Cinnamomi Cortex (Lauraceae), the dried bark of Cinnamomum cassia BLUME, has been used as traditional Chinese medicine for its stomachic, astringent, carminative, antispasmodic, antibacterial, antifungal properties. Four compounds were isolated from the MeOH extract of Cinnamomi Cortex, and their st...
Cinnamomi Cortex (Lauraceae), the dried bark of Cinnamomum cassia BLUME, has been used as traditional Chinese medicine for its stomachic, astringent, carminative, antispasmodic, antibacterial, antifungal properties. Four compounds were isolated from the MeOH extract of Cinnamomi Cortex, and their structures were identified as trans-cinnamic acid (1), ${\beta}-sitosterol$ (2), bis(2-methylheptyl)phthalate (3), coumarin (4) by comparison of their physical and spectral data with those reported in the literature. These compounds were tested melanogenesis inhibitory effect on B-16 mouse melanoma cell lines. Among them, trans-cinnamic acid (1) showed the most potent inhibitory effect on melanogenesis with $IC_{50}$ value of $13{\mu}g/ml$. Arbutin, positive control, exhibited an $IC_{50}$ value of $29{\mu}g/ml$.
Cinnamomi Cortex (Lauraceae), the dried bark of Cinnamomum cassia BLUME, has been used as traditional Chinese medicine for its stomachic, astringent, carminative, antispasmodic, antibacterial, antifungal properties. Four compounds were isolated from the MeOH extract of Cinnamomi Cortex, and their structures were identified as trans-cinnamic acid (1), ${\beta}-sitosterol$ (2), bis(2-methylheptyl)phthalate (3), coumarin (4) by comparison of their physical and spectral data with those reported in the literature. These compounds were tested melanogenesis inhibitory effect on B-16 mouse melanoma cell lines. Among them, trans-cinnamic acid (1) showed the most potent inhibitory effect on melanogenesis with $IC_{50}$ value of $13{\mu}g/ml$. Arbutin, positive control, exhibited an $IC_{50}$ value of $29{\mu}g/ml$.
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문제 정의
Mushroom tyrosinase에 의한 L-DOPA oxidation을 cinnamaldehyde, cinnamic acid 등이 경쟁적으로 저해하고, benzaldehyde, salicylic acid 등이 비경쟁적으로 저해활성을 나타내어 cinnamaldehyde, cinnamic acid가 antityrosinase activity를 가진다고 보고된 바가 있다.15,16) 본 연구에서는 계피에서 분리된 화합물에 대하여 B-16 mouse melanoma cell lines에서의 미백 활성 평가를 실시하였다. 계피에서 분리된 화합물 중에서 trans-cinnamic acid (1)가 B-16 mouse melanoma cell을 3 ug/ml에서는 3% inhibition을 나타내고, 10 ug/m에서는 43% inhibition, 30 ug/m에서는 97% inhibition을 나태내는 등 농도 의존적인 활성을 나타내었다.
계피의 화학성분을 규명하고 분리된 물질의 미백활성을 측정하기 위하여 본 실험을 실시하였다. 각종 크로마토그래피를 실시하여 물질을 분리한 결과 총 4종의 화합물을 분리, 구조를 규명하였으며, 각 화합물의 B-16 mouse melanoma cell lines에서의 미백활성을 측정하였다.
제안 방법
1. 피부 melanin 생합성을 저해하는 물질을 천연물로부터 개발하고자 계피의 MeOH추출물의 MC분획과 EtOAc분획으로부터 melanin 생성 억제 물질의 분리를 시도한 결과 총 4종의 화합물을 분리하였다.
2. 분리 된 4종의 화합물들은 각종 spectral data의 검토 결과 각각 trans-cinnamic acid (1), β-sitosterol (2), bis(2-methylheptyl)phthalate (3), coumarin (4)으로 결정하였다.
B-16 mouse melanoma cell lines에서의 미백 활성 평가 − B-16 mouse melanoma cell lines을 EMEM (10% fetal FCS) 배지를 사용하여 T-75 culture flask에서 confluence가 될 때가지 배양하여 Culture dish에 cell number가 1×106/dish 이상이 되도록 seeding 한 후 1일간 배양하였다.
계피의 화학성분을 규명하고 분리된 물질의 미백활성을 측정하기 위하여 본 실험을 실시하였다. 각종 크로마토그래피를 실시하여 물질을 분리한 결과 총 4종의 화합물을 분리, 구조를 규명하였으며, 각 화합물의 B-16 mouse melanoma cell lines에서의 미백활성을 측정하였다.
