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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 현재 식품이나 의약품으로 사용하기 위해 계란 노른자로부터 유기용매로 레시틴을 추출하고 남은 잔사를 효율적으로 활용하고자, 단백질을 추출하고 이를 효소로 가수분해시킨 후 3단계 막반응기를 사용하여 분자량별로 분획한 가수분해물들의 항산화활성을 검토 하였다.
제안 방법
- 가수분해물의 농도에 따른 항산화활성의 측정은 가수분 해물을 linoleic acid에 대해 0.1%에서 2%까지 첨가하여 40 ±1℃로 조절된 항온기 내에서 저장하면서 일차별로 TBA 와 ferric thiocyanate 방법에 따라 흡광도를 즉정하였다.
- 계란 노른자로부터 레시틴을 추출하고 남은 잔사를 효율적으로 이용하기 위하여 유기용매 변성 단백질을 알칼리로 환원시켜 효소로 가수분해시킨 후 한외여과막을 사용하여 분자량별로 분획하여, 이들 가수분해물들의 항산화활성을 검토하였다.
- 기질에 대한 최적의 효소비를 결정하기 위해서 0.1 Mdisodium hydrogen phosphate-sodium dihydrogen phosphate buffer (pH 7.0)를 사용하여 50℃에서 기질 대 효소 비를 10에서 1,000까지 변화시켜 가수분해도를 검토하였다. 또한 최적의 기질농도를 결정하기 위하여 0.
- 0)를 사용하여 50℃에서 기질 대 효소 비를 10에서 1,000까지 변화시켜 가수분해도를 검토하였다. 또한 최적의 기질농도를 결정하기 위하여 0.2%부터 5%까지 기질농도를 변화시키면서 동일한 완충용액과 온도에서 가수분해하여 기질농도를 검토하였고, 기질에 대한 효소의 반응시간에 대한 조건은 50℃, 기질농도 1% 및 기질 대 효 소비를 100:1로 하고 반응시간을 1, 2, 4, 8, 12, 18 및 24시간로 변화시키면서 가수분해도를 측정하였다.
- 여러가지 효소를 이용한 계란 노른자 단백질의 가수분해도 (degree of hydrolysis) 측정은 각 시료 0.5 g을 Table 1에 나타낸 완충용액 50 ml에 분산시켜 1% (w/v) 기질용액으로 만든 다음, 각 효소별 최적온도에서 8시간 반응시켰으며, 첨가된 효소량은 기질대 효소비가 100:1이 되도록 하였다. 반응종료 후 반응 혼합물을 2 ml 취하고 여기에 20% trichloroacetic acid (TCA)를 동량 첨가하여 윈심분리 (2, 370xg, 5분)한 다음, 상층액을 일정량 취하여 Lowry 법 [13]으로 10% TCA 가용성 단백질량을 측정한 후 다음 식으로부터 가수분해도를 계산하였다.
- 계란 노른자로부터 레시틴을 추출하고 남은 잔사는 Lawrence 및 Weber[12]의 방법을 이용하여 지질을 제거하고 단백질만을 분리하였다. 즉, 계란 노른자로부터 레시틴을 추출하고 남은 잔사 30 g에 1% KOH용액 150 ml와 methanol 150 ml를 가하여 50℃에서 4시간 동안 교반한 다음, 원심분리 (3, 900Xg, 10분)하여 상층액을 제거한 후, 침전물을 아세톤으로 여러 회 세척하여 지질을 완전히 제거하고, 2% 2-mercaptoethanol을 사용하여 계란 노른자 단백질을 환원시킨 다음 동결건조하여 가수분해를 위한 시료로 사용하였다.
- Ferric thiocyanate에 의한 항산화활성 측정은 Mit- suda 등[14]의 방법에 따라 실시하였다. 즉, 유지혼탁액 0.1 ml에 75% ethanol 4.7 ml, 30% ammonium thiocynate 0.1 mC 및 3.5% HC1 이 포함된 20 mM ferrous chloride 0.1 를 가한 후 3분 후에 500 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 가수분해물의 상승효과는 TBA 및 ferric thiocyanate 방법에 의해 결정하였다. 즉, 유지혼탁액에 a-tocopheiol을 linoleic acid에 대해 0.1%가 되게 첨가하고, 여기에 가수분 해물을 linoleic acid에 대해 1%가 되게 가한 후 40±1℃로 조절된 항온기 내에 저장하면서 TBA값 및 ferric thio- cyanate값을 측정하였다.
- 가수분해물은 Kim 등[9]의 방법에 따라 계란노른자 단백질을 효소로 가수분해시켜 각 단계별로 분자량 크기에 따라 분획하였다. 즉, 효소로 가수분해시킨 후 한외여과막 장치를 사용하여 분자량 한계범위가 각각 10 kDa, 5 kDa 및 1 kDa인 막에 차례로 통과시켜 분획한 후 동결건조하여 가수분해물을 제조하였다.
