[논문]결명자의 타크린으로 유발한 간 세포독성 보호 성분

변에리사; 정길생; 안인파; 리빈; 이동성; 고은경; 윤권하; 김윤철

결명자의 타크린으로 유발한 간 세포독성 보호 성분
Hepatoprotective compounds of Cassiae Semen on tacrine-induced cytotoxicity in Hep G2 cells 원문보기

생약학회지, v.38 no.4 = no.151, 2007년, pp.400 - 402

변에리사 (원광대학교 약학대학) , 정길생 (원광대학교 익산방사선연구센터) , 안인파 (연변대학교 약학대학) , 리빈 (원광대학교 약학대학) , 이동성 (원광대학교 약학대학) , 고은경 (원광대학교 약학대학) , 윤권하 (원광대학교 익산방사선연구센터) , 김윤철 (원광대학교 약학대학)

Abstract ▼ AI-Helper

Tacrine is an acetylcholinesterase inhibitor that is approved for the treatment of Alzheimer's disease. However, tacrine treatment for Alzheimer's disease results in reversible hepatotoxicity in 30-50% of patients, which seriously limits its clinical use. Accordingly, the identification of constituents in natural products that have protective effects on tacrine-induced hepatotoxicity would be valuable. In the present study, an immortalized human hepatoma cell line, HepG2 was employed to screen for agents that protect against tacrine-induced hepatotoxicity. The bioassay-guided fractionation of water extract of Cassiae Semen furnished two anthraquinones, aurantio-obtusin (1) and obtusifolin (2). Compounds 1 and 2 showed hepatoprotective effects with the protection ratio values of 55.3 +/- 0.5% and 41.2 +/- 0.8% at $160{\mu}M$, respectively.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

²⁾ 따라서, 천연물로부터 타크린의 간 독성을 감소시킬 수 있는 화합물을 발견하는 것은 중요하다고 생각된다. 본 연구에서는 타크린으로 독성을 유발한 사람 간암 세포 유래의 HepG2 세포주를 대상으로 천연물 유래 화합물이 세포생존율에 대한 증가 여부를 관찰하여 간 세포 보호활성을 평가하였다. HepG2 세포주는 많은 간 세포 기능을 가지고 있으며^,3) 타크린으로 유발한 흰쥐 초대 배양 간세포에 상응하는 결과를 가지는 것으로 보고되어 있다.
사용 중인 의약품 중 600종 이상이 급성 또는 만성 간 손상을 유발할 수 있다고 보고되어 있어^,1) 이 문제에 대한 심각성이 재인식되고 있다. 저자 등은 간 독성의 부작용을 가지는 의약품을 독성유발 물질로 사용하여 이에 대한 간 세포 보호활성 화합물을 천연물로부터 발견하고자 하였다.

