[국내논문]Proteomics를 이용한 고랭지 배추의 고온장해 해석 Proteomic Analyses of Chinese Cabbage(Brassica campestris L. pekinensis) Affected by High Temperature Stresses in Highland Cultivation During Summer in Korea원문보기
무더운 날씨가 지속됨으로서 고랭지배추의 생장 및 결구가 지연되고 있는 강원도 정선군 질운산(새빗재)의 600 m와 900 m의 배추를 사용하여 무기성분 및 단백질 발현패턴을 분석하였다. 식물체 무기성분에서는 생장에 관련된 질소 및 인산의 부족현상과 결구에 관련된 칼슘이 부족하였다. 단백체 분석은 2차원 전기영동에 의해 전체 126개의 단백질이 분리되었고 그중 48개의 단백질이 고도에 따라 변화하는 양상을 보여주었다. 이 중에서 30개의 단백질 서열이 결정되었는데, 해발 900 m에서 단백질 발현이 증가한 14개 중에서 oxygen- evolving proteins, rubisco activase and ATPase 등이, 해발 600 m에서는 glutathione S-transferase (1, 28 kD cold induced- and 24kD auxin-binding proteins) and salt-stress induced protein 등 16개의 단백질 발현이 증가하였다. 이러한 단백질은 식물체 손상에 대한 보호기작을 가진 스트레스관련 단백질로 가뭄, 온도상승, 밤낮의 온도차 등의 반복으로 복합적이며 동시 다발적으로 나타나는 고온장해 현상으로 사료된다.
무더운 날씨가 지속됨으로서 고랭지배추의 생장 및 결구가 지연되고 있는 강원도 정선군 질운산(새빗재)의 600 m와 900 m의 배추를 사용하여 무기성분 및 단백질 발현패턴을 분석하였다. 식물체 무기성분에서는 생장에 관련된 질소 및 인산의 부족현상과 결구에 관련된 칼슘이 부족하였다. 단백체 분석은 2차원 전기영동에 의해 전체 126개의 단백질이 분리되었고 그중 48개의 단백질이 고도에 따라 변화하는 양상을 보여주었다. 이 중에서 30개의 단백질 서열이 결정되었는데, 해발 900 m에서 단백질 발현이 증가한 14개 중에서 oxygen- evolving proteins, rubisco activase and ATPase 등이, 해발 600 m에서는 glutathione S-transferase (1, 28 kD cold induced- and 24kD auxin-binding proteins) and salt-stress induced protein 등 16개의 단백질 발현이 증가하였다. 이러한 단백질은 식물체 손상에 대한 보호기작을 가진 스트레스관련 단백질로 가뭄, 온도상승, 밤낮의 온도차 등의 반복으로 복합적이며 동시 다발적으로 나타나는 고온장해 현상으로 사료된다.
High temperature stresses have caused growth inhibition and delayed heading in highland cultivation Chinese cabbage during summer in Korea. We have studied high temperature stress responses in the terms of changes of inorganic components and proteins by proteomic analyses. Insufficiencies of nitroge...
High temperature stresses have caused growth inhibition and delayed heading in highland cultivation Chinese cabbage during summer in Korea. We have studied high temperature stress responses in the terms of changes of inorganic components and proteins by proteomic analyses. Insufficiencies of nitrogen and phosphorus have affected growth rate and calcium deficiency has caused blunted heading. Proteins extracted from Brassica seedling grown at the altitude of 600m and 900m in the Mount Jilun were extracted and analysed by 2-dimentional polyacrylamide gel electrophoresis. Profiles of protein expression was then analyzed by 2-dimentional gel analyses. Protein spots showing different expression level were picked using the spot handling workstation and subjected to MALDI-TOF MS. Total 48 protein spots were analyzed by MALDI-TOF MS and 30 proteins spots out of 48 were identified by peptide mass fingerprinting analyses. Fourteen proteins were up-regulated in extracts from the altitude of 900m and they were identified as oxygen-evolving proteins, rubisco activase and ATPase etc. Sixteen proteins were up-regulated in extracts from the altitude of 600m and they were identified as glutathione S-transferase(1, 28kD cold induced- and 24 kD auxin-binding proteins) and salt-stress induced protein etc. These stress-induced proteins were related to the mediated protective mechanism against oxidative damage during various stresses. The results indicated that physiological phenomenon in response to high temperature stresses might be resulted by complex and multiple array of responses with drought, heat, oxidative, salt, and cold by high temperature.