대상 데이터
- 가수분해 시 사용한 효소인 pepsin, a-chymotrypsin, trypsin 및 pronase E는 Sigma Chemical Co. (St. Louis, USA), Alcalase와 Neutrase는 Novo Co. (Denmark)로부터 구입하였고, TPCCE (tuna pyloric caeca crude enzyme)는 (주)동원산업에서 구입한 참치 유문수로부터 조효소를 추출하여 사용하였다[10]. 또한, 항산화활성을 측정하기 위한linoleic acid, thiobarbituric acid 및 anunonium thiocyanate는 Sigma Chemical Co.
- 계란 노른자 단백질을 가수분해시켜 분자량별로 분획하기 위한 한외 여과막장치 (ultrafiltration membrane system)는 Millipore Co. (Bedford, USA)로부터 구입하였고, 사용된 막의 분자량 한계범위 (molecular weight cut-crff: MWCO)는 각각 io kDa, 5 kDa 및 1 kDa을 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 시료는 계란 노른자로부터 레시틴을 추출하고 남은 잔사로 경기도 용인에 위치한 두산인재기술 개발원에서 구입하였다.
이론/모형
- 9. Antioxdative activity of EYPU at various concentration in linoleic acid autoxidation system measured by the TBA method.
- 10. Antioxdative activity of EYPU at various concentration in linoleic acid autoxidation system measured by the ferric thiocyanate method.
- 7. Antioxdative activity of hydrolysates of Alcalase from egg yolk protein in linoleic acid autoxidation system measured by the TBA method. EYPI z Hydrolysate of egg yolk protein passed through a membrane with molecular weight cut-off (MWCO) 10 kDa but not passed through a membrane with MWCO 5 kDa; EYPEE, Passed through a membrane with MWCO 5 kDa but not passed through a membrane with MWCO 1 kDa; EYPUL Passed through a membrane with MWCO 1 kDa; Toco, tz-tocopherol.
- 8. Antioxdative activity of hydrolysates of Alcalase from egg yolk protein in linoleic acid autoxidation system measured by the ferric thiocyanate method.
- Fig 2. Effect of antioxidative activity of hydrolysates of various enzymes from egg yolk protein in linoleic acid autoxidation system measured by the TBA method.
- 5 ml를 넣고 혼합한 다음, 5℃에서 60분간 방치한 후 95℃ 에서 60분간 발색시켜 분광광도계 (Hitachi, Japan)를 사용하여 532 run에서 흡광도를 측정하였다. Ferric thiocyanate에 의한 항산화활성 측정은 Mit- suda 등[14]의 방법에 따라 실시하였다. 즉, 유지혼탁액 0.
- 11. Synergistic effects of a -tocopherol and hydrolysates of egg yolk protein in linoleic acid autoxidation system measured by the TBA method.
- 12. Synergistic effects of a -tocopherol and hydrolysates of egg yolk protein in linoleic add autoxidation system measured by the ferric thiocyanate method.
- 이때 a-tocopherole ethanol에 용해시켰으며, 대조구는 가수분해물을 첨가하지 않고 만든 linoleic acid emulsion 그 자체를 사용하여 40± 1℃로 조절된 항온기내에서 저장하면서 자동산화를 촉진시켰다. Thiobarbituric acid (TBA)에 의한 항산화활성의 측정은 Ohkawa 등[15]의 방법에 따라 실시하였다. 즉, 40 ℃에서 반응시킨 linoleic acid emulsion 0.
- 가수분해물은 Kim 등[9]의 방법에 따라 계란노른자 단백질을 효소로 가수분해시켜 각 단계별로 분자량 크기에 따라 분획하였다. 즉, 효소로 가수분해시킨 후 한외여과막 장치를 사용하여 분자량 한계범위가 각각 10 kDa, 5 kDa 및 1 kDa인 막에 차례로 통과시켜 분획한 후 동결건조하여 가수분해물을 제조하였다.
- 가수분해물의 상승효과는 TBA 및 ferric thiocyanate 방법에 의해 결정하였다. 즉, 유지혼탁액에 a-tocopheiol을 linoleic acid에 대해 0.
- 계란 노른자로부터 레시틴을 추출하고 남은 잔사는 Lawrence 및 Weber[12]의 방법을 이용하여 지질을 제거하고 단백질만을 분리하였다. 즉, 계란 노른자로부터 레시틴을 추출하고 남은 잔사 30 g에 1% KOH용액 150 ml와 methanol 150 ml를 가하여 50℃에서 4시간 동안 교반한 다음, 원심분리 (3, 900Xg, 10분)하여 상층액을 제거한 후, 침전물을 아세톤으로 여러 회 세척하여 지질을 완전히 제거하고, 2% 2-mercaptoethanol을 사용하여 계란 노른자 단백질을 환원시킨 다음 동결건조하여 가수분해를 위한 시료로 사용하였다.
