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문제 정의
- 1에서와 같이 시료와 농도에 관계없이 14% 이하의 낮은 세포독성을 나타냈으며 특히, 시료농도 100 ug/mL 첨가 시 Chang 세포에 대해서는 헛개나무 잎 추출물 및 분획물의 처리에 따른 세포 증식 저해효과가 나타나지 않았다. 따라서 헛개나무 잎 메탄올 추출물 및 분획물들이 사람의 간암세포 HepG2와 결장암 세포 HT29 성장에 미치는 영향을 검토하였다. 그 결과 Table 5에서와 같이 헛개나무 잎의 메탄올 추출물은 두 암세포에 대한 저 해효과가 높았으며 이 같은 효과는 첨가되는 추출물의 농도에 비례하면서 증가하였다.
- 이와 같이 헛개나무의 근피, 수피, 열매에 대해서는 생리활성물질의 분리가 이루어지며 그 효능에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으나 잎에 대한 생리활성 효과는 거의 없는 상태이다. 이에 본 연구에서는 헛개나무잎 추출물의 항돌연변이원성 및 항암효과를 검토하기 위하여, 헛개나무 잎으로부터 메탄올 추출물과 그 분획물을 조제하여 Ames test로서 항돌연변이원성을 확인한 후 사람의 암세포에 대한 성장 저해 효과를 관찰하였다.
제안 방법
- 이것을 top agar 2 mL와 혼합한 후 최소평판배지 (minimal 읺ucose agarplates)에 골고루 도말하였다. 37℃에서 48시간 배양한 후 배지 위의 복귀변이주(revertant)의 콜로니 수를 계수하였다. 체내 대사 활성 체계인 microsomal fraction 즉 S9 mixture 제조는 Maron과 Ames(16)의 방법으로 제조하였다.
- 특히 헛개나무 잎 추출물 및 분획물들이 직 . 간접 발암물질에 대하여 암의 개시단계에서 일어날 수 있는 돌연변이 유발 억제 효과를 가졌으므로, 암 연구 검색방법으로 이용되고 있는 MTT 정 량분석 법을 이용하여 암세포에 대한 이들의 직접적인 효과를 살펴보았다.
- 따라서 헛개나무 잎 추출물의 돌연변이 억제작용을 검토하기 위하여 직 . 간접 발암물질을 첨가하여 이들 발암물질에 대한 억제효과를 살펴보았다.
- 5 g)로 얻었다. 그 잔여물을 분획여두에서 다시 클로르포름, 부탄올로 각각 3번씩 추출하여 클로르포름(6.0 g), 부탄올 분획 물(5.5 g)로 하고 남은 잔여물은 물 분획 물(5.2 g)로 하였으며 모든 추출물은 농축한 후 동결 건조하여 -30℃에 보관하면서 실험에 사용하였다.
- 돌연변이 유발 억제효과를 나타내는 헛개나무 잎 추출물들의 특성을 자세히 조사하고자 용매의 극성을 이용한 용매분획을 실시하여 헥산, 클로르포름, 부탄올, 물 분획물로 세분화하여 항돌연변이 효과를 관찰하였다. 그 결과 이들 분획물들은 MNNG의 돌연변이를 억제시켰으며 특히, 시료농도 10% 첨가 시 헥산, 클로르포름, 부탄올 분획물은 각각.
- 실시하였다. 먼저 배양된 세포에서 배지를 제거한 다음 PBS를 첨가하여 가볍게 섞은 후 PBS를 다시 제거하고 0.25% trypsin-EDTA를 첨가하여 37℃에서 5분간 배양하여 세포가 culture dish의 바닥으로부터 완전히 분리되었는지 현미경으로 관찰한 후, culture 배지를 첨가하여 잘 혼합한 다음 세포수를 lxlO6 cells/m丄로 조정하여 실험에 사용하였다. 한편 헛개나무 잎의 메탄올 추출물과 분획물들은 각각 적 당한 농도로 DMS。에 용해 시킨 후 membrane filter 로 여과한 후 사용하였다.
- 먼저 헛개나무 잎 메탄올 추출물 및 분획물들의 항암 효과가 암세포에 대해 선택적으로 작용해 나타낸 효과인지 혹은 모든 세포를 죽여 항암 효과를 나타낸 효과인지를 확인하기 위하여, 정상 간세포인 Chang cell에 대하여 농도별 세포독성을 살펴보았다. 그 결과 Fig.
