[논문]아카풀코나리에서 Differential Slot Blot을 이용한 약발현 유전자 목록작성

서은정; 유희주; 한봉희; 임용표; 정미정; 이성곤; 김동헌; 장안철; 예병우

doi:10.7235/hort.2013.12225

[국내논문] 아카풀코나리에서 Differential Slot Blot을 이용한 약발현 유전자 목록작성
Cataloguing of Anther Expressed Genes through Differential Slot Blot in Oriental Lily (Lilium Oriental Hybrid 'Acapulco') 원문보기

원예과학기술지 = Korean journal of horticultural science & technology, v.31 no.5, 2013년, pp.598 - 606

서은정 (농촌진흥청 국립농업과학원 농업생명자원부) , 유희주 (가톨릭대학교 생명과학과) , 한봉희 (농업기술실용화재단 종자사업팀) , 임용표 (충남대학교 원예학과) , 정미정 (농촌진흥청 국립농업과학원 농업생명자원부) , 이성곤 (농촌진흥청 국립농업과학원 농업생명자원부) , 김동헌 (농촌진흥청 국립농업과학원 농업생명자원부) , 장안철 (농촌진흥청 국립농업과학원 농업생명자원부) , 예병우 (농촌진흥청 국립원예특작과학원 화훼과)

초록
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약은 생식과 화형을 결정짓는 꽃의 주요한 기관 중 하나이다. 오리엔탈나리인 아카풀코로부터 만든 약 특이적 cDNA library로부터 2000개의 ESTs를 무작위로 선발하였다. 잎과 약을 cDNA 탐침으로 이용한 differential slot blot이 약에서 발현되는 클론들을 얻기 위해 사용되었으며 570개의 비반복적 ESTs를 얻었고 염기서열분석을 하였다. BLASTX 알고리즘을 이용하여 GenBank에 비교해서 191개의 클론이 의미 있는 유사성을 보였지만 나머지(66.5%)는 기존에 보고된 염기서열에 확인되지 않았다. Gene ontology(GO) annotation에 따른 기능분류결과 대체적으로 세포와 세포구성 부분에서 주요하게 단백질이 확인되었다. 7개의 다른 기관과 발달 단계에서 전사체 분석은 약특이적일 적으로 추정되는 30개의 클론을 가지고 노던혼성화반응을 이용하여 수행하였다. 이러한 결과는 differential slot blot을 이용하여 약에 발현되는 유전자를 선별하는 것이 매우 효과적인 방법인 것으로 간주되며 또한 지금의 연구가 앞으로 나리의 화분을 포함한 약에 대한 기초정보를 제공할 수 있을 것으로 생각한다.

Abstract ▼ AI-Helper

Anther is the major organ of flower in responsible to reproduction and outward appearance. From anther-specific cDNA library of Lilium Oriental Hybrid 'Acapulco', 2000 expressed sequence tags were selected randomly. Differential slot blot analysis with cDNA probes from the anther and leaf was used to get anther-expressed clone and 570 non-redundant ESTs were obtained and sequenced. Compared to the GenBank database using BLASTX algorithm, 191 clones showed significant similarity but others (66.5%) did not measured to known sequence. Functional categories according to gene ontology (GO) annotation included sequence representing a significant portion of protein in cell and cell part respectively. A transcriptional analysis at 7 different organs and developmental stage was performed using northern blot with thirty ESTs as putative anther specific gene. This report suggest that selection of anther expressed clone using differential slot blot was considered as very effective tool and our current study can provide fundamental information on the lily anther including pollen furthermore.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 나리 약에서 발현되는 유전자의 cDNA library를 differential slot blot 방법을 통해 약에서 주로 발현되는 ESTs 클론을 모아 유전정보를 수집하고 이 중 약에서만 발현되는 유전자를 찾아 이에 대한 특성을 구명하고자 하였다. 본 실험 결과로 얻어진 ESTs는 게놈 크기가 큰 작물의 게놈 연구를 위한 기초 자료가 될 수 있으며 또한 향후 유전육종 시 나리의 형질개량(개약, 내병성, 화색 등)을 위한 기초적인 자료를 마련하는 계기가 될 것으로 보인다.

