To evaluate the bioequivalence of two venlafaxine formulations, a standard 2-way randomized cross-over study was conducted in twenty-four healthy male Korean volunteers. A single oral dose of 75 mg of test formulation Venfaxine $OR^{(R)}$ (tablet) or reference formulation Efexor $XR^...
To evaluate the bioequivalence of two venlafaxine formulations, a standard 2-way randomized cross-over study was conducted in twenty-four healthy male Korean volunteers. A single oral dose of 75 mg of test formulation Venfaxine $OR^{(R)}$ (tablet) or reference formulation Efexor $XR^{(R)}$ (capsule) was administered with one-week washout period. Plasma concentrations of venlafaxine were assayed for over a period of 72 hours with a well validated method using liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (LC-MS-MS). The $mean{\pm}S.D$. of maximum concentration $(C_{max})$ and elimination half-life $(t_{1/2})$ were $64.7{\pm}28.5$ ng/mL, $9.2{\pm}3.0$ h, and $67.2{\pm}30.2$ ng/mL, $9.9{\pm}3.5$ h for test and reference formulations, respectively. Time to reach maximum concentration $(T_{max})$ expressed in median value (range), for the test and the reference, were 10 h (6-14) and 8h (4-12), respectively. Similarly, area under the plasma concentration-time curve, from time zero to last sampling time $(AUC_t)$ and from time zero to time infinity $(AUC_{inf})$, for test and reference formulations were $1185{\pm}755$, $1326{\pm}896$ and $1124{\pm}737$, $1185{\pm}755$$ng{\cdot}h/mL$, respectively. The parametric 90% confidence intervals on the mean of the differences between the two formulations (test-reference) of the log transformed values of $AUC_t$, and $C_{max}$ were 0.9630 to 1.1383 and 0.8650 to 1.0446, respectively. The overall results indicate that the two formulations are bioequivalent and can be prescribe interchangeably.
To evaluate the bioequivalence of two venlafaxine formulations, a standard 2-way randomized cross-over study was conducted in twenty-four healthy male Korean volunteers. A single oral dose of 75 mg of test formulation Venfaxine $OR^{(R)}$ (tablet) or reference formulation Efexor $XR^{(R)}$ (capsule) was administered with one-week washout period. Plasma concentrations of venlafaxine were assayed for over a period of 72 hours with a well validated method using liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (LC-MS-MS). The $mean{\pm}S.D$. of maximum concentration $(C_{max})$ and elimination half-life $(t_{1/2})$ were $64.7{\pm}28.5$ ng/mL, $9.2{\pm}3.0$ h, and $67.2{\pm}30.2$ ng/mL, $9.9{\pm}3.5$ h for test and reference formulations, respectively. Time to reach maximum concentration $(T_{max})$ expressed in median value (range), for the test and the reference, were 10 h (6-14) and 8h (4-12), respectively. Similarly, area under the plasma concentration-time curve, from time zero to last sampling time $(AUC_t)$ and from time zero to time infinity $(AUC_{inf})$, for test and reference formulations were $1185{\pm}755$, $1326{\pm}896$ and $1124{\pm}737$, $1185{\pm}755$$ng{\cdot}h/mL$, respectively. The parametric 90% confidence intervals on the mean of the differences between the two formulations (test-reference) of the log transformed values of $AUC_t$, and $C_{max}$ were 0.9630 to 1.1383 and 0.8650 to 1.0446, respectively. The overall results indicate that the two formulations are bioequivalent and can be prescribe interchangeably.
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제안 방법
약물투약은 2시기 2제품의 라틴방격법에 따른 교차 시험법으로 투약계획을 세우고 24명의 피험자를 군당 12인씩 무작위로 A, B 2군으로 나누고 제 1기 때 A군에는 대조약인 "이팩사® XR서방캅셀”을 B군에는 시험약인 “벤팍신®OR서방정을 투여하였고, 제 2기 때에는 그 반대로 투여하였다. 투여량은 각 제제 모두 1정 혹은 캅셀(벤라팍신으로써 75 mg)으로 하였다.