- 그리고 사람의 정상 간세포인 Chang cell을 사용하였다. 세포 배양시 에는 HT29와 Chang 세포는 RPMI-1640 배지에 10% FBS (10% -heat-inactivated fetal bovine serum) 와 1% antibiotics (penicillin G/streptomyCin) 을 가하여 배양하였으며 HepG2 세포는 DMEM 배지에 10% FBS, 1% antibiotics을 첨가하여 배양하였다. 이들 세포주는 37℃의 5% CO에 적응시켜 배양하였으며 2~3일마다 계대 배양하면서 실험에 사용하였다.
- 예로부터 약용으로 이용되어온 헛개나무 잎을 이용하여 항돌연변이 원성 및 암세포 성장 저해효과를 조사하였다. 헛개나무 잎의 돌연변이 억제 효과를 Ames test로 검색한 결과, 헛개나무 잎의 메탄올 추출물과 분획물 그 자체의 돌연변이 원성은 없었으며, 헛개나무 잎의 메탄올 추출물은 직접 변이 원인 N-methyl-N' -nitro-N-nitrosc广guanidine(MNNG) 와 간접변이원인 benzo(a)pyrene(B(a)P)의 돌연변이 유발성을 크게 저해하였다.
- 체내 대사 활성 체계인 microsomal fraction 즉 S9 mixture 제조는 Maron과 Ames(16)의 방법으로 제조하였다. 한 시료에 대하여 3개의 최소평판배지를 사용하였으며, 변이원에 대한 억제효과는 변이원 물질의 활성에 대한 시료의 억제율(inhibition %)로 나타내었다. 한편 시료와.
- 활성 높은 친전자성 물질로 분해된 후 alkyl ion을 형성하여 DNA 염기의 nucleophilic site를 알킬화하고 DNA 절단, 염색체 이상의 변이를 일으키는 것으로 알려져있다(18). 헛개나무 잎을 먼저 메탄올로 추출하여 S. Typhimurium TA100 균주에서 MNNG에 대한 항돌연변이 효과를 검토하였다. 그 결과, Table 1에서와 같이 메탄올 추출물 2.
대상 데이터
- 그리고 사람의 정상 간세포인 Chang cell을 사용하였다. 세포 배양시 에는 HT29와 Chang 세포는 RPMI-1640 배지에 10% FBS (10% -heat-inactivated fetal bovine serum) 와 1% antibiotics (penicillin G/streptomyCin) 을 가하여 배양하였으며 HepG2 세포는 DMEM 배지에 10% FBS, 1% antibiotics을 첨가하여 배양하였다.
- Ames 교수로부터 제공 받아 사용하였다. 돌연변이 유발원 인 N-methyl-N'-nitro-N-nitroso-guanidine(MNNG), benzo(a)pyrene(B(a)P) 은 Sigma(St. Louis, USA)사로부터 구입하였으며 , 기타시 약들은 특급 또는 일급을 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 헛개나무 잎은 경북 의성군 봉양면 백석농업합명 회사에서 건조된 것을 구입하여 이물질을 제거한 후 사용하였고, Salmonella Typhimurium TA98과 TA100 은 미국 캘리포니아 대학의 B. N. Ames 교수로부터 제공 받아 사용하였다. 돌연변이 유발원 인 N-methyl-N'-nitro-N-nitroso-guanidine(MNNG), benzo(a)pyrene(B(a)P) 은 Sigma(St.
- 세포주 및 세포배양: 본 실험에 사용한 세포주는 암세포로 사람의 간암세포 HepG2(hepatoma cell, human)와 결장암세포 HT29(colon carcinoma cell, human) cell을 사용하였다. 그리고 사람의 정상 간세포인 Chang cell을 사용하였다.
데이터처리
- 대조군과 각 시료에 대한 실험 결과는 SAS program을 이용하여 Duncan's multiple range test로 분석하였다.
이론/모형
- Cytotoxicity 측정: 동물세포에 대한 시료의 cytotoxicity를 측정하기 위하여 Green 등(1刀의 방법에 따라 MTT assay를 실시하였다. 먼저 배양된 세포에서 배지를 제거한 다음 PBS를 첨가하여 가볍게 섞은 후 PBS를 다시 제거하고 0.
- Maron과 Ames(16)의 방법에 의해 실험하였다. 즉, 미리 멸균시 킨 capped tube에 시료 50 UL, 돌연변이 원 50 iiL, S9 mix 500 11L(직접변이원의 경우, 0.