제안 방법

(1977)의 방법에 따라 T3 primer(5'-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3')로 DNA sequencing kit version 2.0(USB)을 사용하였으며 자동 염기서열은 플라스미드 DNA를 T3 primer(5'-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3')와 DNA sequencing kit(BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing Ready reaction, PE Applied Biosystems, USA)로 염기서열 결정을 위한 PCR 반응 후 100% 에탄올과 sodium acetate를 이용하여 정제한 다음 ABI prism 310 genetic Analyzer(PE Applied Biosystems, USA)로 분석하여 부분적인 염기서열을 얻었다.
520개의 비반복적인 ESTs의 기능별 분류를 위해서 Gene Ontology(GO) annotation(Du et al., 2010) 사용하여 세 가지 category(biological process, molecular function, cellular component)로 분류하였다(Fig. 2). GO annotation은 애기장대 게놈을 기반으로 한 TAIR GO slim을 이용하여 분석하는 방법으로 사용한 cut-off는 FDR(False Discovering Rate)값 0.
Gene ontology(GO) annotation에 따른 기능분류결과 대체적으로 세포와 세포구성 부분에서 주요하게 단백질이 확인되었다. 7개의 다른 기관과 발달 단계에서 전사체 분석은 약특이적일 적으로 추정되는 30개의 클론을 가지고 노던혼성화반응을 이용하여 수행하였다. 이러한 결과는 differential slot blot을 이용하여 약에 발현되는 유전자를 선별하는 것이 매우 효과적인 방법인 것으로 간주되며 또한 지금의 연구가 앞으로 나리의 화분을 포함한 약에 대한 기초정보를 제공할 수 있을 것으로 생각한다.
DNA 표지는 RediprimeTM II DNA labeling system(Amersham pharmacia)을 이용하여 제조회사의 지침에 따라 [α- 32P] dCTP로 표지한 다음 Probe Quant G-50 Micro columns(Amersham Pharmacia)을 이용하여 표지된 DNA만을 분리하였다.
감압을 제거한 다음 나일론 막을 빼내 2X SSC에 씻어서 건조시켰다. Differential slot blot을 위한 혼성화 반응을 위한 탐침은 아카풀코 나리의 약(전 발달단계)와 잎으로부터 분리한 총 RNA로 만든 first-strand cDNA를 이용하였다. 혼성화 반응 후 X-ray 필름(Agfa)에 감광된 영상을 이용하여 두 종류의 탐침에 대해 발현에 크게 차이 나는 ESTs (○) 200개, 발현에 차이가 적은 ESTs (◇) 447개를 선발하였다.
Differential slot blot을 통해 선별한 클론 중 약에서만 발현될 것으로 추정되는 30개 약 발현 유전자를 선발하여 약을 포함한 타 기관에서의 발현양상을 확인하기 위해서 잎(leaf), 화피(tepal), 암술(stigma), 자방(ovary), 수술대(filament), 화분을 포함한 약(anther), 만개한 꽃의 약으로부터 분리한 화분(pollen)으로부터 총 RNA를 분리한 다음 30개의 약 특이 발현 유전자를 각각 탐침으로 하여 혼성화 반응을 수행하였다(Fig. 3). 혼성화 반응 결과 30개의 약 특이 발현 유전자는 다른 기관에서는 전혀 발현되지 않았고 ALAa27 등 26개의 유전자는 약과, 만개한 꽃의 약으로부터 추출한 화분에서 발현을 하였으며 ALAa9, ALAa86, ALAa608, ALAb846은 약에서만 발현되는 것을 확인할 수 있었다.
(1977)의 방법에 따라 수동염기서열 분석을 수행하였으며 발현의 차이가 적었던 447개의 ESTs 클론은 ABI prism 310 genetic analyzer(PE Applied Biosystems, USA)를 이용하여 자동염기서열로 분석하였다. ESTs 염기서열은 벡터 부위를 수동이나 프로그램으로 제거한 다음 BLASTX로 분석하였다. Differential slot blot의 발현 차이로 선발한 647개의 약 ESTs 중 수동 및 자동염기서열을 통해 염기서열을 얻을 수 있었던 ESTs 클론의 개수는 570개로 평균 염기서열은 356bp였다(Table 1).
4 × 10⁶ pfu였다. 무작위로 선택한 2000개 ESTs의 플라스미드 DNA를 추출하여 각각의 클론에 이름을 부여한 다음(재료 및 방법 참조) 동일한 양이 되게 희석하여 differential slot blot에 사용하였다. 잎과 약으로부터 합성한 first-strand cDNA를 탐침으로한 혼성화 반응결과 두 종류의 탐침에 대해 발현에 크게 차이 나는 ESTs(○), 발현에 차이가 적은 ESTs(◇), 약과 잎에 둘 다 발현되는 ESTs(□)으로 분류하였다(Fig.