5 N perchloric acid로 2회 반복 추출하고 cold ethanol/ether (3:1)로 2회 반복 추출한 뒤 ethyl ether로 추출하여 건조시켰다. 그 건조물에 1 N NaOH 용액 1 ml을 첨가한 후 5분간 끓는 물에서 처리하여 멜라닌을 녹인 다음 405 nm에서 ELISA reader로 흡광도를 측정하여 control과 비교하였다.
8 L 채우고 hexane을 유출시켜 고정상을 균일한 상태로 만든 후 시료를 loading 하였다. 그 후 hexane에 대한 MC의 비율을 높여가는 기울기용리로 이 동상을 유출시켜 11개의 분획 (분획 6-5-1~6-5-11)을 얻었고, 그 중 분획 6-5-3에서 compound 4 (192 mg)를 정제하였다.
5 L 채우고, hexane을 유출시켜 고정상을 균일한 상태로 만든 후 시료를 loading 하였다. 그 후 hexane으로부터 ethylacetate의 비율을 높여가는 기울기용리로 이동상을 유출시켜 14개의 분획 (분획 1-1~1-14)을 얻었고, 그 중 분획 1-2에서 compound 3 (10 mg)을 정제하였다.
그리고 DEPT 90°, 135° NMR spectrum을 통해 각종 탄소 종의 수를 확인하였다.
기기 및 시약 − NMR spectrum은 Bruker ARX spectrometer (250 MHz)의 Bruker’s standard pulse program을 사용하였으며, 내부표준물질로는 tetramethylsilane (TMS)를 사용하였고, chemical shift value는 part per million (ppm) 단위로 나타내었다.
배지를 교환한 후 시험 물질을 첨가하고, IBMX (3-isobutyl-1-methylxanthine)를 100 µM이 되도록 첨가하여 2일간 더 배양한 뒤 생성된 멜라닌의 양을 정량하였다.
MeOH 추출물을 증류수에 현탁시키고 동량의 methylene chloride (MC)를 가하여, 분획깔때기로 MC층과 수층을 분획하는 조작을 3회 반복 실시한 후 감압 농축하여 551 g의 MC분획을 얻었다. 수층에 동량의 ethylacetate (EtOAc)를 가한 후 분획 깔때기로 수층과 EtOAc층을 분획하는 조작을 3회 반복 실시한 후 감압 농축하여 20 g의 EtOAc분획을 얻고, 나머지를 물분획 (53 g)으로 하였다.
따라서 melanocyte에 독성을 나타내지 않고 세포 내에서 melanin 생성을 효과적으로 억제할 수 있는 물질의 개발이 여전히 요구되고 있는 실정이다. 연구자는 B-16 mouse melanoma cell lines에서의 미백 활성 물질을 찾고자 계피로부터 활성물질을 분리하고 구조를 규명하였다.
그리고 DEPT 90°, 135° NMR spectrum을 통해 각종 탄소 종의 수를 확인하였다. 이 화합물은 bis(2-methylheptyl)phthalate으로 결론짓고 문헌14)에 소개된 spectral data와 비교하여 결정하였다.
그리고 DEPT 90°, 135° NMR spectrum을 통해 각종 탄소 종의 수를 확인하였다. 이 화합물의 spectral data를 문헌10)상의 1H-NMR 및 13C-NMR spectral data와 비교하여 coumarin으로 결정하였다.(Fig.
먼저 MC분획 (183 g)을 지름 9 cm인 column에 silica gel을 4L채우고, hexane을 유출시켜 고정상을 균일한 상태로 만든 후 시료를 loading하였다. 이동상으로는 hexane에 대한 acetone의 비율을 5% 단위로 증가시키는 기울기용리로 이동상을 유출시켜 17개의 분획 (분획 1~17)을 얻었다. 이 과정에서 분획 6을 MeOH로 재결정하여 compound 2 (160 mg)를 정제하였다.
그리고 DEPT 90°, 135° NMR spectrum을 통해 각종 탄소 종의 수를 확인하였다. 이상의 spectral data를 토대로 이 화합물을 trans-cinnamic acid로 추정하고, 문헌10,11)상의 spectral data와 비교하여 구조를 결정하였다.
이상의 내용을 바탕으로 문헌12,13)에 소개된 spectral data와 비교하여 β-sitosterol로 결정하였다.
대상 데이터
발색시약으로는 vanillin-sulfuric acid 시액, 1% FeCl3/ethanol 용액, anisaldehyde sulfuric acid 시액을 사용하였다. B-16 mouse melanoma cell lines에서의 멜라닌 생성을 평가하는 실험에 사용된 시약 및 기기는 0.5N hyperchloric acid, cold ethanol/ethyl ether (3:1), 1N NaOH solution, hemacytomether, microcentrifuge, UV/VIS spectrophotometer, B-16 mouse melanoma cell lines이다.