- 37℃에서 48시간 배양한 후 배지 위의 복귀변이주(revertant)의 콜로니 수를 계수하였다. 체내 대사 활성 체계인 microsomal fraction 즉 S9 mixture 제조는 Maron과 Ames(16)의 방법으로 제조하였다. 한 시료에 대하여 3개의 최소평판배지를 사용하였으며, 변이원에 대한 억제효과는 변이원 물질의 활성에 대한 시료의 억제율(inhibition %)로 나타내었다.
성능/효과
- 또한 헛개나무 잎 분획물들의 암세포 성장 억제효과를 실험한 결과, 헥산, 클로르포름 분획물은 높은 암세포 성장 저해효과를 나타내었으며 시료농도에 비례하여 저해율이 증가하였다. HepG2에 대해 시료 농도 100 ug/mL 첨가 시 74%, 84%의 각각 높은 저 해 효과를 보였으며 또한 HT29에 대해서도 78%, 91%의 높은 저해 효과를 나타내었다(Table 6, 7). 그러나 부탄올과 물 분획물은 HepG2와 HT29에 대해 암세포 증식 억제 효과가 관찰되지 않았다.
- 또한 B(a)P에 대해서는 TA98과 TA100 균주 모두에서 비슷한 억 제 활성을 나타내 었으며 분획 물의 첨 가농도가 증가할수록 억제효과도 증가하였다. TA98 균주에서는 헥산, 클로르포름, 부탄올 분획물을 10% 농도로 첨가 시 각각 90%, 96%, 76%의 강한 저해효과를 나타내었으며 TA100 균주에서도각각 79%, 87%, 71%의 강한 억 제효과를 나타내었다. 그리고 물 분획 물은 TA98과 TA100에서 시료를 10% 농도로 첨가 시 각각 46%, 34%의 보다 낮은 저해효과를 나타내어 MNNG에서와 마찬가지로 B(a)P을 돌연변이 유발물질로 사용하였을 경우에도 비슷한 경향을 나타내었다(Table 4).
- 이상에서 알수 있듯이 헛개나무 잎 메탄올 추출물 및 분획물들은 직 .간접 변이원에 대하여 비슷한 억제효과를 나타내었으며 그중에서도 메탄올 추출물로부터 분획한 헥산, 클로르포름, 부탄올이 높은 억제 활성을 보였으나 물 분획물에서도 효과가 나타났으므로 헛개나무 잎의 활성물질은 한 성분이 아니라여러 활성 물질이 존재하여 작용한 것으로 사료된다. 이러한 결과는 이들 추출물에 함유된 성분들이 세포 내에서 변이원에 의한 DNA의 손상을 억제함으로써 생체 암 발생과정 중발암 초기단계의 억 제 인자로 작용할 가능성을 나타내 주고 있다.
- 살펴보았다. 그 결과 Fig. 1에서와 같이 시료와 농도에 관계없이 14% 이하의 낮은 세포독성을 나타냈으며 특히, 시료농도 100 ug/mL 첨가 시 Chang 세포에 대해서는 헛개나무 잎 추출물 및 분획물의 처리에 따른 세포 증식 저해효과가 나타나지 않았다. 따라서 헛개나무 잎 메탄올 추출물 및 분획물들이 사람의 간암세포 HepG2와 결장암 세포 HT29 성장에 미치는 영향을 검토하였다.
- 따라서 헛개나무 잎 메탄올 추출물 및 분획물들이 사람의 간암세포 HepG2와 결장암 세포 HT29 성장에 미치는 영향을 검토하였다. 그 결과 Table 5에서와 같이 헛개나무 잎의 메탄올 추출물은 두 암세포에 대한 저 해효과가 높았으며 이 같은 효과는 첨가되는 추출물의 농도에 비례하면서 증가하였다. 간암세포 HepG2의 경우 시료농도 1 pg/mL, 10 pg/mL, 50 iig/mL 및 100 ug/mL 농도에 대해 각각 37%, 57%, 61% 및 76%의 성장 저해효과를 나타내었으며 또한 결장암 세포 HT29에 대해서도 시료농도 1 Iig/mL, 10 pg/mL, 50 iig/mL 및 100 ug/mL 농도에 대해 각각 37%, 56%, 67% 및 80%의 저해 효과를 나타내었다.
