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제안 방법
- 시간의존시험에서는 간세포 배양 4시간 후에 배지를 교환한 다음, 2.5%의 에탄올과 1.0 mg/mZ 농도의 부위별 물추출물 시료를 간세포 배양계에 처리한 후, 4, 8, 16 및 2"간 동안 배양하였다. 이때 배양액으로 유출된 LDH 활성도를 측정하여 헛개나무 부위별 물추출물의 간보호 효과를 시간의존성 여부 측면에서 검토한 결과를 Fig.
- 상층액을 버리고 다시 관류용액으로 2번 반복하여 세척하였다. 0.4% trypan blue를 이용하여 세포 생존도를 확인한 후 cell counter(Coulter Inc, USA)로 세포수가 1.0X 10& 세포/m/이 되도록 배양용 액체배지 flhble II)로 조정하였다. Collagen을 미리 처리한 60X15 mm 플라스틱 Petri dish에 3i血의 간세포현탁액을 넣어 37℃에서 95% 산소와 5% 이산화탄소의 혼합가스를 포함하는 배양기(Sanyo, Japan)에서 배양하였으며, 4시간 후 새로운 배지로 교환하였다.
- Sprague-Dawley계 랫드에서 분리한 일차배양 간세포 시험 계에서 헛개나무 열매, 종자, 잎 및 줄기의 물추출물의 간독성 보호 작용을 시험하기 위하여 에탄올을 간독성 유발 모델물질로 사용하여 용량-반응 및 시간의존적 경향의 여부를 확인하였다. 간독성 지표로는 간세포질 효소 중 하나인 LDH가 독성물질에 의한 간세포막 손상의 결과로서 배양액 내로 유출되는 정도를 측정하였다.
- 일반적。로 in 勿孙에서 암세포주를 이용한 세포배양시험에서는 효소의 발현이 정상 세포와는 다르게 나타나는데, 일차배양 세포시험의 경우는 정상 동물에서 분리한 조직세포를 배양하게 되므로 in vivo 상태에서와 유사한 결과를 확인할 수 있다는 장점을 갖고 있는 것으로 알려져 있다.m 본 연구는 전통적界 민간에서 숙취해소, 알코올중독 등의 용도로 사용되어 온 헛개나무를 이용하여 기능성식품이나 알코올성 간질환 예방 및 치료제로서의 유용성을 실험적 간독성 모델을 이용하여 확인하였다. 방법적으로는 에탄올로 유발시킨 간독성에 대한 헛개나무 물추출액의 보호효과를 정상 랫드의 일차배양 간세포로부터 배양액 중으로 유리된 lactate dehydrogenase (LDH) 활성도를 비교, 측정하여 용량-반응 및 시간의존적인 간보호 효과를 확인하였다.
- 1 m/을 첨가, 잘 혼합한 다음다시 37℃에서 30분간 반응시켰다. 각각의 vial에 1.01血의 color reagent를 넣어 실온에서 20분간 방치한 후, 10做의 0.4N NaOH 용액을 첨가하여 525nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 간독성 지표로는 간세포질 효소 중 하나인 LDH가 독성물질에 의한 간세포막 손상의 결과로서 배양액 내로 유출되는 정도를 측정하였다.
- 랫드에 pentobarbital sodium(100 n回kg/2 mZ)을 복강 주사하여 마취시킨 후 복부 정중선을 절개하였다. 간문맥을 통해 관류용액(Table I)을 주입하면서 즉시 하대정맥을 절단하여 간으로부터 혈액을 제거하였다. 약 100 mZ의 관류용액을 통과시킨 후하대 정맥을 실로 묶었다.
- 간세포 배양 시작 4시간 후에 배지를 교환하고 2.5% 에탄올과 0.1, 0.5 및 LOmg/mZ의 헛개나무 부위별 물추출액을 24시간 동안 처리하였다.