약 발현 유전자 30개의 발달단계에 따른 발현양상을 조사 하기 위해서 5cm, 9cm, 11cm 꽃봉오리 및 만개한 꽃의 약으로부터 총 RNA를 분리하여 30개 약 발현 유전자 각각을 탐침으로 하여 혼성화 반응을 수행하였다(Fig. 4). 발달별 발현양상은 ALAa27 등(ALAa 87, 779, 930, ALAb424, 425, 494, 505, 796, 865) 10개의 유전자가 9cm부터 개화 시까지 지속적으로 발현이 증가하였으며 ALAa195 등(ALAa328, 333, 354, 397, 442, ALAb164, 315, 440, 491, 837, 920)은 9cm까지는 거의 발현하지 않다가 11cm 발달 단계에서 발현이 시작되어서 개약까지 유지되는 유전자로 확인되었다.
약 발현 클론에 대한 RNA 발현분석을 위해 탐침으로 사용할 cDNA 클론은 XbaI/XhoI으로 절단하여 전기영동한 후, Ultra clean 15^TM(MoBio, USA)를 사용하여 cDNA 절편 부분만을 분리한여 사용하였다. DNA 표지는 Rediprime^TM II DNA labeling system(Amersham pharmacia)을 이용하여 제조회사의 지침에 따라 [α- ³²P] dCTP로 표지한 다음 Probe Quant G-50 Micro columns(Amersham Pharmacia)을 이용하여 표지된 DNA만을 분리하였다.
염기서열분석을 위해 선별된 플라스미드 DNA는 350μL TE(Tris-EDTA) 버퍼를 더한 후 400μL의 polyethylene glycol 용액(13% PEG, 2.5 M NaCl)을 처리하여 얼음에 10분간 두었다.
, 2006)인 것만 서로 유사성이 있는 것으로 인정하였다. 유전자들의 functional category를 분류하기 위해서 애기장대 데이터 베이스인 Agrigio(http://bioinfo. cau.edu.cn/agriGO/index.php)에서 지시하는 대로 분석을 하고 기능별로 분류하였다.
무작위로 선택한 2000개 ESTs의 플라스미드 DNA를 추출하여 각각의 클론에 이름을 부여한 다음(재료 및 방법 참조) 동일한 양이 되게 희석하여 differential slot blot에 사용하였다. 잎과 약으로부터 합성한 first-strand cDNA를 탐침으로한 혼성화 반응결과 두 종류의 탐침에 대해 발현에 크게 차이 나는 ESTs(○), 발현에 차이가 적은 ESTs(◇), 약과 잎에 둘 다 발현되는 ESTs(□)으로 분류하였다(Fig. 1). 약 발현 ESTs를 선별하기 위해서 약과 잎에서 둘 다 발현되는 ESTs(□)를 배제하고, 약에서 주로 발현될 것으로 보이는 ESTs(◇) 447개와 약에서만 발현될 것으로 추정되는 ESTs (○) 200개를 합하여 총 647개의 클론을 선발하였다.
오리엔탈나리인 아카풀코로부터 만든 약 특이적 cDNA library로부터 2000개의 ESTs를 무작위로 선발하였다. 잎과 약을 cDNA 탐침으로 이용한 differential slot blot이 약에서 발현되는 클론들을 얻기 위해 사용되었으며 570개의 비반복적 ESTs를 얻었고 염기서열분석을 하였다. BLASTX 알고리즘을 이용하여 GenBank에 비교해서 191개의 클론이 의미 있는 유사성을 보였지만 나머지(66.
약 cDNA library는 시기별 약으로부터 추출한 Poly(A)⁺ RNA를 이용하여 Gubler and Hoffman(1983)의 방법에 따라 일차로 합성하였으며 Uni-ZAP XR 벡터 DNA를 사용한 packaging은 Gigapack III packing Extract(Stratagene, Santa Clara, USA)로 제조회사의 지침에 따라 수행하였다. 제조한 cDNA library의 총 pfu(plaque forming unit)는 cDNA library 원액을 10^-2에서부터 10^-6까지 희석하여 얻은 pfu로부터 계산하였다. Uni-ZAP XR 벡터로부터 pBluescript II SK(+) 파아지미드로의 mass in vivo excision을 수행하기 위한 숙주세포로는 대장균 균주 XL1-Blue MRF를 사용하였고 단일 클론을 얻기 위한 파아지미드의 숙주세포로는 대장균 균주 SOLR를 사용하였다.
나리 전 발달단계의 약으로부터 만들어진 cDNA library로부터 무작위적으로 2000개의 cDNA 클론을 선발하였고 각각의 이름은 1-1000번까지의 클론은 Acapulco Lily의 첫 자와 알파벳(Aa, Ab, Ac, …)을 이용하여 ALAa1-1000, 1001-2000번까지의 클론은 ALAb1-1000으로 명명하였다. 추출한 플라스미드 cDNA 2000개를 각각 2set씩 다음과 같이 제작하여 약에서 발현되는 유전자 선별을 위한 혼성화 반응에 이용하였다. Blotting에 사용한 시료는 1μg･μL^-1로 희석한 약의 플라스미드 DNA 1μL에 멸균수 399μL를 더한 다음 4N NaOH를 50μL, 100mM EDTA(pH 8.

