[논문]아밀로이드 베타에 의한 뇌세포 손상 저해활성을 갖는 금앵자 추출물

신동훈

문제 정의

Aβ에의 한 ROS, free radical 등의 생성은 Ap-induced free radical-mediated neurotoxicity의 주정을 가능하게 하기 때문에 이들에 대한 연구는 필수적이라 할 수 있다. 그러므로 고유의 식용식물 자원으로부터 AP-induced 뇌신경 독성 저해 미량소재를 검색하고 이를 소재화 시키고자 하였다.
본 연구는 뇌세포 불활성화 및 뇌 신경 세포의 괴사로 인하여 기인되는 Alzheimer's disease (AD)의 예방 및 치료용 신소재의 개발에 그 목적을 두고 있다. 뇌신경의 불활성화와 괴사는 amyloid precursor protein (APP) 의 비정상 적대 사산 물인 amyloid beta peptide (A{3)에 의한 cytotoxicity로 생각되어지고 있다.
1, 2). 이에 금앵자로부터 추출된 뇌신경세포 보호 활성을 갖는 물질의 연구를 실시하게 되었다.
추출물의 활성 성분이 무엇인지 확인하기 위하여 활성 물질의 추출 및 정제를 실시하였다. 먼저 추출물로부터 methanol을 완전히 제거한 후 hexane, chloroform, ethyl acetate를 각각 3버]] 부피로 환류 추출하여 1차적인 물질 분리를 실시하였다.

제안 방법

9). NMR과 EI-MS 결과 활성 물질은 분자량 418 nn/z의 1, 2-benzenedicarboxylic acid, dinonyl ester로 추정하였다.
저해 활성이 높게 나온 부분을 가지고 open silica gel column chromatography (CHCk : MeOH)을 시행하여 11 개의 소분획 (CHCh : MeOH = 100:0, 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 3070, 20:80, 10:90, 0100)으로 분획하였다. 각각의 분획을 A0-induced oxidative stress 저해 활성을 측정하여 그 중 저해 활성이 높은 CHCh : MeOH = 80:20 획분을 선정하여 분리하였다 (Fig. 7). 선정된 획분을 preparative silica-gel plate (glass, 100 x 200 mm)를 사용하여 thin layer chromatography (TLCX 실시하였다.
금앵자를 hand mixer로 곱게 마쇄한 후 2 kg 의 금앵자 조말을 methanol 5배 부피로 5회 추출한 후 감압 농축하여 금앵자 methanol 추출물을 조제하였다. 조제된 금앵자 추출물의 활성을 확인하기 위해 in vivo behavioral test를 실시 하였다.
먼저 추출물로부터 methanol을 완전히 제거한 후 hexane, chloroform, ethyl acetate를 각각 3버]] 부피로 환류 추출하여 1차적인 물질 분리를 실시하였다. 추출된 crude methanolic extract는 극성도에 따라 solvent partitioning 을 실시하여 oxidative stress 저해 활성을 확인한 결과 두번째 chloro- form층에서 저해 활성이 높게 나타남을 확인하였다(Fig.
8). 분리된 활성 band를 Waters 2690 HPLC 와 Waters p-bondapack Cis revers phase (3.9 x 300 mm) column을 사용하여 활성 물질을 분리하였다(Fig. 9). NMR과 EI-MS 결과 활성 물질은 분자량 418 nn/z의 1, 2-benzenedicarboxylic acid, dinonyl ester로 추정하였다.
선정된 획분을 preparative silica-gel plate (glass, 100 x 200 mm)를 사용하여 thin layer chromatography (TLCX 실시하였다. 선정 획분을 3 X 105 mg/ml 농도로 methanol에 녹인 후 0.5 成씩 4회 spotting하여 건조시킨 후 chloroform과 methanol (80-20, v/v)으로 전개시킨 후 저해 활성을 측정하여 band를 분리하였다 (Fig. 8). 분리된 활성 band를 Waters 2690 HPLC 와 Waters p-bondapack Cis revers phase (3.
7). 선정된 획분을 preparative silica-gel plate (glass, 100 x 200 mm)를 사용하여 thin layer chromatography (TLCX 실시하였다. 선정 획분을 3 X 105 mg/ml 농도로 methanol에 녹인 후 0.
금앵자는 동의에서 꽃받침과 열매를 강장, 수렴, 지사, 유정, 유뇨, 빈뇨, 만성장염, 설사 등에 사용되어 왔다. 이는 뇌 신호세포 보호 효과에 대해서는 전혀 알려져 있지 않았으나 본 연구에서 A0에 의한 뇌세포 손상 저해 활성을 확인하였으며 추출물에서 유효성분인 1, 2- 벤젠다이카르복실산 다이노닐에스터 (1, 2-benzenedicarboxylic add, dinonyl ester)를 분리 . 정제 하였다.
6). 저해 활성이 높게 나온 부분을 가지고 open silica gel column chromatography (CHCk : MeOH)을 시행하여 11 개의 소분획 (CHCh : MeOH = 100:0, 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 3070, 20:80, 10:90, 0100)으로 분획하였다. 각각의 분획을 A0-induced oxidative stress 저해 활성을 측정하여 그 중 저해 활성이 높은 CHCh : MeOH = 80:20 획분을 선정하여 분리하였다 (Fig.
조제하였다. 조제된 금앵자 추출물의 활성을 확인하기 위해 in vivo behavioral test를 실시 하였다. ICR-male mice는 feed와 금앵자 추출물을 약 3주간 ad 瓦)의 상태로 공급하였다.
ICR-male mice는 feed와 금앵자 추출물을 약 3주간 ad 瓦)의 상태로 공급하였다. 치매 유발성 물질로는 A&를 ICV (intracerebroventricular) injection하여, Y-maze test와 passive avoidance test를 실시하였다(Scheme 3).