- 랫드에 pentobarbital sodium(100 n回kg/2 mZ)을 복강 주사하여 마취시킨 후 복부 정중선을 절개하였다. 간문맥을 통해 관류용액(Table I)을 주입하면서 즉시 하대정맥을 절단하여 간으로부터 혈액을 제거하였다.
- m 본 연구는 전통적界 민간에서 숙취해소, 알코올중독 등의 용도로 사용되어 온 헛개나무를 이용하여 기능성식품이나 알코올성 간질환 예방 및 치료제로서의 유용성을 실험적 간독성 모델을 이용하여 확인하였다. 방법적으로는 에탄올로 유발시킨 간독성에 대한 헛개나무 물추출액의 보호효과를 정상 랫드의 일차배양 간세포로부터 배양액 중으로 유리된 lactate dehydrogenase (LDH) 활성도를 비교, 측정하여 용량-반응 및 시간의존적인 간보호 효과를 확인하였다.
- 5%로 선택, 사용하였다(예비시험의 결과는 나타내지 않음). 부위별 헛개나무 물추출물의 처리 방법으로, 용량-반응시험에서는 0.1, 0.5 및 LOmg/nH의 농도로 간세포 배양계에 처리한 후, 24 시간 동안 배양하였으며, 시간의존시험에서는 1.0mg/mZ 농도의 시료를 간세포 배양계에 처리한 후, 4, 8, 16 및 24시간 동안 배양하였다. 시험의 결과는 부위별 헛개나무 물추출물 시료 및 에탄올을 처리한 시간을 배양 0시간으로 간주하여 표현하였다.
- 0mg/mZ 농도의 시료를 간세포 배양계에 처리한 후, 4, 8, 16 및 24시간 동안 배양하였다. 시험의 결과는 부위별 헛개나무 물추출물 시료 및 에탄올을 처리한 시간을 배양 0시간으로 간주하여 표현하였다. 시험물 질의농도는 예비실험의 결과와 이전의 보고에 준하여 선정하였다.
- 후 3회 여과하였다. 이 여과액을 감압농축기(Buchi, Switzerland)를 이용하여 농축, 동결건조(MAXI-Dry Lyo, Germany) 시켜 각각 26g, 8g, 9g 및 8.5g의 시료를 얻었다. 획득한 부위별 물추출물은 시험직전에 증류수에 용해 시켜 여과 및 멸균과정을 거친 후 시료로 사용하였다(Scheme 1).
- 몇몇 예로서, 주독에 의한 숙취제거, 갈증 해소, 대소변 불통의 치료, 8)에탄올에 의해서 유발되는 근육이완 억제 효과°)및 에탄올의 체내 대사촉진과 간보호 효과炒 등이 있는 것으로 보고되었다. 이러한 연구들은 주로 in vivo 에서 실험동물을 대상으로 수행되었으나, 본 연구에서는 일차배양간세포를 시험계로 이용하였다. 일반적。로 in 勿孙에서 암세포주를 이용한 세포배양시험에서는 효소의 발현이 정상 세포와는 다르게 나타나는데, 일차배양 세포시험의 경우는 정상 동물에서 분리한 조직세포를 배양하게 되므로 in vivo 상태에서와 유사한 결과를 확인할 수 있다는 장점을 갖고 있는 것으로 알려져 있다.
- 일련의 예비시험을 통해 in vitro 간세포 배양계에 2.5%의 에탄올을 처리할 때 간독성 지표인 LDH의 유출이 유의성 있게 관찰되었으므로 본시험에서는 간독성 유발을 위해 에탄올의 농도를 2.5%로 선택, 사용하였다(예비시험의 결과는 나타내지 않음). 부위별 헛개나무 물추출물의 처리 방법으로, 용량-반응시험에서는 0.