대상 데이터

제조한 cDNA library의 총 pfu(plaque forming unit)는 cDNA library 원액을 10^-2에서부터 10^-6까지 희석하여 얻은 pfu로부터 계산하였다. Uni-ZAP XR 벡터로부터 pBluescript II SK(+) 파아지미드로의 mass in vivo excision을 수행하기 위한 숙주세포로는 대장균 균주 XL1-Blue MRF를 사용하였고 단일 클론을 얻기 위한 파아지미드의 숙주세포로는 대장균 균주 SOLR를 사용하였다.
나리 전 발달단계의 약으로부터 만들어진 cDNA library로부터 무작위적으로 2000개의 cDNA 클론을 선발하였고 각각의 이름은 1-1000번까지의 클론은 Acapulco Lily의 첫 자와 알파벳(Aa, Ab, Ac, …)을 이용하여 ALAa1-1000, 1001-2000번까지의 클론은 ALAb1-1000으로 명명하였다.
본 실험에 사용한 아카풀코 나리(Lilium Oriental Hybrid ‘Acapulco’)는 Netherland Bulb Company(USA, Easton Pennsylvania)에서 구매하였으며 구의 직경이 16-18cm 되는 것을 피트모스와 펄라이트를 섞은 상토에 심어 국립원예특작과학원 온실에서 15-25°C로 재배하였다.
본 실험에 사용한 아카풀코 나리(Lilium Oriental Hybrid ‘Acapulco’)는 Netherland Bulb Company(USA, Easton Pennsylvania)에서 구매하였으며 구의 직경이 16-18cm 되는 것을 피트모스와 펄라이트를 섞은 상토에 심어 국립원예특작과학원 온실에서 15-25°C로 재배하였다. 약 cDNA library 제작에 사용한 나리의 시료는 꽃봉오리 크기가 5cm, 9cm, 11cm, 그리고 개화한 꽃의 약을 채취하여 사용하였다.
1). 약 발현 ESTs를 선별하기 위해서 약과 잎에서 둘 다 발현되는 ESTs(□)를 배제하고, 약에서 주로 발현될 것으로 보이는 ESTs(◇) 447개와 약에서만 발현될 것으로 추정되는 ESTs (○) 200개를 합하여 총 647개의 클론을 선발하였다.
0(USB)을 사용하였으며 자동 염기서열은 플라스미드 DNA를 T3 primer(5'-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3')와 DNA sequencing kit(BigDye^TM Terminator Cycle Sequencing Ready reaction, PE Applied Biosystems, USA)로 염기서열 결정을 위한 PCR 반응 후 100% 에탄올과 sodium acetate를 이용하여 정제한 다음 ABI prism 310 genetic Analyzer(PE Applied Biosystems, USA)로 분석하여 부분적인 염기서열을 얻었다. 염기서열에서 ORF(open reading frame) 추정 및 유사 유전자와의 아미노산 비교에는 Lasergene(DNASTAR Inc.)을 이용하였으며 염기서열의 확인은 BLASTX algorithm을 이용하여 기능을 추정하고 확인된 cDNA는 GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)에 등록하여 accession number를 받았다(CF651029- CF651218, DW717821- DW718195). cDNA의 염기서열확인은 E-value 값이 10^-4 이하(Cho et al.
약은 생식과 화형을 결정짓는 꽃의 주요한 기관 중 하나이다. 오리엔탈나리인 아카풀코로부터 만든 약 특이적 cDNA library로부터 2000개의 ESTs를 무작위로 선발하였다. 잎과 약을 cDNA 탐침으로 이용한 differential slot blot이 약에서 발현되는 클론들을 얻기 위해 사용되었으며 570개의 비반복적 ESTs를 얻었고 염기서열분석을 하였다.
표지된 탐침 DNA는 95°C에서 5분간 가열하여 변성시킨 후 실험에 사용하였다.
Differential slot blot을 위한 혼성화 반응을 위한 탐침은 아카풀코 나리의 약(전 발달단계)와 잎으로부터 분리한 총 RNA로 만든 first-strand cDNA를 이용하였다. 혼성화 반응 후 X-ray 필름(Agfa)에 감광된 영상을 이용하여 두 종류의 탐침에 대해 발현에 크게 차이 나는 ESTs (○) 200개, 발현에 차이가 적은 ESTs (◇) 447개를 선발하였다.