- 단백질 가수분해물의 항산화활성은 linoleic acid emul- sion을 Osawa 등[16]의 방법에 따라 linoleic acid 0.13 ml, ethanol 10 ml, 50 mM phosphate buffer (pH 7.0) 10 ng를 혼합하고, 이 혼합물에 가수분해물을 linoleic acid에 대해 각각 1% (w/v)의 농도로 3차 증류수에 용해시켜 첨가하여 전체 부피가 25 ml가 되게 하였다. 이때 a-tocopherole ethanol에 용해시켰으며, 대조구는 가수분해물을 첨가하지 않고 만든 linoleic acid emulsion 그 자체를 사용하여 40± 1℃로 조절된 항온기내에서 저장하면서 자동산화를 촉진시켰다.
- 5 g을 Table 1에 나타낸 완충용액 50 ml에 분산시켜 1% (w/v) 기질용액으로 만든 다음, 각 효소별 최적온도에서 8시간 반응시켰으며, 첨가된 효소량은 기질대 효소비가 100:1이 되도록 하였다. 반응종료 후 반응 혼합물을 2 ml 취하고 여기에 20% trichloroacetic acid (TCA)를 동량 첨가하여 윈심분리 (2, 370xg, 5분)한 다음, 상층액을 일정량 취하여 Lowry 법 [13]으로 10% TCA 가용성 단백질량을 측정한 후 다음 식으로부터 가수분해도를 계산하였다.
성능/효과
- 1과 같다. Trypsin으로 가수분해하 였을 때 가수분해도가 90%로 가장 높았으며, Alcalase, a- chymotrypsin 및 TPCCE로 가수분해시켰을 때 약 70%의 가수분해활성을 나타내었다. 반면, Neutrase와 pronase E 로 가수분해시켰을 때의 가수분해도는 10%미만으로 가수분해가 거의 일어나지 않았다.
- 이 가수분해물을 분자량 10 kDa, 5 kDa 및 1 kDa 이하를 분획할 수 있는 한외여과막으로 각각 분리한 가수분해물 중 5 kDa의 막으로 분리된 가수분해물이 a -tocopherol보다 37%정도 항산화활성이 높아 가장 우수하였다. 가수분 해물의 첨가 농도에 따른 항산화활성은 첨가 농도가 0.5%까지는 a-tocopherol과 거의 유사하였지만, 1%의 농도에서는 37%정도 높은 항산화활성을 나타내었다. 또한, 각 단 계 별 가수분해물 1%를 a-tocopherol과 함께 첨가하여 항산화 상승효과를 검토한 결과, q-tocopherol만을 첨가한 대조구보다 모든 가수분해물에서 67%이상의 높은 상승효과를 보였다.
- 10에 나타내었다. 가수분해물의 항산화활성은 가수분해물의 첨가 농도가 0.5%까지는 TBA값과 ferric thiocyanate값 모두에서 활성이 천연항산화제 인 a -tocoph- erol과 거의 유사하거나 약간 높았지만, 1% 이상의 농도에서는 각각 30% (Fig. 9)와 45% (Fig. 10)이상의 높은 항산화 활성을 나타내었다. 이러한 결과는 펩타이드의 첨가 농도 가 낮을 경우에는 펩타이드 자체의 산화정도가 항산화활성 에 크게 영향을 미치지 않지만, 펩타이드를 1% 이상 첨가하였을 때 펩타이드의 산화정도가 항산화활성에 영향을 미치는 중요한 요인으로 작용하기 때문으로 판단되며, 본 연구에서는 가수분해물의 항산화활성에 대한 최적농도는 1% 였다.
- 12에 나타내었다. 각 단계 별 가수분해 물 1%를 a -tocopherol 과 함께 첨가한 경우, a-tocopherol만을 첨가한 대조구보다 TBA값과 ferric thiocyanate값이 각 단계별 가수분해물 모두에서 거의 유사한 결과를 얻었으며, 이들은 각각 60% (Fig. 11)와 75% (Fig. 12)정도의 높은 상승효과를 보였다.
- 즉, 가수분해물의 항산화활성은 Alcalase 로 8시간 가수분해시킨 가수분해물에서 가장 높게 나타났 으며, 이는 시 판 천 연 항산화제 인 a-tocopherol보다 TBA법 과 ferric thiocyanate법에서 각각 27%와 42% 정도 활성이 높게 나타났다. 그리고, 가수분해 활성이 높게 나타난 tryp- sin으로 가수분해시킨 가수분해물에서의 항산화활성도 천연항산화제와 비교하여 비교적 높았으나, Alcalase로 가수 분해시킨 가수분해물보다는 항산화활성이 낮았다. 이 결과는 가수분해도와 항산화활성과는 상관관계가 없음을 보여주는 것으로, 이러한 결과는 기질의 차이뿐만 아니라 각 효소가 기질에 작용하는 절단부위가 다르기 때문에 N말단 및 C말단에 위치하는 아미노산의 종류가 달라지므로 항산 화활성이 다르게 나타나는 것으로 판단된다.