대상 데이터

The data were collected over the range 200 ~800 nm and detection was performed at 317.6 nm. A significant single peak was measured at 35 min.

성능/효과

Passive avoidance test를 실시한 결과 Aβ를주사하지 않은 control groupe Aβgroup에 비해서 약 120 sec 정도의 안정된 기억학습능력을 나타내 었고, 400 sample 투여 groupe Aβ의 기억학습능력 저해를 극복시키거나 보완.예방하지 못하였다.
Y-maze test를 실시한 결과 A0를 주사하지 않은 control groupe Aβ를 주사한 group에 비해 서약 15% 이상의 안정된 brain 활성을 나타내었고 400, 800, 1200 ㎎/㎏ 의 sample 투여 groups는 control group의 brain 활성과 비교할 때 거의 같거나 오히려 더 높은 활성을 보였다 이는 금앵자 sample (Rosa laevigata)0] Aβ의 효과를 blocking 하여 거의 control 수준의 brain 활성으로 회복시키거나 오히려 인지능력의 향상을 가져왔음을 의미한다(Fig. 3). 그리고 Aβ가 신체적인 운동기능의 저하가 아닌 기억학습능력의 저해만을 초래하는 것을 확인하기위해 총 arm 통과횟수를 계산한 결과 group간의 차이는 없었다(Fig.
3). 그리고 Aβ가 신체적인 운동기능의 저하가 아닌 기억학습능력의 저해만을 초래하는 것을 확인하기위해 총 arm 통과횟수를 계산한 결과 group간의 차이는 없었다(Fig. 4).
먼저 추출물로부터 methanol을 완전히 제거한 후 hexane, chloroform, ethyl acetate를 각각 3버]] 부피로 환류 추출하여 1차적인 물질 분리를 실시하였다. 추출된 crude methanolic extract는 극성도에 따라 solvent partitioning 을 실시하여 oxidative stress 저해 활성을 확인한 결과 두번째 chloro- form층에서 저해 활성이 높게 나타남을 확인하였다(Fig. 6). 저해 활성이 높게 나온 부분을 가지고 open silica gel column chromatography (CHCk : MeOH)을 시행하여 11 개의 소분획 (CHCh : MeOH = 100:0, 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 3070, 20:80, 10:90, 0100)으로 분획하였다.
이는 금앵자CRqsq laevigata) sample이 Aβ의 기억학습능력 저해 효과 (인지능력과 학습능력의 상실유도)를 blocking하여 control group0] 보여주는 인지 능력을 나타내줌으로써 뇌세포 신호전달을 정상적으로 보호.회복시켜줌을 확인하였다(Fig. 5).

후속연구

이는 고령화 사회로 먼저 진입한 구미 선진국이 치매에 대한 연구 및 치료제 개발을 활발히 하고 있다는 사실을 미루어 짐작할 수 있게 한다. 이러한 점은 외국 제품들이 국내 치매 치료제 시 장을 장악하고 있고, 특허 출원 역시 외국에 편중되어 있다는 상황을 보여준다 하지만 천연물을 활용하는 치료약물 개발에 있어서는 외국 선진기술에 비해 국내 연구진이 충분한 우수성을 가진 분야로 판단됨에 따라 이 분야에 대한 기술 개발에 관심과 활발한 연구가 필요하다고 생각된다.

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