- 항돌연변이 효과를 관찰하였다. 그 결과 이들 분획물들은 MNNG의 돌연변이를 억제시켰으며 특히, 시료농도 10% 첨가 시 헥산, 클로르포름, 부탄올 분획물은 각각.77%, 81%, 71%의 높은 돌연변이 억제효과를 나타내었으나 물 분획물은 29%의 낮은 저해효과를 나타내었다(Table 3). 또한 B(a)P에 대해서는 TA98과 TA100 균주 모두에서 비슷한 억 제 활성을 나타내 었으며 분획 물의 첨 가농도가 증가할수록 억제효과도 증가하였다.
- Typhimurium TA100 균주에서 MNNG에 대한 항돌연변이 효과를 검토하였다. 그 결과, Table 1에서와 같이 메탄올 추출물 2.5%, 5% 및 10%의 시료 농도에서 각각 75%, 82% 및 83%의 높은 저해효과를 나타내었으며 농도를 증가시켜도 농도 의존적인 항돌연변이원성은 크게 나타나지 않았다. 이러한 결과는 참취 뿌리 에탄올 추출물이 MNNG에 대해 시료농도 증가에 따른 변화가 거의 없다는 보고와, 유사한 경향을 나타내었다(19).
- 또한 메탄올 추출물에서 분리한 분획물들도 유의성 있는 돌연변이 억제효과를 나타내었으며 특히 헥산, 클로르포름, 부탄올 분획물의 경우는 물 분획물보다 MNNG와 B(a)P에 대해서 더 큰 항돌연변이 효과를 나타내었다. 그리고 헛개나무 잎의 메탄올 추출물과 그 분획물들의 사람의 암세포주인 HT29와 HepG2에 대한 성장 저해 효과를 MTT assay로 검토한 결과 헛개나무 잎의 메탄올 추출물과 헥산, 클로로포름 분획물들이 높은 암세포 성장 저해효과를 나타내었으며 농도 의존적 인 경향을 보였다. 그러나 사람의 정상 간세포인 Chang cell에서는 세포독성이 나타나지 않았다.
- 있다(20). 따라서 헛개나무 잎의 B(a)P에 대한 항돌연변이 원성을 S. Typhimurium TA98과 TA100에 대하여 검토한 결과, 두 균주 모두에서 비슷한 억제활성을 나타내었으며 툭히, 10%의 시료 농도에서 TA98의 경우는 92%, TA100의 경우는 90%의 높은 저 해효과를 나타내 었다(Table 2). 이와 같이 헛개나무 잎 메탄올 추출물은 직접 및 간접 변이원에 대해 높은 항돌연변이 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
- 77%, 81%, 71%의 높은 돌연변이 억제효과를 나타내었으나 물 분획물은 29%의 낮은 저해효과를 나타내었다(Table 3). 또한 B(a)P에 대해서는 TA98과 TA100 균주 모두에서 비슷한 억 제 활성을 나타내 었으며 분획 물의 첨 가농도가 증가할수록 억제효과도 증가하였다. TA98 균주에서는 헥산, 클로르포름, 부탄올 분획물을 10% 농도로 첨가 시 각각 90%, 96%, 76%의 강한 저해효과를 나타내었으며 TA100 균주에서도각각 79%, 87%, 71%의 강한 억 제효과를 나타내었다.
- 헛개나무 잎의 돌연변이 억제 효과를 Ames test로 검색한 결과, 헛개나무 잎의 메탄올 추출물과 분획물 그 자체의 돌연변이 원성은 없었으며, 헛개나무 잎의 메탄올 추출물은 직접 변이 원인 N-methyl-N' -nitro-N-nitrosc广guanidine(MNNG) 와 간접변이원인 benzo(a)pyrene(B(a)P)의 돌연변이 유발성을 크게 저해하였다. 또한 메탄올 추출물에서 분리한 분획물들도 유의성 있는 돌연변이 억제효과를 나타내었으며 특히 헥산, 클로르포름, 부탄올 분획물의 경우는 물 분획물보다 MNNG와 B(a)P에 대해서 더 큰 항돌연변이 효과를 나타내었다. 그리고 헛개나무 잎의 메탄올 추출물과 그 분획물들의 사람의 암세포주인 HT29와 HepG2에 대한 성장 저해 효과를 MTT assay로 검토한 결과 헛개나무 잎의 메탄올 추출물과 헥산, 클로로포름 분획물들이 높은 암세포 성장 저해효과를 나타내었으며 농도 의존적 인 경향을 보였다.