제안 방법

36 g)를 감압농축하고 40% 수성 MeOH에 현탁한 후에 CH₂Cl₂, EtOAc를 이용하여 극성순으로 분획을 나누었다. CH₂Cl₂ 가용부(721 mg)를 H₂O-CH₂Cl₂-MeOH(4:3: 1) 혼합용매를 용출용매로 하는 Sephadex LH-20 column chromatography(CC)에 의하여 8개의 소분획(Fr. 1~8)으로 나누었다. Fr.
시약 및 기기 − Column chromatography용 담체는 Kiesel gel 60 (70~230 mesh, Merck), RP-18 Lichroprep (Merck), Sephadex LH-20 (Sigma)을 각각 사용하였다. NMR spectrum은 JEOL JNM-ECP 500 (¹H, 500 MHz; ¹³C, 125 MHz)을, ESI-MS는 API-2000 spectrometer를 사용하여 측정하였다. RPMI 1640 배지와 trypsin-ethylene diaminetetraacetic acid (EDTA)는 Gibco Laboratories사에서 구입하였으며, fetal bovine serum (FBS)는 Hyclone Laboratories 사에서 구입하였다.
이것을 n-BuOH (1 l×4회)로 액체분배법을 이용하여 n-BuOH 가용부와 증류수 가용부로 분획하였다. n-BuOH 가용부(11.36 g)를 감압농축하고 40% 수성 MeOH에 현탁한 후에 CH₂Cl₂, EtOAc를 이용하여 극성순으로 분획을 나누었다. CH₂Cl₂ 가용부(721 mg)를 H₂O-CH₂Cl₂-MeOH(4:3: 1) 혼합용매를 용출용매로 하는 Sephadex LH-20 column chromatography(CC)에 의하여 8개의 소분획(Fr.
간략하게 설명하면, HepG2 세포 (2×105 cells/well)를 10% heat-inactivated FBS, penicillin G (100 IU/ml)와 streptomycin (100 μg/ml)을 함유한 RPMI 1640배지에 분주하고 5% CO2 배양기 내에서 37°C에서 24시간 배양한 다음, 분리된 화합물 (1, 2)의 시료 용액 (5, 10, 20, 40, 80, 160 μM)과 1.2 mM tacrine을 처리한 후 2시간 동안 5% CO2 배양기 내에서 배양하였으며, 세포생존율은 MTT 법을 활용하여 측정하였으며, 양성대조약물로는 silybin을 사용하였다.
결명자의 물 추출물이 300 μg/ml 의 농도에서 유의한 보호효과 (보호율=53.2±0.8%)를 나타내어 함유 성분의 분리를 수행하였으며, CH2Cl2 가용부로부터 2종의 화합물을 분리 정제하였다.
또한, 모든 실험치는 대조군에 대한 세포보호 율을 mean±S.D.로 표시하였으며, 각각 3회 반복 실험치를 이용하여 계산하였다.
이것을 n-BuOH (1 l×4회)로 액체분배법을 이용하여 n-BuOH 가용부와 증류수 가용부로 분획하였다.
천연물로부터 간 세포 보호활성 물질의 탐색을 목적으로 결명자의 물 추출물을 각종 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 2종의 anthraquinone계 화합물을 분리하였으며, 각각의 구조를 aurantio-obtusin (1), obtusifolin (2)으로 동정하였다. 이 화합물들은 타크린으로 유발한 Hep G2 세포주에 대하여 유의한 보호활성을 나타냈다.
천연물로부터 간 세포 보호활성물질을 발견할 목적으로간 독성이 알려진 타크린을 사람 간암 세포 유래의 HepG2세포주에 처리한 후 세포생존율을 증가시키는 천연물 추출물을 검색하였다. 결명자의 물 추출물이 300 μg/ml 의 농도에서 유의한 보호효과 (보호율=53.
천연물로부터간 세포 보호활성 물질을 탐색하는 과정에서 결명자의 물 추출물이 타크린으로 유발한 HepG2 세포주 사멸에 대하여 300 μg/ml 의 농도에서 유의한 보호효과 (보호율=53.2±0.8%)를 나타냈기 때문에 함유 성분의 분리를 수행하여 얻어진 2종의 화합물에 대한 간 세포 보호활성을 검토하였다.
추출 및 정제 − 건조된 결명자(1.0 kg)을 증류수(5 l×2회)로 2시간 동안 가열추출하여 여과하고 여액을 감압농축하여 1 l로 하였다.
8%)를 나타내어 함유 성분의 분리를 수행하였으며, CH₂Cl₂ 가용부로부터 2종의 화합물을 분리 정제하였다. 화합물 1과 2의 구조는 문헌에 기재되어 있는 선광도, ¹H-NMR과 ¹³C-NMR의 data와 비교하여, 각각 aurantio-obtusin^,11) obtusifolin¹²⁾으로 동정하였다(Fig. 1). 분리된 2종의 화합물 모두가 유의한 간 세포 보호 활성을 보였고, 각각 실험된 농도에서 농도의존적인 세포보호효과를 보였으며, 또한 각각 160 μM 에서 대조군에 대한 55.