High temperature stresses have caused growth inhibition and delayed heading in highland cultivation Chinese cabbage during summer in Korea. We have studied high temperature stress responses in the terms of changes of inorganic components and proteins by proteomic analyses. Insufficiencies of nitrogen and phosphorus have affected growth rate and calcium deficiency has caused blunted heading. Proteins extracted from Brassica seedling grown at the altitude of 600m and 900m in the Mount Jilun were extracted and analysed by 2-dimentional polyacrylamide gel electrophoresis. Profiles of protein expression was then analyzed by 2-dimentional gel analyses. Protein spots showing different expression level were picked using the spot handling workstation and subjected to MALDI-TOF MS. Total 48 protein spots were analyzed by MALDI-TOF MS and 30 proteins spots out of 48 were identified by peptide mass fingerprinting analyses. Fourteen proteins were up-regulated in extracts from the altitude of 900m and they were identified as oxygen-evolving proteins, rubisco activase and ATPase etc. Sixteen proteins were up-regulated in extracts from the altitude of 600m and they were identified as glutathione S-transferase(1, 28kD cold induced- and 24 kD auxin-binding proteins) and salt-stress induced protein etc. These stress-induced proteins were related to the mediated protective mechanism against oxidative damage during various stresses. The results indicated that physiological phenomenon in response to high temperature stresses might be resulted by complex and multiple array of responses with drought, heat, oxidative, salt, and cold by high temperature.
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제안 방법
)를 이용하였고, 각 spot의 quantity는 대조군에 비해 두 배 이상의 발현변화를 보여주는 단백질 spots을 선정하였다. 단백질 spotse Shevchenko 등[16, 17]의 방법에 따라 modified porcine trypsin을 이용하여 작은 단편으로 효소적으로 분해하여 CisZipTips(MilHpore)을 사용하여 탈염 및 농축한 후 질량분석을 위해 target plate 위에 적하하였다. 질량분석기는 Ettan MALDI-TOF (Amersham Biosciences Co) 를 사용하여 Target plate 상에 적하되어 있는 단백질 단편들을 mass spectrum으로 분석한 후 ProFound 검색엔진[6]을 이용하여 단백질을 동정하였다.
식물체는 온도상승에 반응하여 스트레스관련 단백질의 급격한 변화가 일어나는 데, heat shock protein[15], ATPase[8], Glutathione S-trans-ferase[3, 9] 등의 단백질이 발현된다고 알려져 있다. 따라서 본 실험에서는 표고 600m와 900m에서 배추시료를 채취하여 proteomics를 이용하여 단백질 발현양상과 무기성분 함량분석을 통하여 고랭지 여름배추의 온도상승에 따른 고온장해 원인을 해석하였다.
액화질소 하에 막자사발로 분쇄하였다. 분쇄된 재료 1 g를 Tris-HCl(pH 6.8)에 혼합하여 혼합액의 다섯배 부피의 아세톤(v/v)을 가한 다음 -20℃에서 2시간 침전시켜 원심분리한 침전물에 전기영동용액(7 M urea, 2 M thiourea, 4%(w/v) CHAPS, l%(w/v) DTT, 2%(v/v) pharmalyte, ImM benzamidine)에 녹여 -20℃에 보관하여 이차원 전기영동 시료로 사용하였다. 단백질의 농도측정은 Bradford[2]법으로 분석하였다.
완료된 이차원 gele Oakley 등[14]의 방법으로 silver 염색한 후 스캐닝하여 컴퓨터에 저장하였다. 스캐닝된 단백질 spots의 발현변화확인을 위한 정량적인 분석은 PDQuest software (BioRad Co.)를 이용하였고, 각 spot의 quantity는 대조군에 비해 두 배 이상의 발현변화를 보여주는 단백질 spots을 선정하였다. 단백질 spotse Shevchenko 등[16, 17]의 방법에 따라 modified porcine trypsin을 이용하여 작은 단편으로 효소적으로 분해하여 CisZipTips(MilHpore)을 사용하여 탈염 및 농축한 후 질량분석을 위해 target plate 위에 적하하였다.
)을 이용하여 상온에서 IEF를 수행하였다. 이차적으로 전기영동을 수행하기 위해 IPG Strips을 1% DTT를 함유한 equilibration buffer(50 mM Tris-Cl, pH6.8, 6 M urea, 2% SDS, 30% glycerol) 로 10 분간 incubation 한 후 DALT 2D system Amersham Biosciences Co)을 이용하였다. 완료된 이차원 gele Oakley 등[14]의 방법으로 silver 염색한 후 스캐닝하여 컴퓨터에 저장하였다.