- 간암세포 HepG2의 경우 시료농도 1 pg/mL, 10 pg/mL, 50 iig/mL 및 100 ug/mL 농도에 대해 각각 37%, 57%, 61% 및 76%의 성장 저해효과를 나타내었으며 또한 결장암 세포 HT29에 대해서도 시료농도 1 Iig/mL, 10 pg/mL, 50 iig/mL 및 100 ug/mL 농도에 대해 각각 37%, 56%, 67% 및 80%의 저해 효과를 나타내었다. 또한 헛개나무 잎 분획물들의 암세포 성장 억제효과를 실험한 결과, 헥산, 클로르포름 분획물은 높은 암세포 성장 저해효과를 나타내었으며 시료농도에 비례하여 저해율이 증가하였다. HepG2에 대해 시료 농도 100 ug/mL 첨가 시 74%, 84%의 각각 높은 저 해 효과를 보였으며 또한 HT29에 대해서도 78%, 91%의 높은 저해 효과를 나타내었다(Table 6, 7).
- 간접 변이원에 대하여 비슷한 억제효과를 나타내었으며 그중에서도 메탄올 추출물로부터 분획한 헥산, 클로르포름, 부탄올이 높은 억제 활성을 보였으나 물 분획물에서도 효과가 나타났으므로 헛개나무 잎의 활성물질은 한 성분이 아니라여러 활성 물질이 존재하여 작용한 것으로 사료된다. 이러한 결과는 이들 추출물에 함유된 성분들이 세포 내에서 변이원에 의한 DNA의 손상을 억제함으로써 생체 암 발생과정 중발암 초기단계의 억 제 인자로 작용할 가능성을 나타내 주고 있다.
- 그러나 사람의 정상 간세포인 Chang cell에서는 세포독성이 나타나지 않았다. 이상의 실험 결과로 헛개나무 잎은 발암물질로부터 생체를 보호하는 물질을 함유하고 있을 것으로 사료된다.
- Typhimurium TA98과 TA100에 대하여 검토한 결과, 두 균주 모두에서 비슷한 억제활성을 나타내었으며 툭히, 10%의 시료 농도에서 TA98의 경우는 92%, TA100의 경우는 90%의 높은 저 해효과를 나타내 었다(Table 2). 이와 같이 헛개나무 잎 메탄올 추출물은 직접 및 간접 변이원에 대해 높은 항돌연변이 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
- 헛개나무 잎 추출물과 그 분획물 자체가 돌연변이원 유발성을 나타내는지 또는 균주들에■대해 독성을 나타내는지를 확인하기 위하여 Ames test로 검토해 본 결과 자료로는 나타내지 않았지만, 시료농도의 증가에 따른 his+ revertant colony 수의 증감이 없는 것으로 보아 본 실험에 사용한 추출물의 농도에서 시료 자체에 의한 돌연변이원성은 없는 것으로 나타났다. 따라서 헛개나무 잎 추출물의 돌연변이 억제작용을 검토하기 위하여 직 .
- 헛개나무 잎의 돌연변이 억제 효과를 Ames test로 검색한 결과, 헛개나무 잎의 메탄올 추출물과 분획물 그 자체의 돌연변이 원성은 없었으며, 헛개나무 잎의 메탄올 추출물은 직접 변이 원인 N-methyl-N' -nitro-N-nitrosc广guanidine(MNNG) 와 간접변이원인 benzo(a)pyrene(B(a)P)의 돌연변이 유발성을 크게 저해하였다. 또한 메탄올 추출물에서 분리한 분획물들도 유의성 있는 돌연변이 억제효과를 나타내었으며 특히 헥산, 클로르포름, 부탄올 분획물의 경우는 물 분획물보다 MNNG와 B(a)P에 대해서 더 큰 항돌연변이 효과를 나타내었다.
후속연구
- 이는 감잎의 암세포 증식억제효과가 헥산, 클로르포름 및 에틸아세테이트에 잘 용해되는 지용성 성분들에 의한 작용이라는 보고(22)도 있으며 또한 마늘의 항돌연변이 및 항암 연구에서 지용성 획분들이 효과를 나타내며 methyl linoleate를 그 주요 성분으로 보고한 바 있다(23). 이상의 결과에서 헛개나무 잎의 메탄올 추출물 및 헥산, 클로르포름 분획물은 사람의 암세포주인 HepG2 와 HT29세포의 증식을 억제하거나 세포 독성효과를 나타내어 세 王수가 감소된 것으로 사료되며 또한 헛개나무 잎의 항암 활성 성분은 주로 지용성이라고 생각되며 추후 이들 획분에서 활성물질의 분리 및 동정 등 지속적인 연구가 필요하리라 사료된다.
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