- 4). 기질 농도는 1%에서 가수분 해활성이 73%로 가장 우수하였으며 (Fig. 5), 반응시간 18 시간까지는 가수분해도가 급격하게 증가하여 가수분해도가 96%였으나 그 이후에는 거의 일정하였다 (Fig. 6)
- 5%까지는 a-tocopherol과 거의 유사하였지만, 1%의 농도에서는 37%정도 높은 항산화활성을 나타내었다. 또한, 각 단 계 별 가수분해물 1%를 a-tocopherol과 함께 첨가하여 항산화 상승효과를 검토한 결과, q-tocopherol만을 첨가한 대조구보다 모든 가수분해물에서 67%이상의 높은 상승효과를 보였다.
- 여러가지 효소로 가수분해시켜 얻은 가수분해물 중에서 항산화활성이 가장 우수한 것은 Alcalase 분해물로 천연 항산화제인 q-tocopherol보다 34%정도 활성이 높았다. 이 가수분해물을 분자량 10 kDa, 5 kDa 및 1 kDa 이하를 분획할 수 있는 한외여과막으로 각각 분리한 가수분해물 중 5 kDa의 막으로 분리된 가수분해물이 a -tocopherol보다 37%정도 항산화활성이 높아 가장 우수하였다. 가수분 해물의 첨가 농도에 따른 항산화활성은 첨가 농도가 0.
- 그리고, 가수분해 활성이 높게 나타난 tryp- sin으로 가수분해시킨 가수분해물에서의 항산화활성도 천연항산화제와 비교하여 비교적 높았으나, Alcalase로 가수 분해시킨 가수분해물보다는 항산화활성이 낮았다. 이 결과는 가수분해도와 항산화활성과는 상관관계가 없음을 보여주는 것으로, 이러한 결과는 기질의 차이뿐만 아니라 각 효소가 기질에 작용하는 절단부위가 다르기 때문에 N말단 및 C말단에 위치하는 아미노산의 종류가 달라지므로 항산 화활성이 다르게 나타나는 것으로 판단된다.
- 10)이상의 높은 항산화 활성을 나타내었다. 이러한 결과는 펩타이드의 첨가 농도 가 낮을 경우에는 펩타이드 자체의 산화정도가 항산화활성 에 크게 영향을 미치지 않지만, 펩타이드를 1% 이상 첨가하였을 때 펩타이드의 산화정도가 항산화활성에 영향을 미치는 중요한 요인으로 작용하기 때문으로 판단되며, 본 연구에서는 가수분해물의 항산화활성에 대한 최적농도는 1% 였다.
- 이상의 보고에서 가수분해물의 항산화성은 아미노산 단계에서는 radical scavenger로서 작용하여 과산화물 생성을 억제하고, 펩타이드 단계에서는 그 구성아미노산의 성분과 위치에 의해 항산화성이 결정되는 것으로 판단된다.
- 3에 나타내었다. 즉, 가수분해물의 항산화활성은 Alcalase 로 8시간 가수분해시킨 가수분해물에서 가장 높게 나타났 으며, 이는 시 판 천 연 항산화제 인 a-tocopherol보다 TBA법 과 ferric thiocyanate법에서 각각 27%와 42% 정도 활성이 높게 나타났다. 그리고, 가수분해 활성이 높게 나타난 tryp- sin으로 가수분해시킨 가수분해물에서의 항산화활성도 천연항산화제와 비교하여 비교적 높았으나, Alcalase로 가수 분해시킨 가수분해물보다는 항산화활성이 낮았다.
- 8에 나타내었다. 즉, 각 가수분해물의 항산화활성은 5 kDa인 막을 통과하여 나온 가수분해물이 대조구에 비해 각각 60% (Fig. 7)와 70% (Fig. 8), 시판 천연 항산화제인 a -tocopherol보다 각각 30% (Fig. 7)와 43% (Fig. 8)정도 활성이 높게 나타났으며, 10 kDa과 1 kDa인 막을 통과하여 나온 가수분해물의 항산화활성도 천연항산화제와 거의 유사하였다.
- 6과 같다. 즉, 기질 대 효소비가 10:1에서 가수분해활성이 82%로 가장 높았으나 100:1에 비해 큰 차이가 없으므로 대량처리 시 경제적인 효과를 감안할 때 기질 대 효소비가 100:1이 적합하다고 판단된다. (Fig.
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