단백질의 농도측정은 Bradford[2]법으로 분석하였다. 일차적으로 등전점 전기영동(IEF)을 위하여 IPG strips를 전기영동용액(7 M urea, 2 M thiourea, 2% CHAPS, 1% DIT, 1% pharmalyte)에 상온에서 12-16시간 정도 reswelling하였고, Strip당 시료는 200 昭를 사용하여 Multiphore II system (Amersham Biosciences Co.)을 이용하여 상온에서 IEF를 수행하였다. 이차적으로 전기영동을 수행하기 위해 IPG Strips을 1% DTT를 함유한 equilibration buffer(50 mM Tris-Cl, pH6.
단백질 spotse Shevchenko 등[16, 17]의 방법에 따라 modified porcine trypsin을 이용하여 작은 단편으로 효소적으로 분해하여 CisZipTips(MilHpore)을 사용하여 탈염 및 농축한 후 질량분석을 위해 target plate 위에 적하하였다. 질량분석기는 Ettan MALDI-TOF (Amersham Biosciences Co) 를 사용하여 Target plate 상에 적하되어 있는 단백질 단편들을 mass spectrum으로 분석한 후 ProFound 검색엔진[6]을 이용하여 단백질을 동정하였다.
대상 데이터
고랭지 여름배추의 고온장해 원인을 구명하기 위하여 2004년 8월 13일 강원도 정선군 질운산의 고랭지 채소단지에서 표고별로 배추시료를 채취하여 현장에서 액화질소를 이용하여 시료를 준비하였다. 식물체의 무기성분 함량분석은토양 및 식물체 분석법μ2]에 의해 산가수분해액 HC1O4 + H2SO4 용액으로 분해하여 질소는 micro-kjeldahl 증류법, 인산은 ammonium metavanadate에 의한 비색법으로 분석하였고, 양이온은 Inductively coupled plasma spectrometer ICP)로 측정하였다.
이론/모형
8)에 혼합하여 혼합액의 다섯배 부피의 아세톤(v/v)을 가한 다음 -20℃에서 2시간 침전시켜 원심분리한 침전물에 전기영동용액(7 M urea, 2 M thiourea, 4%(w/v) CHAPS, l%(w/v) DTT, 2%(v/v) pharmalyte, ImM benzamidine)에 녹여 -20℃에 보관하여 이차원 전기영동 시료로 사용하였다. 단백질의 농도측정은 Bradford[2]법으로 분석하였다. 일차적으로 등전점 전기영동(IEF)을 위하여 IPG strips를 전기영동용액(7 M urea, 2 M thiourea, 2% CHAPS, 1% DIT, 1% pharmalyte)에 상온에서 12-16시간 정도 reswelling하였고, Strip당 시료는 200 昭를 사용하여 Multiphore II system (Amersham Biosciences Co.
8, 6 M urea, 2% SDS, 30% glycerol) 로 10 분간 incubation 한 후 DALT 2D system Amersham Biosciences Co)을 이용하였다. 완료된 이차원 gele Oakley 등[14]의 방법으로 silver 염색한 후 스캐닝하여 컴퓨터에 저장하였다. 스캐닝된 단백질 spots의 발현변화확인을 위한 정량적인 분석은 PDQuest software (BioRad Co.
성능/효과
고온장해 배추의 단백질 발현패턴을 분석하기위해 Fig. 1 의 2-DE gel과 같이 전체 127개의 단백 질이 반복실험하여 분리되었고, 그 중 48개의 단백질이 고도에 따라 변화하는 양상을 보여주고 있으며 표고 900 m에서 발현이 14개, 600 m 에서 16개의 단백질 발현이 높게 나타났으며 발현정도를 비교해보면 일반적으로 600m에서 더 강하게 발현되었다.
이러한 30개의 단백질 spots를 Table 2과 같이 단백질 서열을 결정하였고, 또한 기능적으로 Fig. 2와 같이 분석한 결과 Salt 37%, oxidative 13%, heat 10%, cold 10% 등으로 나타나 일반적으로 알려져 있는 고온장해와 일치하며 각종 stress 관련 단백질이 복합적으로 나타났다.
표고 600 m 및 900 m에서 고랭지 여름배추를 채취한 후산 분해하여 식물체의 무기성분을 Table 1와 같이 조사한 결과 질소함량은 고도에 따른 함량차이는 없지만 최적 범위보다 낮게 나타났고, 석회함량도 낮게 나타났다.
참고문헌 (18)
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