이론/모형

약 발현 ESTs 중 발현에 크게 차이가 나서 약에서만 발현될 것으로 추측되는 200개의 ESTs는 플라스미드 DNA를 추출하여 PEG로 정제한 다음 Sanger et al.(1977)의 방법에 따라 수동염기서열 분석을 수행하였으며 발현의 차이가 적었던 447개의 ESTs 클론은 ABI prism 310 genetic analyzer(PE Applied Biosystems, USA)를 이용하여 자동염기서열로 분석하였다. ESTs 염기서열은 벡터 부위를 수동이나 프로그램으로 제거한 다음 BLASTX로 분석하였다.
cDNA library 제작 및 screening에 사용한 총 RNA는 Verwoerd et al.(1989)의 hot phenol 방법을 이용하여 분리하였으며 Poly(A)⁺ RNA는 식물체의 총 RNA로부터 Quickprep Micro mRNA purification kit(Amersham Pharmacia, Pittsburgh, USA)를 이용하여 지침에 따라 분리하였다. 약 cDNA library는 시기별 약으로부터 추출한 Poly(A)⁺ RNA를 이용하여 Gubler and Hoffman(1983)의 방법에 따라 일차로 합성하였으며 Uni-ZAP XR 벡터 DNA를 사용한 packaging은 Gigapack III packing Extract(Stratagene, Santa Clara, USA)로 제조회사의 지침에 따라 수행하였다.
약 특이 발현을 확인하기 위한 Northern 혼성화 반응은 식물체 기관(잎, 화피, 암술, 자방, 수술대, 약, 화분)및 발달단계별(5cm, 9cm, 11cm, 개화한 꽃의 약)로부터 총 RNA를 분리하여 Sambrook et al.(1989)의 방법에 따라 수행하였다.
박테리아로부터 플라스미드 DNA는 알칼리 융해방법(Birnboim et al., 1979)을 사용하여 분리하였다. 염기서열분석을 위해 선별된 플라스미드 DNA는 350μL TE(Tris-EDTA) 버퍼를 더한 후 400μL의 polyethylene glycol 용액(13% PEG, 2.
(1989)의 hot phenol 방법을 이용하여 분리하였으며 Poly(A)⁺ RNA는 식물체의 총 RNA로부터 Quickprep Micro mRNA purification kit(Amersham Pharmacia, Pittsburgh, USA)를 이용하여 지침에 따라 분리하였다. 약 cDNA library는 시기별 약으로부터 추출한 Poly(A)⁺ RNA를 이용하여 Gubler and Hoffman(1983)의 방법에 따라 일차로 합성하였으며 Uni-ZAP XR 벡터 DNA를 사용한 packaging은 Gigapack III packing Extract(Stratagene, Santa Clara, USA)로 제조회사의 지침에 따라 수행하였다. 제조한 cDNA library의 총 pfu(plaque forming unit)는 cDNA library 원액을 10^-2에서부터 10^-6까지 희석하여 얻은 pfu로부터 계산하였다.