3 시간으로 나타났다.id 두 보고에서 확인한 반감기를 근거로 생물학적 동등성 시험기준 제 1&조 제 4항 휴약 기간의 산정기준에 따라 충분한 휴약 기간을 두고자 휴약기간을 7일로 하였다.
검량선의 작성 - 검량선 작성을 위하여 벤라팍신 표준품을 메탄올에 녹여 농도를 100 pg/mL로 만든 후 냉장 보관시키고, 이 용액을 냉동 보관하였던 공혈장으로 희석하여 벤라팍신의 혈장 중 농도가 각각 2 (정량한계 농도), 10, 20, 50, 100, 200 및 500ng/mL 농도가 되도록 혈장시료를 만들었다. 각각의 표준혈장 200 μL에 내부표준물질로 플루옥세틴 (1 gg/mL) 40 μL를 넣고 흔들어 섞은 뒤 4 mg 추출용매 (dichloromethane :ether=30:70 (v/v))를 가하고, 5분간 rotator mixer로 혼합한 후 -70℃에 15분간 방치시켜 수층을 동결시켰다.
두 종류의 벤라팍신 제제인 영진약품공업(주)의 “벤팍신® OR서방정”과 한국와이어스의 “이팩사®XR서방캅셀”이 그 생체이용률에 있어 생물학적으로 동등함을 평가하기 위해 건강한 성인 남자 24명을 대상으로 2x2 라틴방격법에 따라 벤라팍신 1정 혹은 1캅셀(벤라팍신으로써 75 tng)을 경구 투여한 후, 72시간에 걸쳐 총 15시점에서 채혈하고 LC-MS- MS를 이용하여 혈장 중 약물의 농도를 측정하여 얻은 결론은 다음과 같다.
0(Varian, Palo Alto, CA, 미국)을 이용하였다. 또한, 원심분리기(MF-300, 한일과학산업사, 인천, 한국), 탁상용 혼합기 (Maxi Mix n, Thermolyne, Iowa, 미국)를 사용하였다.
4kg (52-87)이었다. 모든 지원자들에게 시험에 대한 목적, 방법, 이상약물반응 발생 가능성 및 이에 대한 대책 등을 설명하고 참가동의서를 받은 후 생물학적동등성 시험을 실시하였다.
시험당일 피험자들의 상완 정맥부위에 heparin-locked( 150 unit/mL) angio catheter(보인메디카, 구미, 한국)를 설치하고 blank 혈액으로 각각 10 mL 씩을 채혈한 후, 대조약 또는 시험약 각각 1정 혹은 캅셀(벤라팍신으로써 75mg)을 물 240 mg 함께 투약하였다. 피험자 간 복약시간의 차이는 채혈시간을 고려하여 약 2분 간격으로 하였다.
상등액을 깨끗한 tube에 따라내고, 질소기류 하에 증발시킨 후 잔사에 300μL 이동상을 가하여 재조성한 후, 10분 동안 12,000 rpm에서 원심분리 시키고 이 중 5 μL의 상등액을 취하여 LC-MS-MS에 주입하였다. 여기에서 얻은 내부표준물질의 면적비에 대한 벤라팍신의 면적비를 가지고 검량선을 작성하였으며 하루에 실험을 5번 시행하여 일내 재현성을 구하였고 연속하여 8일간 실험을 행하여 일간 재현성을 구하였다.
시료를 처리하여 실시하였다. 이에 따라 얻은 크로마토그램으로부터 내부표준물질의 피크 면적에 대한 벤라팍신의 면적비를 구하여 미리 작성된 검량선에 의해 혈장 중 벤라팍신의 농도를 산출하였다.
또한, 동일 농도 범위에서 벤라팍신과 내부표준물질의 피크면적 비 의 표준편차를 벤라팍신과 내부표준물질의 피크면적비의 평균값으로 나눈 비의 백분율을 구함으로써 일간 정밀성과 일내 정밀성을 구하여 변동계수를 확인한 결과 모두 15% 이하임을 확인하였다. 정량한계는 신호 대 잡음비 (S/N ratio)를 10으로 하여 검토한 결과 정밀성이 20% 이하이고, 정확성이 80-120%인 조건을 만족하는 농도로 하여 2ng/mL로 정하였다.
