[논문]판크레아틴 소화효소의 활성화 조건 연구

김동청

doi:10.5762/kais.2011.12.1.276

판크레아틴 소화효소의 활성화 조건 연구
A Study on the Activation Conditions of Pancreatic Enzymes 원문보기

한국산학기술학회논문지 = Journal of the Korea Academia-Industrial cooperation Society, v.12 no.1, 2011년, pp.276 - 280

초록
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돼지 췌장에서 추출한 판크레아틴 효소들의 활성화 조건에 대해 조사하였다. 십이지장의 첨가는 췌장의 단백질분해효소와 지방분해효소의 활성화를 유도하였다. 췌장액에 10% 십이지장을 첨가하여 $30^{\circ}C$에서 90분간 반응시키거나 $25^{\circ}C$에서 4시간 반응시켰을때 췌장의 단백질분해효소와 지방분해효소의 활성화는 정점에 도달하였고, 전분분해효소의 활성에는 거의 영향을 주지 않았다. 2$5^{\circ}C$에서 4시간의 효소활성화, 원심분리, 아세톤침전 및 동결건조의 연속 공정으로 제조한 판크레아틴 효소들의 비활성도는 단백질분해효소 136 U/mg, 지방분해효소 170 U/mg 및 전분분해효소 400 U/mg으로 나타났다. 확립된 공정에 의해 제조된 판크레아틴은 USP 기준의 5.4배의 단백질분해효소, 58배의 지방분해효소 및 16배의 전분분해효소 활성을 보유한 고활성의 제품이었다.

Abstract ▼ AI-Helper

This study investigated the activation conditions of pancreatic enzymes from porcine pancreas. Duodenum induced the activation of pancreatic protease and lipase in pancreas. When 10% duodenum was added to pancreatic juice and the mixture was incubated at $30^{\circ}C$ for 90 min or at $25^{\circ}C$ for 4 hrs, the activities of pancreatic protese and lipase reached the peak. When the pancreatin was prepared by sequential process of enzymatic activation at $25^{\circ}C$ for 4 hrs, centrifugation, acetone precipitation and freeze-drying, the specific activities of pancreatic protease, lipase and amylase were 136, 116 and 400 U/mg-protein, respectively. The protease, lipase and amylase activities of the prepared pancreatin were 5.4, 58.0 and 16.0 times higher than those of USP standard, respectively.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

췌장의 비활성형의 소화효소들을 활성화시키기 위해 enterokinase가 함유되어 있는 십이지장 추출물을 췌장 분쇄액에 첨가하여 판크레아틴을 제조하는 방법[8]과 적정 조건에서 췌장 추출물을 incubation함으로써 trypsinogen을 trypsin으로 활성화시켜 판크레아틴의 효소활성을 증대시키는 방법[9]이 보고된바 있다. 본 연구에서는 십이지장에 들어있는 enterokinase를 활용하여 판크레아틴의 효소 활성을 최대화하고자 하였고, 이를 위해 췌장에 십이지장을 첨가하여 온도와 시간에 따라 췌장 소화효소의 활성화 정도를 확인하였다. 이에 따라 확립된 최적의 활성화 조건으로 판크레아틴을 제조하여 미국규격표준(USP)과 비교하였다.