성능/효과

그 결과 520개의 ESTs 중 TAIR(The Arabidopsis Information Resource)와 서로 유사한 클론은 총 119개로 나머지 402개는 애기장대의 어떤 유전자와도 일치하지 않았다. 119개의 클론을 가지고 기능별 분류결과 biological process에서는 33개의 세부카테고리에 골고루 분포되어 있었는데 특히 macromolecule metabolic process, cellular macromolecule metabolic process, response to stimulus에 관련된 유전자들이 주로 분포하는 것으로 확인되었다. Molecular function 카테고리에서는 주로 protein binding이나 transferase activity 관련 효소들이 발현되었다.
Differential slot blot의 발현 차이로 선발한 647개의 약 ESTs 중 수동 및 자동염기서열을 통해 염기서열을 얻을 수 있었던 ESTs 클론의 개수는 570개로 평균 염기서열은 356bp였다(Table 1). 570개의 ESTs를 BLASTX 프로그램을 이용한 분석 결과 기능추정이 가능한 클론은 191개로 전체 EST 중 약 33.5%의 클론이 GenBank에서 확인되었다. 그 외에 hypothetical protein이 121개, predicted protein이 36개, unknown으로 확인된 클론이 34개 등으로 의미있는 유의성을 보이지 않는 클론이 전체의 약 66.
5%로 확인되었다(Supplemental table). 570개의 약 발현 ESTs를 모아 ESTs 내에서 반복성을 조사하였는데, 200bp 이상 염기서열을 분석한 ESTs에 대해 일치도를 비교하여 70% 이상 100% 이하의 일치도를 보이는 경우에 동일한 EST로 판단하였으며(Hays et al., 2001) 그 결과 비반복적인 것으로 확인된 ESTs는 총 520개로 확인되었다(Table 1).
본 실험에 사용한 아카풀코 나리는 봉오리가 11cm 정도가 되면 약의 색깔이 노랑에서 벽돌 색으로 전환되는 시기로서 약 내에서도 급격한 변화가 있을 것으로 추정된다. ALAa195 등과 같이 11cm에서 발현을 시작해서 개약까지 발현되는 클론들을 살펴보면 기능추정이 안 되는 몇몇 유전자가 있기는 하나 actin(ALAa354), 백합에서 보고된 plasma membrane H⁺-ATPase(ALAa333), LGC1(Lilium generative cell, ALAb315), pectinmethylesterase inhibitor(ALAb 440, 491), male gametic cell-specific histone H2A(ALAb837), putative LIM domain protein PLIM-2 (ALAb920)으로 확인되었다(Table 3). 이러한 유전자들은 주로 후반기 화분발달에 관여하는 유전자로 추정되는데 실제로 plasma membrane H⁺-ATPase는 약에서 화분립의 발아에 관여하여 화분관 신장시 필요한 이온의 유입이나 영양분, 수분을 조절해서 화분관 원형질 막을 강화해 주는 역할을 한다(Fejjo et al.
ESTs 염기서열은 벡터 부위를 수동이나 프로그램으로 제거한 다음 BLASTX로 분석하였다. Differential slot blot의 발현 차이로 선발한 647개의 약 ESTs 중 수동 및 자동염기서열을 통해 염기서열을 얻을 수 있었던 ESTs 클론의 개수는 570개로 평균 염기서열은 356bp였다(Table 1). 570개의 ESTs를 BLASTX 프로그램을 이용한 분석 결과 기능추정이 가능한 클론은 191개로 전체 EST 중 약 33.
05 이하를 기준으로 하였다. 그 결과 520개의 ESTs 중 TAIR(The Arabidopsis Information Resource)와 서로 유사한 클론은 총 119개로 나머지 402개는 애기장대의 어떤 유전자와도 일치하지 않았다. 119개의 클론을 가지고 기능별 분류결과 biological process에서는 33개의 세부카테고리에 골고루 분포되어 있었는데 특히 macromolecule metabolic process, cellular macromolecule metabolic process, response to stimulus에 관련된 유전자들이 주로 분포하는 것으로 확인되었다.
5%의 클론이 GenBank에서 확인되었다. 그 외에 hypothetical protein이 121개, predicted protein이 36개, unknown으로 확인된 클론이 34개 등으로 의미있는 유의성을 보이지 않는 클론이 전체의 약 66.5%로 확인되었다(Supplemental table). 570개의 약 발현 ESTs를 모아 ESTs 내에서 반복성을 조사하였는데, 200bp 이상 염기서열을 분석한 ESTs에 대해 일치도를 비교하여 70% 이상 100% 이하의 일치도를 보이는 경우에 동일한 EST로 판단하였으며(Hays et al.