피험자 간 복약시간의 차이는 채혈시간을 고려하여 약 2분 간격으로 하였다. 채혈은 벤라팍신 서방형제제의 혈중소실반감기(약 13시간)을 토대로 반감기의 3배 이상인 72시간동안 실시하였고, 채혈 횟수는 약물 투약 직전과 투약 후 0.5, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 24, 36, 48 및 72시간의 총 15시점에서 실시하였다.
mg 함께 투약하였다. 피험자 간 복약시간의 차이는 채혈시간을 고려하여 약 2분 간격으로 하였다. 채혈은 벤라팍신 서방형제제의 혈중소실반감기(약 13시간)을 토대로 반감기의 3배 이상인 72시간동안 실시하였고, 채혈 횟수는 약물 투약 직전과 투약 후 0.
혈장 시료의 처리 및 혈중 농도의 계산 - 혈장 시료의 분석은 피험자로부터 시간별로 채취하여 -70℃에 보관했던 혈장 시료를 실온에 방치하여 녹인 후, 이 혈장 200 μL를 취하여 상기 검량선 작성을 위한 시료 처리법과 동일한 방법으로 시료를 처리하여 실시하였다. 이에 따라 얻은 크로마토그램으로부터 내부표준물질의 피크 면적에 대한 벤라팍신의 면적비를 구하여 미리 작성된 검량선에 의해 혈장 중 벤라팍신의 농도를 산출하였다.
혈중 약물 분석을 위해 펌프(Prostar 220, Varian, Palo Alto, CA, 미국), 자동주입기 (Prostar 400, Varian, Palo Alto, CA, 미국) 등으로 구성된 HPLC system(Varian, Palo Alto, CA, 미국)의 HPLC장치를 사용하였으며, 검출기로는 1200L MS/MS(Varian, Palo Alto, CA, 미국)를, 데이터 처리 는 Star Chromatography Workstation 6.0(Varian, Palo Alto, CA, 미국)을 이용하였다. 또한, 원심분리기(MF-300, 한일과학산업사, 인천, 한국), 탁상용 혼합기 (Maxi Mix n, Thermolyne, Iowa, 미국)를 사용하였다.
대상 데이터
본 연구에서는 LC-MS-MS를 이용하여 벤라팍신의 두 가지 제제인 한국와이어스의 "이팩사®XR서빙캅셀”을 대조약으로, OROS 제형인 영진약품공업(주)의 "벤팍신®OR서방정”을 시험약으로 하여 두 약물이 생체이용률에 있어서 통계학적으로 동등하다는 것을 입증하기 위해서 생물학적 동등성 시험 기준9)에 따라 건강한 성인 남자를 대상으로 시험하였다. 두 벤라팍신 제제의 혈장 중 농도 곡선하 면적(AUG)과 최고 혈장 중 농도(Cmax)를 분산분석 (ANOVA, analysis of variance) 및 90% 신뢰구간을 이용한 통계 검정을 통해 생물학적 동등성을 비교, 판정하고자 하였다.
재료 및 시약
시험에 사용된 약물은 벤라팍신을 75 mg 함유한 정제 혹은캅셀로써, 시험약인 “벤팍신®OR서방정(제조번호 10933 02, 유효기한: 2007. 5.)”과 대조약인 "이팩사®XR서방캅셀(제조번호 L4662A, 유효기간: 2006. 7. 3.)”은 영진약품공업(주)으로부터 얻었다.
Louis, MO, 미국)의 것을 구입하였고, HPLC 장치에 사용한 아세토니트릴과 메탄올 및 정제수는 Fisher Scientific Co.(Springfeild, NJ, 미국)로부터 구입하여 사용하였으며, 기타 그 외의 시약들은 1등급 시약들을 사용하였다.
벤라팍신과 내부표준물질인 플루옥세틴의 precusor ione positive ion mode에서 [M+H]*으로 검출되어, 벤라팍신은 m/z 278 및 플루옥세틴은 m/z 310의 ion을 precusor ion 으로 선정하였다. 선정한 precusor ion의 product ion scan을 통하여 가장 많이 검출되는 벤라팍신 및 플루옥세틴의 product ione 각각 m/z 260 (Figure 1)과 m/z 148 (Figure 2)의 ion으로 선정하였다.