제안 방법

각 실험군은 30℃의 항온수조에서 교반하면서 30분마다 시료를 채취한 후 원심분리(4℃, 10,000 x g, 20 min)하여 상등액을 얻었다. 각 상등액의 단백질분해효소, 지방분해효소 및 전분분해효소의 활성을 측정하여 활성화 정도를 비교하였다.
십이지장 첨가가 췌장의 효소 활성화에 미치는 영향을 확인하기 위해 십이지장 첨가군의 효소 활성을 대조군과 비교하였다. 대조군은 췌장 100 g에 5 mM CaCl₂ㆍ2H₂O용액(추출용액, pH 8.2) 100 ml을 첨가하고 믹서를 사용하여 췌장 조직을 완전히 파쇄한 후 췌장분쇄액이 최종 250 ml이 되도록 추출용액을 첨가하였다. 십이지장 첨가군은 췌장 100 g과 십이지장 10 g에 추출용액(pH 8.
그러나 온도를 저온으로 많이 낮출 경우 냉장온도를 유지하는데 에너지가 필요함은 물론 활성화에 많은 시간이 소모되므로 바람직하지 않고 따라서 활성화 온도가 실온에 가까울수록 효율적인 공정으로 볼 수 있다. 따라서 25℃의 온도에서 췌장 효소의 활성화 공정을 수행하여 효소활성화 정도를 비교하였다.
십이지장 첨가가 췌장의 효소 활성화에 미치는 영향을 확인하기 위해 십이지장 첨가군의 효소 활성을 대조군과 비교하였다. 대조군은 췌장 100 g에 5 mM CaCl₂ㆍ2H₂O용액(추출용액, pH 8.
2) 100 ml을 첨가하고 믹서를 사용하여 췌장 조직을 완전히 파쇄한 후 췌장분쇄액이 최종 250 ml이 되도록 추출용액을 첨가하였다. 십이지장 첨가군은 췌장 100 g과 십이지장 10 g에 추출용액(pH 8.2) 100 ml을 첨가하고 믹서를 사용하여 파쇄한 후 분쇄액이 250 ml이 되도록 추출용액을 첨가하였다. 각 실험군은 30℃의 항온수조에서 교반하면서 30분마다 시료를 채취한 후 원심분리(4℃, 10,000 x g, 20 min)하여 상등액을 얻었다.
십이지장 첨가량과 incubation 온도가 췌장의 효소활성화에 미치는 영향을 확인하였다. 췌장 100 g에 십이지장을 각각 2 g 및 10 g을 넣고 추출용액(pH 8.
본 연구에서는 십이지장에 들어있는 enterokinase를 활용하여 판크레아틴의 효소 활성을 최대화하고자 하였고, 이를 위해 췌장에 십이지장을 첨가하여 온도와 시간에 따라 췌장 소화효소의 활성화 정도를 확인하였다. 이에 따라 확립된 최적의 활성화 조건으로 판크레아틴을 제조하여 미국규격표준(USP)과 비교하였다.
원심분리로 상등액을 제거하여 단백질 침전을 얻고 4℃에서 15시간 방치하여 아세톤을 휘발시킨 후 동결건조기에서 건조하여 분말로 제조하였다. 판크레아틴 분말은 50 mM phosphate 완충용액(pH 7.2)에 녹여 단백질분해효소, 지방분해효소 및 전분분해효소의 활성을 측정하였다.

이론/모형

Pharmacopeia, Rockville, MD, USA)을 기준으로 하여 미국규격표준(USP)의 방법[10]에 따라 측정하였다. 단백질 정량은 표준물질로 bovine serum albumin을 사용하여 BCA 단백질 정량법[11]에 따라 수행하였다.
돼지 췌장으로부터 추출한 판크레아틴의 단백질분해효소, 지방분해효소 및 전분분해효소의 활성은 USP 표준물질(U.S. Pharmacopeia, Rockville, MD, USA)을 기준으로 하여 미국규격표준(USP)의 방법[10]에 따라 측정하였다. 단백질 정량은 표준물질로 bovine serum albumin을 사용하여 BCA 단백질 정량법[11]에 따라 수행하였다.