- 되었을 때 간세포 분리시험에 사용하였다. 일반 고형사료와 상수도수를 자유롭게 섭취하도록 하였고, 사육환경은 23±3℃의 온도와 40~60%의 습도에서 12시간씩 명암주기를 조절하여 관리하였다. 모든 동물의 사육 및 관리는 미국 독성학회에서 권장하고 있는 실험동물관리지침 (Guiding Principles in the Use of Animals in Ibxicology)에 준하였다.
- 재순환이 시작된 후 관류용액에 0.05-0.06% 농도의 collagenase 용액을 관류병에 첨가하여 간이 팽창될 때까지 15~20분 동안관류시켰다. 팽창된 간을 적출하여 100 mZ의 관류용액이 담긴 비이커에 넣고 수술용 가위로 잘게 자른 후, 약 250 μm 나일론 천을 통과시켜 얻은 단일세포액을 50Xg에서 4분간 원심분리시켰다.
대상 데이터
- Collagenase, dimethyl sulfoxide(DMSO) 및 pentobarbital sodiume Sigma Chemica品사(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하여 사용하였고, Waymouth's MB 752/1 powdered medium, insulin, sodium bicarbonate, sodium oleic acid, gentamycin sulfate, L-serine, L-alanine, L-asparagine, sodium linoleic acid, 5-aminolevulinic acid, a-tocopherol, hydrocortisone, D-thyroxine, estradiol, testosterone 및 glucagone GIBCO사(Grand Island, NY, USA)로부터 구입하여 사용하였다. 기타 시약은 특급尝 구입, 사용하였다.
- Ethanole Merck사(Merck, Germany)로 부터 구입하여 사용하였다. Collagenase, dimethyl sulfoxide(DMSO) 및 pentobarbital sodiume Sigma Chemica品사(St.
- 동물은 4주령의 Sprague-Dawley계 웅성 랫드를 바이오제노믹스(서울, 한국)로부터 구입하여 14일 동안 순화시킨 후 체중이 200~250g 되었을 때 간세포 분리시험에 사용하였다. 일반 고형사료와 상수도수를 자유롭게 섭취하도록 하였고, 사육환경은 23±3℃의 온도와 40~60%의 습도에서 12시간씩 명암주기를 조절하여 관리하였다.
- 본 시험에 사용된 헛개나무 열매, 종자, 잎 및 줄기는 경기도 양평군 두메지구 수목원에서 구입하였으며, 건조된 열매(200g) 와 종자(100 g)는 분쇄하였고 잎과 줄기(각각 100 g)는 잘게 썰어 열매의 경우는 증류수 1000 m/를, 나머지 부위는 증류수 500 m/씩을 넣고 환류 냉각기를 이용하여 80℃에서 24시간 동안 추출한 후 3회 여과하였다. 이 여과액을 감압농축기(Buchi, Switzerland)를 이용하여 농축, 동결건조(MAXI-Dry Lyo, Germany) 시켜 각각 26g, 8g, 9g 및 8.
데이터처리
- 모든 시험결과는 평균土표준오차로 표시하였으며, 대조군에 대한 유의성 여부는 Dunnett의 t-test를 이용하여 검정하였다.
이론/모형
- LDH 효소 활성도는 Sigma사 또는 아산제약(안산, 한국)에서 구입한 kit를 이용하여 함께 제공된 시험방법에 준하여 측정하였다. Pyruvate 기질 1.
- 간세포는 Berry와 Friend의 방법'%에 따라 두 단계로 분리하였다. 랫드에 pentobarbital sodium(100 n回kg/2 mZ)을 복강 주사하여 마취시킨 후 복부 정중선을 절개하였다.
- 일반 고형사료와 상수도수를 자유롭게 섭취하도록 하였고, 사육환경은 23±3℃의 온도와 40~60%의 습도에서 12시간씩 명암주기를 조절하여 관리하였다. 모든 동물의 사육 및 관리는 미국 독성학회에서 권장하고 있는 실험동물관리지침 (Guiding Principles in the Use of Animals in Ibxicology)에 준하였다.
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