혼성화 반응 결과 30개의 약 특이 발현 유전자는 다른 기관에서는 전혀 발현되지 않았고 ALAa27 등 26개의 유전자는 약과, 만개한 꽃의 약으로부터 추출한 화분에서 발현을 하였으며 ALAa9, ALAa86, ALAa608, ALAb846은 약에서만 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 기관별 RNA 혼성화 반응 결과 약에서만 발현을 보인 4개의 유전자는 약의 기관 내(sporophytic tissue)에서, 나머지 28개는 약과 화분에서 둘 다 발현하는 유전자로 추정되었다.
기능을 추정한 약 발현 ESTs 중 백합에서 발현되는 유전자와 유사한 것으로 확인된 클론만 모아서 정리해 본 결과 (Table 2), 가장 많이 확인된 유전자는 PMEI(pectin methyl esterase inhibitors)로서 총 20개의 ESTs 클론이 확인되었다. 그 다음으로는 LTP(lipid transfer protein)로서 12개의 클론이, 나머지는 약에서 기존에 보고된 효소류들(exo-betaglucanase, polygalacturinase, endo-1,4-beta glucanase) 등이 보고되었다.
4). 발달별 발현양상은 ALAa27 등(ALAa 87, 779, 930, ALAb424, 425, 494, 505, 796, 865) 10개의 유전자가 9cm부터 개화 시까지 지속적으로 발현이 증가하였으며 ALAa195 등(ALAa328, 333, 354, 397, 442, ALAb164, 315, 440, 491, 837, 920)은 9cm까지는 거의 발현하지 않다가 11cm 발달 단계에서 발현이 시작되어서 개약까지 유지되는 유전자로 확인되었다. Mousavi et al.
발달별 RNA 발현에서 주로 9-11cm 꽃봉오리에서 발현이 시작되어서 발현량이 늘거나 감소하는 클론이 다수였는데 이들은 주로 약의 일부 조직들이 퇴화하면서 화분생성 및 발달에 집중하는 시기에 관련한 유전자일 것으로 추정된다. 본 실험에서는 약에서 발현되는 ESTs 클론을 랜덤하게 선택하여 differential slot blot을 이용하여 약에서 주로 발현되는 유전자를 선발한 다음 일차적으로 BLASTX 분석을 통해서, 이차적으로는 30개의 클론을 이용해서 RNA 발현까지 조사해 본 결과 Padmanabhan and Sahi(2011)의 사례처럼 다수의 유전자로부터 일부 조직이나 시그널 특이발현 유전자를 선별하는데 매우 효과적인 접근인 것으로 생각된다.
(1991)이 인간의 뇌로부터 만들어진 cDNA library에서 무작위로 선택된 609개의 cDNA를 ESTs로 명명하면서 시작되었다. 이후 database에 모아진 ESTs의 수는 급격하게 증가하여 1995년 중반에 이미 GenBank에 등록된 ESTs의 수가 일반 유전자의 수를 넘어섰고 2000년 6월에는 GenBank database의 62%를 차지하는 4천6백만 개가 ESTs인 것으로 확인되었다. 일반적으로 cDNA library로부터 생성된 ESTs 는 타켓으로 하는 기관의 모든 유전자를 표현할 수 있는 것으로 알려져 있다.
Molecular function 카테고리에서는 주로 protein binding이나 transferase activity 관련 효소들이 발현되었다. 특히 cellular component category의 경우 cell과 cell part 관련 유전자들에 집중적으로 분포하고 있는데 GenBank를 통해 확인한 결과에서도 화분에 관련된 유전자들이 다수 확인된 사실과 카테고리 분류결과를 연결해서 볼 때 본 실험에서 선발한 약 발현 유전자들이 약의 발달단계상 가장 급격하게 세포성장이나 구성이 필요한 시점인 화분관 신장이나 화분 발아에 관련한 유전자일 것으로 추정할 수 있었다
3). 혼성화 반응 결과 30개의 약 특이 발현 유전자는 다른 기관에서는 전혀 발현되지 않았고 ALAa27 등 26개의 유전자는 약과, 만개한 꽃의 약으로부터 추출한 화분에서 발현을 하였으며 ALAa9, ALAa86, ALAa608, ALAb846은 약에서만 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 기관별 RNA 혼성화 반응 결과 약에서만 발현을 보인 4개의 유전자는 약의 기관 내(sporophytic tissue)에서, 나머지 28개는 약과 화분에서 둘 다 발현하는 유전자로 추정되었다.

