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문제 정의
- 따라서 난황 레시틴의 분리과정에 따른 요인별 상호작용에 따른 공정을 최적화하는 예측모델의 개발이 필요하다고 보고 본 연구에서는 건조과정을 거치지 않은 난황액에서 용매의 독성이 없는 에탄올과 여러 조건을 조합하여난황액내 고순도의 레시틴 분리 추출공정을 단순화하고 최적화 하기위해 실시하였다.
가설 설정
- 1)Lecithin content is percentage of separated phospholipid.
제안 방법
- 교반(VELP, EU) 30분, 초음파(Branson 8210, USA)30분으로 각각 실온에서(23。0 난황액에 처리한 후 레시틴 분리정도를 확인하였다.
- 계란 난황액에서 인지질의 추출 전처리 조건을 확립하기 위해 균질방법을 달리하여 살펴보았다(Table 3). 균질기를 이용하여 5분간, 자석막대를 이용한 교반 30분, 초음파30분의 처리 후 인지질 함량은 각각 6.
- , 1994). 그러나 본 연구에서는 자석교반이나 초음파 처리 방법보다 5분간 균질기를 이용한 방법이 더 높은 레시틴 함량을 보여 이후 이 방법을 선택하여 이용하였다.
- 난황 레시틴 분리조건에 대한 실험계획은 미리 예비실험을 통하여 추출용매로는 에탄올을 선택하였고 레시틴 분리에 가장 영향하는 조건을 선택하여 그 조건을 바탕으로설립한 중심합성계획(central composite design, CCD)에 따라 독립변수는 용매비율(시료대비 3, 6, 9배), 추출온도(20, 40, 60℃), 에탄올 농도(90, 95, 100%)로 하였으며 각 실험 조건은 -1, 0, 1 으로 부호화하여 설정된 15개 조건에 의해 2회 이상 반복실험을 실시하였다. 또한 이들 독립변수에 의해 영향을 받는 종속변수로는 레시틴의 함유율로 하였으며 각 독립변수의 수준은 Table 2와 같다.
- 난황액의 인지질 추출을 위한 균질시간에 따른 효과를 균질기(Ultra Turrax T25B)를 이용하여 실온에서 20, 000 rpm의 속도로 5 min과 10 min의 균질 조건을 통해 비교하였다. 또한 인지질내 지방을 제거하기위해 아세톤 첨가량에 따른(50, 100, 150 mL) 인지질 함량과 phosphatidyl choline의 함량을 측정하여 적정 조건을 선정하였다.
- 001). 따라서 난황 내 레시틴 분리를 위한 균질시간을 5분으로 선정하였다. Palacios와 Wang(2005)은 난황액 내 인지질이 7.
- 속도로 5 min과 10 min의 균질 조건을 통해 비교하였다. 또한 인지질내 지방을 제거하기위해 아세톤 첨가량에 따른(50, 100, 150 mL) 인지질 함량과 phosphatidyl choline의 함량을 측정하여 적정 조건을 선정하였다.
- 레시틴 추출을 위한 균질 방법을 선정한 후 시간에 따른 레시틴 함량의 변화를 살펴보았다(Table 4). 난황액에 5분과 10분의 균질화 후 인지질 함량은 10분 처리후 6.
- 위 실험에서 얻어진 난황액 레시틴 분리조건(20, 000 rpm 에서 5분간 균질, 아세톤 150 mL 첨가)을 기본으로 하여여러 연구결과에서도 보고된(Kim et al., 1995; Palacio and Wang, 2005) 인지질 추출에 가장 영향을 미치는 추출 온도, 추출용매 첨가비율, 추출용매 희석비를 요인으로 하여 반응표면분석기법으로 배치한 15개 실험 처리구에 대한난황액 레시틴 분리실험을 실시하였다. 난황액내 인지질추출 최적화에 세 가지 요인변수인 에탄올 첨가비율(3-6배, XI), 추출온도(20-6(TC, X2), 에탄올 농도(90-100%,X3)에 따른 종속변수(레시틴%, Y)에 대한 반응표면 회귀 식은 다음과 같다.
대상 데이터
- 인지질 구성 표준물인 phosphatidyl choline,phosphatidyl ethanolamine, sphingomyeline Sigma Co.(StLouis, MO USA)의 제품을 이용하였고 모든 용매는 HPLC grade를 이용하여 분석하였다.