성능/효과

십이지장의 첨가와 반응조건이 돼지 췌장에서 추출한 판크레아틴 효소들의 활성화에 미치는 영향을 조사한 결과, 십이지장의 첨가는 췌장의 단백질분해효소와 지방분해효소의 활성화를 유도함을 확인하였다. 10%(w/w)의 십이지장을 첨가하여 30℃에서 90분간 반응시킨 실험군은 무첨가군에 비해 단백질분해효소의 활성이 약 3배 높게, 지방분해효소의 활성은 약 2배 높게 나타났다. 그러나 30℃에서는 지방분해효소가 불안정한 것으로 나타나 반응온도를 25℃로 낮춰 효소활성화를 시도하였다.
췌장액에 10%(w/w) 십이지장을 첨가하여 25℃에서 4시간 반응시켰을때 단백질분해효소의 활성화는 정점에 도달하였고, 지방분해효소와 전분분해효소의 활성도 높게 유지됨을 확인하였다. 25℃에서 4시간 동안의 효소활성화, 원심분리, 아세톤침전 및 동결건조의 연속공정으로 회수한 판크레아틴 효소들의 비활성도를 측정한 결과, 단백질분해효소 136 U/mg, 지방분해효소 116 U/mg 및 전분분해효소 400 U/mg으로 나타났다.
지방분해효소의 활성화는 십이지장의 첨가량에 따라 큰 차이를 보이지 않았다[그림 3B]. 30℃에서의 결과와 비교하여 보면, 25℃에서 지방분해효소의 활성은 최대 2,000 U/ml 정도 증가하였고, 시간이 지남에 따라 활성이 급격히 감소하는 현상도 나타나지 않았다. 이는 25℃에서 지방분해효소의 3차 구조가 안정적으로 유지되어 단백질분해효소의 공격에 의해 실활되지 않는다는 것을 의미[14]하므로 판크레아틴 효소 활성화에는 25℃의 온도가 적합함을 확인하였다.
그림 3A에서 보듯이 25℃에서 십이지장을 첨가하여 췌장의 효소를 활성화시켰을때 십이지장 첨가량을 1/5로 줄인 실험군에서는 단백질분해효소의 활성화가 50% 정도만 일어나, 십이지장 첨가량은 10%(w/w)가 효소활성화에 적합함을 알 수 있었다. 10%의 십이지장 첨가 시 25℃에서 단백질분해효소의 활성화는 4시간에 최대값에 도달하였다.
1%의 활성이 유지되었고, 비활성도는 400 U/mg으로 USP 기준의 16배의 활성을 보유하고 있었다[10]. 기존에 보고된 dichloro methane과 trichlorofluoro methane의 용매를 사용하여 회수한 판크레아틴의 단백질분해효소 200 U/mg, 지방분해 효소 58 U/mg 및 전분분해효소 140 U/mg의 비활성도[15]와 비교하였을 때, 십이지장을 첨가하여 최적화된 조건으로 제조한 판크레아틴의 단백질분해효소의 비활성도는 다소 낮지만 지방분해효소와 전분분해효소의 비활성도는 월등히 높게 나타났다.
판크레아틴 회수단계에 따른 효소활성과 수율을 표 1에 나타내었다. 단백질분해효소는 4시간 incubation에 의해 약 2.6배 활성화되었고, 활성화된 상태를 100%로 보았을 때 회수공정을 거치는 동안 56.0%의 단백질분해효소를 회수할 수 있었다. 동결건조 분말은 10 mg을 완충용액 1 ml에 녹여 활성을 측정한 것이기 때문에 단백질분해효소의 비활성도는 136 U/mg이고, 이는 USP 기준의 5.
십이지장의 첨가와 반응조건이 돼지 췌장에서 추출한 판크레아틴 효소들의 활성화에 미치는 영향을 조사한 결과, 십이지장의 첨가는 췌장의 단백질분해효소와 지방분해효소의 활성화를 유도함을 확인하였다. 10%(w/w)의 십이지장을 첨가하여 30℃에서 90분간 반응시킨 실험군은 무첨가군에 비해 단백질분해효소의 활성이 약 3배 높게, 지방분해효소의 활성은 약 2배 높게 나타났다.
그러나 30℃에서는 지방분해효소가 불안정한 것으로 나타나 반응온도를 25℃로 낮춰 효소활성화를 시도하였다. 췌장액에 10%(w/w) 십이지장을 첨가하여 25℃에서 4시간 반응시켰을때 단백질분해효소의 활성화는 정점에 도달하였고, 지방분해효소와 전분분해효소의 활성도 높게 유지됨을 확인하였다. 25℃에서 4시간 동안의 효소활성화, 원심분리, 아세톤침전 및 동결건조의 연속공정으로 회수한 판크레아틴 효소들의 비활성도를 측정한 결과, 단백질분해효소 136 U/mg, 지방분해효소 116 U/mg 및 전분분해효소 400 U/mg으로 나타났다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	판크레아틴이란 무엇인가?	판크레아틴(pancreatin)은 췌장의 외분비 세포에서 만들어진 후 십이지장으로 분비되어 음식물 분해에 작용하는 소화효소들의 복합체이다.
	판크레아틴은 어떤 성분 및 효소를 함유하고 있는가?	판크레아틴은 trypsin, chymotrypsin, elastase 및 carboxypeptidase A, B 등의 단백질분해효소(protease), 췌장 lipase와 phospholipase A2 등의 지방분해효소(lipase)와 전분분해효소(amylase)를 함유하고 있는 복합효소제로 소화제 등의 의약제제뿐만 아니라 식품제조용 첨가물로 식품산업에도 사용되어져 왔다[1,2]. 췌장의 소화효소가 직접 활성형의 상태로 분비되면 자체의 췌장 조직을 공격하여 췌장염 등을 일으킬 수 있기 때문에 단백질분해효소와 지방분해효소는 활성이 없는 전구체 형태로 만들어져 십이지장으로 분비된 후 활성화되어 소화를 돕는 작용을 한다.
	췌장에서 분비된 효소 중 소화효소가 직접적으로 분비되지 않는 이유는 무엇인가?	판크레아틴은 trypsin, chymotrypsin, elastase 및 carboxypeptidase A, B 등의 단백질분해효소(protease), 췌장 lipase와 phospholipase A2 등의 지방분해효소(lipase)와 전분분해효소(amylase)를 함유하고 있는 복합효소제로 소화제 등의 의약제제뿐만 아니라 식품제조용 첨가물로 식품산업에도 사용되어져 왔다[1,2]. 췌장의 소화효소가 직접 활성형의 상태로 분비되면 자체의 췌장 조직을 공격하여 췌장염 등을 일으킬 수 있기 때문에 단백질분해효소와 지방분해효소는 활성이 없는 전구체 형태로 만들어져 십이지장으로 분비된 후 활성화되어 소화를 돕는 작용을 한다. 췌장에서 분비된 효소들의 활성화는 그림 1과 같은데, 비활성형의 trypsinogen은 십이지장 내의 enterokinase에 의해 trypsin으로 활성화되며 trypsin은 다른 비활성형의 단백질 분해효소와 지방분해효소를 활성화시킴은 물론 다른 trypsinogen을 활성화시킴으로써 일련의 소화효소의 활성화를 가속시킨다[3-5].

참고문헌 (15)

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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