후속연구

본 연구에서는 나리 약에서 발현되는 유전자의 cDNA library를 differential slot blot 방법을 통해 약에서 주로 발현되는 ESTs 클론을 모아 유전정보를 수집하고 이 중 약에서만 발현되는 유전자를 찾아 이에 대한 특성을 구명하고자 하였다. 본 실험 결과로 얻어진 ESTs는 게놈 크기가 큰 작물의 게놈 연구를 위한 기초 자료가 될 수 있으며 또한 향후 유전육종 시 나리의 형질개량(개약, 내병성, 화색 등)을 위한 기초적인 자료를 마련하는 계기가 될 것으로 보인다.
7개의 다른 기관과 발달 단계에서 전사체 분석은 약특이적일 적으로 추정되는 30개의 클론을 가지고 노던혼성화반응을 이용하여 수행하였다. 이러한 결과는 differential slot blot을 이용하여 약에 발현되는 유전자를 선별하는 것이 매우 효과적인 방법인 것으로 간주되며 또한 지금의 연구가 앞으로 나리의 화분을 포함한 약에 대한 기초정보를 제공할 수 있을 것으로 생각한다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	ESTs란 무엇인가?	ESTs(expressed sequencing tags)는 대량 염기서열 분석 기법을 기반으로 하여 동･식물에서 발현되는 유전자의 정보를 수집해 목록을 작성하는 작업으로 1991년에 Adams et al.(1991)이 인간의 뇌로부터 만들어진 cDNA library에서 무작위로 선택된 609개의 cDNA를 ESTs로 명명하면서 시작되었다.
	개화식물에서 약이란 무엇인가?	약은 개화식물에서 웅성생식을 담당하는 기관으로서 약의 형태를 만들면서 약 내에서 화분을 생성하는 매우 복합적으로 이루어지는 생화학적 과정이라고 할 수 있다. 약의 형태가 만들어질 때 약은 각각의 약주머니 안에서 감수분열 세포를 만들면서 안쪽에서 바깥으로 epidermis, endothecium, middle layer, tapetum의 조직을 만들어 약의 모양을 이루게 된다(Zhang et al.
	개화식물의 웅성생식을 담당하는 기관인 약은 어떻게 발달하는가?	약은 개화식물에서 웅성생식을 담당하는 기관으로서 약의 형태를 만들면서 약 내에서 화분을 생성하는 매우 복합적으로 이루어지는 생화학적 과정이라고 할 수 있다. 약의 형태가 만들어질 때 약은 각각의 약주머니 안에서 감수분열 세포를 만들면서 안쪽에서 바깥으로 epidermis, endothecium, middle layer, tapetum의 조직을 만들어 약의 모양을 이루게 된다(Zhang et al., 2010b).

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저자의 다른 논문 :

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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