선정하였다. 선정한 precusor ion의 product ion scan을 통하여 가장 많이 검출되는 벤라팍신 및 플루옥세틴의 product ione 각각 m/z 260 (Figure 1)과 m/z 148 (Figure 2)의 ion으로 선정하였다.
피험자는 시험 당시 식품의약품안전청이 고시한 생물학적 동등성 시험 기준9)에 근거하여 만 19~55세의 건강한 성인 남성으로서 병력이 없고 현재 타 약물을 복용하고 있지 않은 지원자를 모집 공고하고 지원신청서를 받아 지원자 35인을 모집하였고, 선정기준에 모두 합당하고 제외기준에 해당되지 않는 자로서 생물학적동등성시험에 적합한 건강한 사람으로 판정된 24명을 피험자로 선정하였다. 피험자로 선정된 사람들의 평균 나이는 만 24.
데이터처리
나타내었다. 생물학적동등성시험기준9)에 의하여 두 제제의 동등성을 평가하고 Tmax를 제외한 파라미터들에 대해 로그 변환한 후, K-BE Test 2002를 이용하여 분산분석 (ANOVA)을 실시하고 각 변동요인 간에 유의성 여부를 검토하였으며 대조약과 시험약의 로그변환한 평균치 차의 90% 신뢰구간를 구함으로써 한국와이어스의 “이팩사®XR서방캅셀”과 영진약품공업(주)의 "벤팍신®OR서방정"의 생물학적 동등성 여부를 판정하였다.
시험하였다. 두 벤라팍신 제제의 혈장 중 농도 곡선하 면적(AUG)과 최고 혈장 중 농도(Cmax)를 분산분석 (ANOVA, analysis of variance) 및 90% 신뢰구간을 이용한 통계 검정을 통해 생물학적 동등성을 비교, 판정하고자 하였다.
제 1기 및 제 2기 시험을 통해 얻은 피험자들의 대조약과 시험약의 시간대별 혈장 중 농도 데이터를 국립 독성 연구원로부터 제공받은 BA Calc 2002 프로그램을 이용하여 72 시간까지의 AUG, 무한대까지의 혈장 중 농도 곡선하 면적 (AUdf), Cmax 및 Tmax을 구한 후, 측정치와 계산치를 평균±표준편차로 나타내었다. 생물학적동등성시험기준9)에 의하여 두 제제의 동등성을 평가하고 Tmax를 제외한 파라미터들에 대해 로그 변환한 후, K-BE Test 2002를 이용하여 분산분석 (ANOVA)을 실시하고 각 변동요인 간에 유의성 여부를 검토하였으며 대조약과 시험약의 로그변환한 평균치 차의 90% 신뢰구간를 구함으로써 한국와이어스의 “이팩사®XR서방캅셀”과 영진약품공업(주)의 "벤팍신®OR서방정"의 생물학적 동등성 여부를 판정하였다.
이론/모형
5 mM ammonium acetate 수용액과 acetonitrile의 혼합액(20:80, v/v)을, 유속은 230 μL/min, 주입 량은 5 μL로 LC-MS-MS에 주입하였다. 벤라팍신의 검출은 MS-MS MRM(multiple reaction monitoring)방법으로 검출하고, electro-spray ionization(ESI) 의 방법으로 이온화를 하였으며, nebulizing gas, turbo gas 및 curtain gas로는 질소를 이용하였고, collision gas로는 argon을 사용하였다. Nebulizer의 온도는 350℃로 설정하고, 압력은 22psi로 전압은 15000V에서 분석하였다.
혈장 중 벤라팍신의 농도를 측정하기 위하여 이미 보고된12,13) 분석법을 참조하여 생체시료를 분석하였다.
성능/효과
1. LC-MS-MS를 이용하여 혈장 중 벤라팍신의 농도를 빠른 시간 내에 Zng/mL(정량한계농도)까지 측정함으로써 생체 이용률의 시험에 이용할 수 있는 충분한 감도, 특이성, 직선성 및 정밀성을 갖는 분석조건을 확립할 수 있었다.
