인슐린 비의존성인 1형 및 2형 당뇨병 모두에서 나타난다[2, 25, 28]. 특히 당뇨병 환자의 이상지혈증은 혈장 중성지방농도가 증가하고 HDL-cholesterol이 감소하는 것으로 확인되었다(2). 이러한 당뇨에 의한 대사장애와 관련하여 버섯의 효능 또한 혈당과 코지혈과 관련하여 연구가 다소 이루어졌다.
- 그러나 이러한 변화는 함박잎새버섯분말 투여에 의해 HDLcholester이인 경우 약 30% 증가, LDLYholesterol인 경우 약 40% 감소되었다. 특히 당뇨병에서 고지혈에 의한 심혈관 질환의 위험농도인 HDL-cholesterol의 35 mg/dl 정도까지 감소된 농도를 크게 증가시켰다. 이러한 결과는 다른 버섯에 의한 혈청지질의 농도 변화에 대한 효과와 유사한데 버섯의 섬유소와 다당류가 장에서 지질흡수를 지연시키거나 억제하여 당뇨에 의한 혈청지질 농도를 조절하는 것으로 추정하고 있다.
- 그러나 STZ를 투여한 당뇨 군인 HFDM군의 경우 가장자리의 핵들은 핵질의 밀도가 일정한 모습으로 관찰되지만 중앙부위의 세포들은 심한 종창현상을 보이고, 몇몇 세포들은 괴사의 결과로 보이는 부분이 관찰되었다. 한편 STZ투여 후 함박잎새버섯 1% 첨가 식이 군인 DAI군에서는 HFDM군에서 관찰되었던 종창현상이 현저히 감소하였으며, 특히 2% 첨가식이군인 DAⅡ의 췌장은 중앙부 세포들의 핵과 크기가 균질하고 세포들의 형태적 변화가 관찰되지 않아 NC군과 유사하게 정상 형태를 유지하고 있다. 따라서 STZ에 의해 증가된 혈당은 손상된 췌장 조직에 의한 인슐린의존성 당뇨에 기인하는 것으로 추정된다.
- 함박잎새버섯분말 1%와 2% 투여군인 DAI과 DAⅡ는 각각 217.3±82.60 mg/dl와 241.0+75.02 mg/dl으로 HFDM군의혈당 452.7±19.22 mg/dl보다 약 200 mg/dl 정도 감소된 혈당을 보여 주었다 (p < 0.05). 이는 함박잎새버섯분말이 당뇨와 고지방식이로 유발된 높은 혈당을 감소시키는 것으로 추정된다.
- 그러나 버섯분말의 투여량에 대한 혈당감소율의 차이는 없는 것으로 확인되었다. 함박잎새버섯분말에 의한 이러한 혈당감소 효능은 본 연구에서 이용된 고지방식이에 의해 유발된 인슐린비의존성에 기인한 것보다 인슐린 의존성에 의한 증가된 혈당 조절에 기인할 것으로 추정된다. 이러한 추정은 6주간 고지방식이를 통해 혈당이 거의 증가하지 않았다는 측면에서 이해할 수 있다.
후속연구
- 따라서 함박잎새버섯의 혈당에 대한 조절은 본 연구에서 확인된 췌장의 손상 감소와 더불어 Pglucan에 의한 효능으로 추정된다. 그러나 본 연구에서 비록함박잎새버섯에 의한 췌장 손상이 감소뿐 아니라 p-glucan 에 의해 혈당이 조절과 더불어 고혈지질에 대한 함박잎새버섯의 효능은 P-glucan 성분에 의해 소장으로 배출되는 담즙산의 변화를 유도하여 지질흡수의 중요기전이 miceUes 형성을 방해시키는 것으로 추정되기 때문에 이에 대한 추가적인 실험을 통해 확인이 필요하다.
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