대상 데이터

Tacrine, silybin과 3'-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)는 Sigma사에서 구입하였다. 96-Well tissue culture plates와 기타 tissue culture dishes는 Nunc사 제품을 이용하였다.
Hep G2 세포배양 및 간세포 보호활성 측정 − 사람 간암 세포 유래 HepG2 세포주는 American Type Culture Collection에서 분양하여 사용하였으며, 타크린으로 독성을 유발한 세포주에 대한 보호활성 측정은 송 등의 방법10)에 따라 실시하였다.
NMR spectrum은 JEOL JNM-ECP 500 (¹H, 500 MHz; ¹³C, 125 MHz)을, ESI-MS는 API-2000 spectrometer를 사용하여 측정하였다. RPMI 1640 배지와 trypsin-ethylene diaminetetraacetic acid (EDTA)는 Gibco Laboratories사에서 구입하였으며, fetal bovine serum (FBS)는 Hyclone Laboratories 사에서 구입하였다. Tacrine, silybin과 3'-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)는 Sigma사에서 구입하였다.
Tacrine, silybin과 3'-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)는 Sigma사에서 구입하였다.
시약 및 기기 − Column chromatography용 담체는 Kiesel gel 60 (70~230 mesh, Merck), RP-18 Lichroprep (Merck), Sephadex LH-20 (Sigma)을 각각 사용하였다.
실험재료 − 본 실험에 사용한 결명자는 2007년 4월 전북 익산시 소재 대학한약국에서 구입하였으며, 시료의 일부는 표준품(WP07-18)으로 보관하고 있다.

데이터처리

로 표시하였으며, 각각 3회 반복 실험치를 이용하여 계산하였다. 통계처리는 one-way ANOVA test를 적용하여 수행하였고, p값이 0.01 미만을 통계학적으로 의미 있다고 간주하였다.

성능/효과

분리된 2종의 화합물 모두가 유의한 간 세포 보호 활성을 보였고, 각각 실험된 농도에서 농도의존적인 세포보호효과를 보였으며, 또한 각각 160 μM 에서 대조군에 대한 55.3±0.5%과 41.2±0.8%의 보호율을 나타냈다(Fig. 2).

후속연구

13) 따라서, 본 연구에서 간 세포보호 활성이 인정된 2종의 화합물에 대해서는 항산화작용을 포함한 추가 기전연구가 필요할 것으로 생각된다. 결명자에서 분리한 naphtha-pyrone 배당체에 대한 사염화탄소와 galactosamine으로 유발한 간독성에 대하여 보호활성을 나타내는 보고가 있으나^,14) anthraquinone계열의 화합물인 화합물 1과 2에 대해서는 아직 보고가 없는 것으로 판단된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	타크린을 사용할 때 투약의 제한을 비롯한 신중한 투여가 요구되는 이유는 무엇인가?	타크린 (tacrine; 1,2,3,4-tetrahydro-9-aminoacridine hydrochloride)은 아세틸콜린에스테라제 저해제로서 알츠하이머 증후군의 치료약의 하나로 사용되고 있다. 그러나, 이 약물을 복용하는 환자의 30-50%에 있어서 가역성 간 손상이 유발되기 때문에 투약의 제한을 비롯한 신중한 투여가 요구되고 있다.2) 따라서, 천연물로부터 타크린의 간 독성을 감소시킬 수 있는 화합물을 발견하는 것은 중요하다고 생각된다.
	간장은 어떤 역할을 하는 체내 기관인가?	간장은 약물대사의 주요 기관이며, 소화기계로 들어온 생체외 물질로부터 전신을 방어하는 기능을 수행하고 있다. 또한 질병의 치료 목적으로 생체 내로 들어온 약물과 같은 외부 물질이 간을 통과함으로써 영양소외에도 독성물질에 노출될 위험이 여타의 장기에 비해 손상될 수 있는 확률이 비교적 높다.
	타크린은 어떤 질환에 사용되는 치료약인가?	타크린 (tacrine; 1,2,3,4-tetrahydro-9-aminoacridine hydrochloride)은 아세틸콜린에스테라제 저해제로서 알츠하이머 증후군의 치료약의 하나로 사용되고 있다. 그러나, 이 약물을 복용하는 환자의 30-50%에 있어서 가역성 간 손상이 유발되기 때문에 투약의 제한을 비롯한 신중한 투여가 요구되고 있다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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