2. 두 약물의 분산분석 결과 로그변환한 AUG, AUGnf, Cmax에 대한 결과를 보면 유의수준(a) = 0.05에서 군간 순서효과는 나타나지 않았으며, 90% 신뢰한계가 모두 log 0.8 -log 1.25이어야 하는 생물학적동등성 시험기준을 만족하였다.
AUG, AUGinf, Cmax에 대한 결과를 보면 유의수준 (a)=0.05 일때, 군간 순서 효과 검정에 대한 F 비(Fg)가 F 분석표의 한계값인 F(l, 24)=4.301 보다 작아 교차 시험이 제대로 이루어졌음을 확인할 수 있었으며, 개체내 변동에서 기간별(period effect) 변동 및 제제별(formulation effect) 변동 모두 유의적인 차이를 보이지 않았다.
공혈장, 2(정량한계 농도), 10, 20, 50, 100, 200 및 500 ng/mL의 혈장표준액을 분석하였을 때, y=0.0187x-0.0038 (r2=0.9999)로 2-500 ng/mL 의 양호한 직선성을 나타내는검량선을 얻을 수 있었다. 또한, 동일 농도 범위에서 벤라팍신과 내부표준물질의 피크면적 비 의 표준편차를 벤라팍신과 내부표준물질의 피크면적비의 평균값으로 나눈 비의 백분율을 구함으로써 일간 정밀성과 일내 정밀성을 구하여 변동계수를 확인한 결과 모두 15% 이하임을 확인하였다.
또한, 피험자로부터 산출한 약물속도론적 파라미터 (AUG, AUCinf, Cmax, Tmax 및 tq)의 평균값을 Table Ⅱ에 나타내었다. 대조약 및 시험약의 AUG의 평균값은 1124±737 및 1185±755 (ng・hmL)로 대조약에 비해 그 차가 5.40% 였으며, AUGnfe 각각 1216±806 및 1326±896(ng・hmL)로 두 제제의 차이가 9.04% 였다. 대조약 및 시험약의 Cmax의 평균값은 67.
9999)로 2-500 ng/mL 의 양호한 직선성을 나타내는검량선을 얻을 수 있었다. 또한, 동일 농도 범위에서 벤라팍신과 내부표준물질의 피크면적 비 의 표준편차를 벤라팍신과 내부표준물질의 피크면적비의 평균값으로 나눈 비의 백분율을 구함으로써 일간 정밀성과 일내 정밀성을 구하여 변동계수를 확인한 결과 모두 15% 이하임을 확인하였다. 정량한계는 신호 대 잡음비 (S/N ratio)를 10으로 하여 검토한 결과 정밀성이 20% 이하이고, 정확성이 80-120%인 조건을 만족하는 농도로 하여 2ng/mL로 정하였다.
로그변환한 평균치 차의 AUG, AU*및 에 대한 90% 신뢰한계는 각각 log0.9630~log 1.1383, log 0.9840~log 1.1651 및 log 0.8650~log 1.0446로 나타나 생물학적동등성시험 기준인 log 0.8에서 log 1.25이내인 조건을 만족함으로써 벤라팍신의 두 제제가 생물학적으로 동등함을 알 수 있었다.
모든 피험자들에게 시험 전 10일간, 시험기간 중 및 휴약기간 중에는 음주나 항생제 및 진통제를 포함한 일체의 약물의 복용을 금지시켰다. 시험 전 저녁부터 모두 동일하게 12시간을 이상을 절식시키고, 물 이외의 음료수는 제한하였다.
이상의 결과를 종합해보면 시험약인 “벤팍신®OR서방정”은 대조약인 “이팩사®XR서방캅셀”에 대하여 생물학적 동등성 시험의 판단 기준인 2항목(AUG, Cmax)에서 모두 동등한 것으로 나타나 이 두 제제는 생물학적으로 동등하다고 사료되었다.
혈장 중 벤라팍신에 대한 본 LC-MS-MS 분석법은 인체에 대한 생체이용률 시험에 이용될 수 있는 충분한 감도, 특이성, 직선성 및 정밀성을 갖고 있음을 알 수 있었다(Table I).
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