- 계란은 서울의 대형마트에서 판매하는 계란을 구입하여사용하였다. 구입해 온 계란은 당일 할란하여 난황막을 제거한 후 난황만을 별도로 모아 냉동하여(-20℃)실험에 사용하였다.
- 구입해 온 계란은 당일 할란하여 난황막을 제거한 후 난황만을 별도로 모아 냉동하여(-20℃)실험에 사용하였다. 인지질 구성 표준물인 phosphatidyl choline,phosphatidyl ethanolamine, sphingomyeline Sigma Co.
데이터처리
- 균질방법, 균질시간, 아세톤 처리량에 관한 데이터는Statistical Analysis System(2000, SAS version 9.1) 프로그램을 이용하여 분산분석을 실시하였으며 유의성이 인정되는 경우 Duncan's multiple range test를 이용하여 평균값간의 유의성을 5%이내의 수준에서 조사하였다.
- 또한 이들 독립변수에 의해 영향을 받는 종속변수로는 레시틴의 함유율로 하였으며 각 독립변수의 수준은 Table 2와 같다. 모델식의예측을 위한 회귀분석은 SAS 프로그램(2000, version 9.12)을 이용하였고 독립변수에 대한 종속변수의 반응표면 상태를 3차원그래프와 등고선 분석으로 실시하였다. 회귀분석 결과 임계점이 최대점이거나 최소점이 아니고 안장점일경우 능선분석을 행하여 최적점을 구하였다(Sung, 1993).
- 12)을 이용하였고 독립변수에 대한 종속변수의 반응표면 상태를 3차원그래프와 등고선 분석으로 실시하였다. 회귀분석 결과 임계점이 최대점이거나 최소점이 아니고 안장점일경우 능선분석을 행하여 최적점을 구하였다(Sung, 1993).
이론/모형
- 난황액 에탄올 인지질 추출은 Fig. 1에 제시한 바와 같이 진행하였으며 조인지질 함량은 건강기능식품공전(2004) 에 제시된 방법에 따라 아세톤 불용물질의 정량에 의해 측정하였고 분리된 인지질의 주요 구성 성분인 phosphatidyl choline, phosphatidyl ethanolamine 및 sphingomyeline- Table 1 의 분석조건으로 HPLC를 이용하여 분리 하였다. 분리 용매는 비율대로 잘 섞은 후 완전 탈기한 후 사용하였고 인지질 시료는 0.
- 분리된 레시틴을 Folch의 방법(1957)에 따라 지방을 클로로폼 : 메탄올 (2:1)로 추출하여 14% BF3-메탄올로 메틸 에스테르화하여 헥산에 녹인 후 지방산 조성을 가스크로마토그래프(Hewlett Packard 6890, USA)를 이용하여 불꽃이 온 검출기로 검출하였다. 이때 컬럼은 Supelco wax10 capillary column(30 mx0.
성능/효과
- 아세톤은 난황 내 인지질 분리시 지방을 제거하기위해 흔히 쓰인다(AOAC, 1994). Fig. 1의 과정에 따라 아세톤을 50, 100 및 150 mL으로 처리하여 전체 수율, 인지질 및 레시틴의 함량을 살펴본 결과 아세톤 첨가량이 증가할수록 인지질의 수율은 감소했으나 추출된 레시틴의 함량은 오히려 증가하였다(Table 5). Wu와 Wang(2003)도 이같은 현상을 보고 하였는데 난황 내 수분이 부분적으로 아세톤에 용해되어 아세톤의 극성을 상대적으로 더욱 극성을 띠게 하여 아세톤과 물의 혼합물이 증가되어 인지질의 용해성이 증가되어 전체적인 수율은 감소한 것으로 보고하였다.
- 균질기를 이용하여 5분간, 자석막대를 이용한 교반 30분, 초음파30분의 처리 후 인지질 함량은 각각 6.07, 5.63, 5.30%이었고 이들 분리된 인지질의 레시틴의 함량은 각각 56.14,52.40, 49.15%를 나타내었다(p<0.001). 따라서 균질기로 5분간 처리한 방법이 유의적으로 높은 인지질 함량을 보였으며 또한 레시틴의 함량도 56.
- 난황액에 5분과 10분의 균질화 후 인지질 함량은 10분 처리후 6.07% 74.94%으로 오히려 유의적으로 감소하였으며 이에 따라PC의 함량도 56.14-+54.21%로 감소하였다(p<0.001). 따라서 난황 내 레시틴 분리를 위한 균질시간을 5분으로 선정하였다.