기기 및 시약 − NMR spectrum은 Bruker ARX spectrometer (250 MHz)의 Bruker’s standard pulse program을 사용하였으며, 내부표준물질로는 tetramethylsilane (TMS)를 사용하였고, chemical shift value는 part per million (ppm) 단위로 나타내었다. Fraction collector는 SF-160 (Advantec)을 사용하였다. 추출 및 column chromatography용 용매는 시약용 1급을 사용하였다.
추출 및 column chromatography용 용매는 시약용 1급을 사용하였다. TLC plate는 Kieselgel 60 F254 (Merck) 및 RP-18 (Whatman)을 사용하였다. Column chromatography용 고정상은 silicagel (70-230 mesh, Merck), Sephadex LH-20 (25-100 µ, Sigma), MCI-gel CHP-20P (75-150 µ, Mitsubishi Chem.
), RP-18 (40-63 µm, Merck) 등을 사용하였다. 발색시약으로는 vanillin-sulfuric acid 시액, 1% FeCl3/ethanol 용액, anisaldehyde sulfuric acid 시액을 사용하였다. B-16 mouse melanoma cell lines에서의 멜라닌 생성을 평가하는 실험에 사용된 시약 및 기기는 0.
본 연구에 참여한 오준석, 최은향, 김동춘은 BK21 연구사업단으로부터 장학금을 수여 받는 학생임.
실험재료 − 계피는 대구시내 약전 골목에서 구입하여 전문가의 확인을 거쳐 사용하였다.
성능/효과
13C-NMR spectrum 에서 δ 140.7, 121.7에서 C-5, 6의 이중결합을 관찰할 수 있었고 δ 71.8에서 down shift된 tertiary carbon이 관찰되고 δ 11.8과 δ 56.8 사이에서 aliphatic carbon signal이 관찰되어 phytosterol의 일종으로 추정할 수 있었다.
3. 분리된 각 화합물의 B-16 melanoma cell lines에서의 멜라닌 생성 저해 활성은 trans -cinnamic acid (1)만이 농도 의존적으로 멜라닌 생성을 저해하였으며. 1의 IC50 Value는 13 µg/ml로 positive control인 arbutin의 IC50 Value인 29 µg/ml보다 더 강한 활성을 나타내었다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
계피의 주요 성분에는 무엇이 있는가?
계피는 녹나무과(Lauraceae)의 식물로 계피나무 Cinnamomum cassia BLUME 또는 그 밖의 동속 근연 식물의 수피를 그대로 또는 주피를 다소 제거한 것을 약용으로 한다. 계피의 주성분은 정유인 계피유로 phenylpropanoid인 cinnamic aldehyde를 주성분으로 하여 cinnamyl acetate, phenylpropyl acetate, cinnamic acid, salicylaldehyde, anhydrocinnzeylanol 등을 포함한다. 또한 cinnzeylanine, cinnzeylanol, cinncassiol A, B, C1~3, D1~4, E, anhydrocinnzeylanine 등과 같은 diterpenoid 성분과 (-)-procyanidin B2, B5, C1, cinnamtannin A2~4 등과 같은 tannin 성분 등을 포함한다. 이들 성분의 주요 작용은 위장의 점막을 자극하여 점액분비를 왕성하게 하고, 위장의 경련성 통증을 억제하며, 위장관의 운동을 촉진하여 가스를 배출하고 흡수를 좋게 하기도 한다.
melanin의 부정적 기능은 무엇인가?
사람의 피부색을 결정하는데 가장 중요한 요인인 melanin은 동·식물계에 널리 존재하는 생체고분자물질로서 자외선을 흡수 또는 산란시켜 자외선으로부터 피부가 손상되는 것을 방지하여 피부의 광노화나 일광각화증을 억제하는 역할을 하는 긍정적인 기능2,3)을 가지는 반면, 미용적인 측면에서의 색소침착뿐만 아니라 멜라닌 전구물질 등에 의한 독성으로 인한 세포사멸 등 부정적인 기능4,5)도 가지고 있다.
계피의 성분 중 B-16 melanoma cell lines에서 멜라닌 생성 저해 활성을 나타내는 성분은 무엇인가?
3. 분리된 각 화합물의 B-16 melanoma cell lines에서의 멜라닌 생성 저해 활성은 trans -cinnamic acid (1)만이 농도 의존적으로 멜라닌 생성을 저해하였으며. 1의 IC50 Value는 13 µg/ml로 positive control인 arbutin의 IC50 Value인 29 µg/ml보다 더 강한 활성을 나타내었다.
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