- 난황으로부터 레시틴 고함유 인지질을 회수하기 위하여 전처리, 표면반응분석기법을 실시한 결과 난황 인지질 분리조건(난황액 100g 기준)은 알코올 농도 95.83%, 알코올첨가량 1: 6.51, 균질온도 40.2℃, 20, 000 rpm에서 5분간 균질한 후 원심 분리하여 여과 후 진공농축하고 아세톤 150 mL로 1회 세척하여 분리한 것으로 수율은 인지질 64.8%이상 레시틴 함량 55.04%의 연지질 분리를 위한 공정을 확립하였다.
- 001). 따라서 균질기로 5분간 처리한 방법이 유의적으로 높은 인지질 함량을 보였으며 또한 레시틴의 함량도 56.14%로 가장 높은 조성을 나타내었다. 이는 난황을 20, 000 rpm의 속도로 5분간 균질한 방법이 지방과 단백질의 결합을 더 효율적으로 깨어준 것으로 생각된다.
- 00을 보였으며 에탄올 농도에서만 5%의 유의성을 나타내었다. 따라서 난황액내 레시틴의 추출은 에탄올의 첨가비율과 농도에 의해 통계적으로 유의적인 영향을 받았으나 추출온도에 따른 영향은 낮은 것으로 판단되었다. 이러한 결과는 Palacios와 Wang(2005)이 열처리가 에탄올을 이용한 인지질의 추출에 불필요하다고 보고한 것과 유사한 것으로 일반적으로 지방을 함유한 물질에 열처리하여 단백질이 변성되면 단백질과 지방의 결합을 절단하여 지방의 추출을 용이하게 하는 것으로 알려져 있으나 에탄올 자체가 강한 극성 용매로 이미 단백질과 지방의 결합을 충분히 절단하였기 때문인 것으로 추정하였다.
- 05). 또한 난황 레시틴 추출에 대한 에탄올 첨가비율의 F-ratio 가 7.68로서 5%의 유의수준으로 통계적 유의차를 보였고 추출온도와 에탄올농도의 F-ratio는 각각 2.75, 6.00을 보였으며 에탄올 농도에서만 5%의 유의성을 나타내었다. 따라서 난황액내 레시틴의 추출은 에탄올의 첨가비율과 농도에 의해 통계적으로 유의적인 영향을 받았으나 추출온도에 따른 영향은 낮은 것으로 판단되었다.
- 일반적으로 난황에서 분리된 레시틴은 대두 레시틴보다 상대적으로 더 높은 포화지방산 함량을 보여 산화안정성이 강한데(Palacios and Wang, 2005) 불포화 지방산에는(0-6 지방산과 3-3지방산이 각각 5-6 g/100 g과 6- 7 g/100 g 포함되어 있다(Nielsen, 2001). 본 연구를 통해난황액 100 g에서 분리된 조인지질은 9.85 g의 총 수율, 인지질 함량 64.8%이상, 레시틴함량 55.04%를 보였고 분리된 레시틴의 지방산 조성을 Kim 등(1995)이 분리한 레시틴의 지방산 조성과 비교했을 때 palmitic acid, palmitoleic acid는 보다 다소 낮은 수준을, oleic acid 와 linoleic acid는 다소 높은 수준을 나타내었고 특히 stearic acid는 5.84% 높은 값을 보였다(Table 6). 그러나arachidonic acid는 검출되지 않았다.
- 04%인 것으로 예측되었다. 예측된 최적 조건에서의 추출된 레시틴의 실제 레시틴 측정값은 56.21%을 보여 예측값과 유사한 함량을 보였다. 레시틴 분리를 위한 선정된 최적 조건중 에탄올 농도 95.
- 처리조건에 따른 예측된 정상점은 최적 분리조건(maximum point)이 나타나지 않고 안장점 (saddle point)이나타나 이에 대한 최적 분리조건을 찾기 위해 능선 분석을 실시한 결과 최적의 분리 조건은 난황액 100 g 기준시 에탄올 농도 95.83%, 추출온도는 40.2℃, 에탄올 첨가비율 은 6.51 배이며 이때의 최대 레시틴 함량비는 55.04%인 것으로 예측되었다. 예측된 최적 조건에서의 추출된 레시틴의 실제 레시틴 측정값은 56.
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